Purification du compartiment membranaire pour dégradation associés au réticulum endoplasmique des antigènes exogènes dans présentation croisée

Summary

La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification des compartiments cellulaires où les antigènes exogènes sont traitées par dégradation associés au réticulum endoplasmique dans présentation croisée.

Abstract

Les cellules dendritiques (CD) sont très capables de traiter et de présenter des antigènes exogènes intériorisées lors de classe majeur d’histocompatibilité (MHC) j’ai également connu sous le nom de Croix-présentation des molécules (CP). CP joue un rôle important non seulement dans la stimulation de la naïve CD8⁺ T cellules et mémoire CD8⁺ T cells pour infectieuses et immunitaires de la tumeur mais aussi dans l’inactivation d’auto-protection cellules naïves T par l’anergie des lymphocytes T ou de la suppression de cellules T. Bien que le mécanisme moléculaire critique du CP reste à élucider, accumulant indiquent que les antigènes exogènes sont traitées par associés au réticulum endoplasmique dégradation (ERAD) après exportation de non-classique endocytose compartiments. Jusqu'à une date récente, la caractérisation de ces compartiments endocytose était limitée car il n’y a aucun marqueurs moléculaires spécifiques autres que les antigènes exogènes. La méthode décrite ici est un nouveau protocole d’isolement de la vésicule, qui permet pour la purification de ces compartiments endocytose. Utilisant cette microsome purifiée, nous avons reconstitué ERAD-comme transport, ubiquitination et traitement de l’antigène exogène in vitro, suggérant que le système ubiquitine-protéasome traitées l’antigène exogène après l’exportation de cette compartiment cellulaire. Ce protocole peut être appliqué également à d’autres types de cellules de clarifier le mécanisme moléculaire de CP.

Introduction

Le MHC I molécules sont exprimées à la surface de toutes les cellules nucléées, avec petits peptides antigéniques provenant des antigènes endogènes, qui sont traitées par le système ubiquitine-protéasome dans le cytosol¹. Après le traitement, les peptides antigéniques sont transportés dans la lumière du réticulum endoplasmique (re) par le transporteur de peptide TAP. Dans la lumière de l’ER, une série de chaperons spécifiques aident le chargement de peptide et le repliement correct de MHC I complexe. Cette série de molécules s’appelle le complexe de peptide-chargement (PLC), indiquant que l’ER est un compartiment central pour le peptide chargem....

Protocol

1. cellules de plus en plus et ajout d’antigènes exogènes

1. Prepare bOVA utilisant un étiquetage de biotine-protéine kit suivant le fabricant ' protocole de s.
   Remarque : Normalement, bOVA contient biotine 2 M par 1 M OVA enmoyenne.
2. Cellules DC2.4 croître en milieu RPMI-1640 additionné de 2 mM de L-glutamine, pyruvate de sodium 1 mM, acides aminés non essentiels de 0,1 mM, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 55 mM 2-mercaptoéthanol, 10 mM HEPES (pH 7.5) et sérum de veau foetal de 10 % (ci-après RPMI) à 37 ° C en 5 % De CO ₂ dans un incubateur humidifié (ci-après sans mention, les cellules sont incubées à cette condition). Il....

Results

Afin d’élucider les mécanismes moléculaires du CP, il est nécessaire d’identifier les compartiments cellulaires, où les antigènes exogènes subissent un transport ERAD-like et le traitement. Alors que les observations en microscopie par immunofluorescence ou par microscopie électronique identifié le compartiment cellulaire où les antigènes exogènes accumulent^{16,17,18,1.......}

Discussion

Dans les études précédentes du CP, les antigènes exogènes incorporés accumulent dans la zone réglementée de l’endosome tardif ou ER par microscopie par immunofluorescence^16,30,31,32. On estime que ERAD-comme transport et le traitement des antigènes exogènes sont effectués dans ces domaines spécialisés de l’ER ou retard endosome, le compartiment cellulaire a été identifié par le saccharose ou à .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco de life technologies	11875-093
Sérum de veau fœtal	Equitech bio	SFB30
Pyruvate de sodium	gibco de life technologies	11360-070
Acides aminés non essentiels MEM	gibco de life technologies	11140-050
HEPES	gibco de life technologies	15630-080
2-mercaptoéthanol	gibco de life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco de life technologies	25030-164
Pénisicilline-Sreptomycine	gibco de life technologies	15140-122
DMEM	gibco de life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
Biotine-protéine kit d’étiquetage	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
lactacystine	SIGMA	L6785
Dounce homogénéisateur	IUCHI	131703
cocktails inhibiteurs de protéase	SIGMA	P8340
iodixanol	Cosmo bio	1114542
Perles magnétiques SA	New England Biolabs	201270
perles magnétiques	de contrôle Chemagen	M-PVA012
support magnétique	BD Biosciences	552311
BCA kit de dosage des protéines	Thermo Fisher Scientific	23225
kits de coloration à l’argent	Cosmo bio	423413
Lysat de réticulocytes	Promega
Flag-tagged ubiquitine	SIGMA	U5382
anti-ovalbumine (OVA,souris)	Magasin d’anticorps	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitine (souris)	MBL	D058&minus ;
anti-Flag (souris)	SIGMA	F3165
trypsine	SIGMA	85450C