Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l&#39;aide de l&#39;hybridation en gel

Frank J. Jenkins; Charles M. Kerr; Elise Fouquerel; Dana H. Bovbjerg; Patricia L. Opresko

doi:10.3791/56001

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Article de méthode

Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l'aide de l'hybridation en gel

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DOI :

10.3791/56001

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10 juillet 2017

Frank J. Jenkins¹^,² , Charles M. Kerr² , Elise Fouquerel²^,³ , Dana H. Bovbjerg²^,⁴ , Patricia L. Opresko²^,³

¹Departments of Pathology and Infectious Diseases and Microbiology, University of Pittsburgh, ²University of Pittsburgh Cancer Institute, ³Department of Environmental and Occupational Health, University of Pittsburgh, ⁴Departments of Psychiatry, Psychology, Behavioral & Community Health Sciences, University of Pittsburgh

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, un protocole détaillé pour quantifier la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée est discuté qui fournit une mesure directe rapide et efficace de la longueur des télomères. Cette technique peut être appliquée à une variété de sources cellulaires d'ADN pour quantifier la longueur des télomères.

Résumé

Il existe plusieurs techniques différentes pour mesurer la longueur des télomères, chacune avec leurs propres avantages et inconvénients. L'approche traditionnelle, l'analyse du fragment de restriction Telomere (TRF), utilise une technique d'hybridation d'ADN dans laquelle les échantillons d'ADN génomique sont digérés avec des enzymes de restriction, laissant derrière eux des répétitions d'ADN de télomères et un certain ADN sous-télomérique. Ceux-ci sont séparés par une électrophorèse sur gel d'agarose, transférés dans une membrane filtrante et hybridés à des sondes oligonucléotidiques marquées avec chimioluminescence ou radioactivité pour visualiser des fragments de restriction telomère. Cette approche, tout en nécessitant une plus grande quantité d'ADN que d'autres techniques telles que la PCR, peut mesurer la répartition de la longueur des télomères d'une population de cellules et permet une mesure exprimée en kilobases absolues. Ce manuscrit démontre une procédure d'hybridation d'ADN modifiée pour déterminer la longueur des télomères. L'ADN génomique est d'abord digéré avec des enzymes de restriction (qui ne coupent pasTélomères) et séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Le gel est ensuite séché et l'ADN est dénaturé et hybride in situ à une sonde oligonucléotidique radiomarquée. Cette hybridation in situ évite la perte d'ADN des télomères et améliore l'intensité du signal. Après l'hybridation, les gels sont imagés à l'aide d'écrans phosphores et la longueur des télomères est quantifiée à l'aide d'un programme graphique. Cette procédure a été développée par les laboratoires des Drs. Woodring Wright et Jerry Shay à l'Université du Texas Southwestern ¹ ^, ² . Ici, nous présentons une description détaillée de cette procédure, avec quelques modifications.

Introduction

Les télomères, situés aux extrémités des chromosomes, sont des répétitions nucléotidiques de la séquence TTAGGG (sur les chromosomes humains) qui jouent un rôle essentiel dans la protection de l'information génétique cellulaire ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . Les télomères ont plusieurs milliers de paires de bases et servent à protéger l'intégrité du reste du chromosome pendant la réplication de l'ADN. La réplication des chromosomes n'est pas parfaite, de sorte que les extrémités du chromosome ne sont pas complètement copiées. Cette inefficacité dans la réplication est appelée «....