Détermination de l&#39;expression de la surface cellulaire et du taux endocytique des protéines dans les cultures d&#39;astritcy primaires utilisant la biotinylation

Daniel Kai Long Tham; Hakima Moukhles

doi:10.3791/55974

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Article de méthode

Détermination de l'expression de la surface cellulaire et du taux endocytique des protéines dans les cultures d'astritcy primaires utilisant la biotinylation

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DOI :

10.3791/55974

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3 juillet 2017

Daniel Kai Long Tham¹ , Hakima Moukhles¹

¹Department of Cellular and Physiological Sciences, University of British Columbia

Dans cet article

Résumé

Deux méthodes basées sur la biotinylation, conçues pour déterminer l'expression de la surface cellulaire et la vitesse endocytaire des protéines exprimées à la membrane plasmatique, sont présentées dans ce rapport.

Résumé

Les protéines de surface cellulaire font appel à un large éventail de fonctions. Dans de nombreux cas, leur activité est régulée par des processus endocytaires qui modulent leurs niveaux à la membrane plasmique. Ici, nous présentons des protocoles détaillés pour 2 méthodes qui facilitent l'étude de tels procédés, tous deux basés sur le principe de la biotinylation des protéines de surface cellulaire. Le premier est conçu pour permettre la détermination semi-quantitative des niveaux relatifs d'une protéine particulière à la surface de la cellule. Dans celui-ci, les résidus de lysine des protéines de la membrane plasmique des cellules sont d'abord marqués avec un fragment de biotine. Une fois que les cellules sont lysées, ces protéines peuvent ensuite être précipitées spécifiquement par l'utilisation de streptavidine immobilisée par agarose en exploitant l'affinité naturelle de cette dernière pour la biotine. Les protéines isolées de cette manière peuvent ensuite être analysées par une méthode standard de Western Blot. La deuxième méthode fournit un moyen de déterminer le taux endocytique d'une particuleAr cellule cible sur une période de temps. Les protéines de surface cellulaire sont d'abord modifiées avec un dérivé de biotine contenant une liaison dissulfure clivable. Les cellules sont ensuite décalées vers des conditions de culture normales, ce qui provoque l'absorption endocytaire d'une proportion de protéines biotinylées. Ensuite, les liaisons disulfure de groupes de biotine non internalisés sont réduites en utilisant l'agent réducteur imperméable à la membrane, le glutathion. Grâce à cette approche, les protéines endocytesées peuvent donc être isolées et quantifiées avec un haut degré de spécificité.

Introduction

Les protéines à la surface de la cellule jouent une variété de rôles essentiels au maintien de la fonction cellulaire. Dans de nombreux cas, leur activité dépend ou est modulée par des processus endocytaires qui les séquestrent temporairement dans des sites intracellulaires ou qui les dirigent vers des voies de dégradation ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . Ici, nous mettons en évidence 2 approches basées sur la biotinylation conçues pour permettre à l'utilisateur d'étiqueter et d'isoler spécifiquement les pr....