Article de méthode

Une méthode à base de filtration pour la préparation de noyaux de haute qualité à partir d'un muscle squelettique réticulé pour l'immunoprécipitation de la chromatine

DOI :

10.3791/56013

⸱

6 juillet 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Health Science Center at Houston

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons un protocole basé sur la filtration pour isoler des noyaux de haute qualité à partir du muscle squelettique de souris réticulé dans lequel nous avons supprimé le besoin d'ultracentrifugation, ce qui le rend facilement applicable. Nous montrons que la chromatine préparée à partir des noyaux est appropriée pour l'immunoprécipitation de la chromatine et les études probables de séquençage de l'immunoprécipitation de la chromatine.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode puissante pour déterminer la liaison des protéines à l'ADN de la chromatine. Le muscle squelettique riche en fibres a toutefois été un défi pour le ChIP en raison de difficultés techniques en isolement de noyaux de haute qualité avec une contamination minimale des myofibrilles. Les protocoles antérieurs ont tenté de purifier les noyaux avant la réticulation, ce qui entraîne une altération de l'interaction ADN-protéine pendant le processus de préparation des noyaux prolongés. Dans le protocole actuel, nous avons d'abord réticulé le tissu musculaire squelettique recueilli chez la souris et les tissus ont été hachés et sonicés. Comme nous avons constaté que l'ultracentrifugation n'était pas capable de séparer les noyaux des myofibrilles à l'aide d'un tissu musculaire réticulé, nous avons mis au point une procédure de filtration séquentielle pour obtenir des noyaux de haute qualité dépourvus de contamination significative par myofibrilles. Nous avons ensuite préparé la chromatine en utilisant un ultrasons, et les tests de ChIP avec anticorps anti-BMAL1 ont révélé une liaison circadienne robusteModèle de BMAL1 pour cibler les promoteurs de gènes. Ce protocole de filtration constitue une méthode facilement applicable pour isoler des noyaux de haute qualité à partir d'un tissu musculaire squelettique réticulé, ce qui permet un traitement cohérent des échantillons pour les études circadiennes et autres études sensibles au temps. En combinaison avec le séquençage de la prochaine génération (NGS), notre méthode peut être déployée pour diverses études mécaniques et génomiques axées sur la fonction du muscle squelettique.

Introduction

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Le muscle squelettique joue un rôle important dans la physiologie et le comportement. La fibre musculaire multi-nucléée se compose de myofibrilles où l'actine et la myosine forment des unités fonctionnelles appelées sarcomères pour générer une force contractile. Le muscle squelettique est également le plus grand organe métabolique du corps, ce qui représente> 80% d'apport de glucose postprandial et de régulation de la réponse à l'insuline et de l'homéostasie métabolique 1 , 2 . La physiologie musculaire et le métabolisme sont étroitement réglementés par l'horloge circadienne, une minuterie biologique intrinsèque 3 , 4 , 5 , 6 . Par exemple, la suppression spécifique du muscle squelettique de Bmal1 , l'un des composants de l'horloge circadienne centrale, a entraîné une résistance à l'insuline et une diminution de l'absorption du glucose dans le muscle squelettique, et on a constaté que les animaux développaient un diabète de type 2 7 . jeEn outre, le muscle squelettique est de plus en plus apprécié en tant qu'organe endocrinien 8 , sécrétant les myokines pour réguler le métabolisme systémique et la physiologie. Des études mécanistiques sont nécessaires pour bien comprendre ces fonctions réglementaires dans le muscle squelettique.

ChIP est une approche puissante pour délimiter le recrutement par le promoteur de protéines de liaison à l'ADN. ChIP a d'abord été développé pour identifier l'organisation des nucléosomes sur l'ADN de la chromatine 9 , 10 . Depuis, on a signalé que diverses méthodes ont réticulé les protéines et l'ADN de la chromatine en utilisant du formaldéhyde, du sulfate de diméthyle ou de l'irradiation ultraviolette (UV) 11 , 12 . La réticulation du formaldehyde est la structure la plus utilisée, la structure de la chromatine et les interactions ADN-protéine 9 , 13 , 14 . Chromatographie réticuléeIn est déchiqueté par sonication et immunoprécipité avec un anticorps contre la protéine de liaison d'ADN spécifique 15 , 16 . Au cours des dernières années, le séquençage par ChIP (ChIP-seq), une méthode combinant ChIP avec NGS, a été développé pour interroger le facteur de transcription du génome à l'échelle du 17 et, dans certains cas, pour surveiller les changements dynamiques au cours d'un cours 18 , 19 , 20 . Par exemple, les études circadiennes ChIP-seq ont révélé une séquence hautement orchestrée de liaison génomique des composants de l'horloge circadienne et des marqueurs d'histones, ce qui entraîne une expression du gène temporellement précise tout au long du cycle circadien de 24 heures 18 .

La plupart des protocoles ChIP disponibles sont conçus pour les tissus mous ( par exemple, le foie, le cerveau, etc. ) et très peu ont été publiés pour les tissus durs, y compris le squeletteMuscle. Il est techniquement difficile d'homogénéiser le muscle squelettique riche en fibres et d'isoler les noyaux de haute qualité 21 , en particulier pour les expériences ChIP qui nécessitent une réticulation. Dans une récente étude sur le muscle ChIP 22 , les cellules satellites ont été séparées des myofibres et des noyaux ont été préparés à partir des deux types de cellules par une procédure prolongée impliquant une digestion des tissus. L'ensemble du processus a duré environ trois heures avant de procéder à la réticulation du formaldéhyde sur des noyaux isolés. Bien que cette procédure ait évité de reticuler la fibre musculaire, ce qui rend le tissu musculaire encore plus réfractaire à une homogénéisation efficace et a pu produire des noyaux de haute qualité, le retard important de la collecte des tissus à la réticulation des noyaux entraîne le risque d'ADN altéré -interaction des protéines. En revanche, la plupart des études ont réalisé une réticulation immédiatement après un traitement expérimental ou une collecte de tissu afin de préserver l'ADN-protéi en temps réelN liaison 12 . Un deuxième inconvénient de l'isolement des noyaux avant la réticulation est qu'il empêche les applications sensibles au temps telles que la collecte d'échantillon circadien qui se produit habituellement à des intervalles de 3 à 4 h. Sans reticuler les noyaux, l'isolement doit se dérouler immédiatement après la dissection, alors que les échantillons réticulés peuvent être traités ensemble après la fin du cours, ce qui garantit une plus grande cohérence expérimentale.

D'autres protocoles pour l'isolement des noyaux à partir de muscle squelettique non réticulé ont également été rapportés. Deux études ont décrit l'utilisation de l'ultracentrifugation en gradient pour séparer les noyaux des myofibrilles restantes et des débris cellulaires 23 , 24 . Alors que le sucrose ou l'ultracentrifugation en gradient colloïdal est efficace avec les tissus musculaires non réticulés, nos expériences ont révélé qu'après la réticulation, l'ultracentrifugation en gradient n'a pas réussi à séparer les noyaux de la cellule dEbris sur le dégradé.

Nous avons donc développé une procédure pour isoler des noyaux de haute qualité en utilisant des tissus de muscle squelettique de souris réticulés. Plutôt que de l'ultracentrifugation en gradient, nous avons conçu une méthode de filtration en série pour séparer efficacement les noyaux des débris. À la suite de l'échographie, les échantillons de chromatine ont été appliqués avec succès pour des études de ChIP qui ont montré un schéma circadien de liaison de la protéine BMAL1 aux promoteurs cibles. Notre méthode peut être largement applicable à diverses études mécanistes des tissus musculaires.

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Protocole

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Les soins aux animaux ont été effectués dans le cadre des lignes directrices du Comité d'utilisation et d'utilisation des animaux institutionnels (IACUC), et les procédures ont été menées selon un protocole animal approuvé par le Centre de sciences de la santé de l'Université du Texas à Houston.

1. Isolation des noyaux à partir du muscle squelettique réticulé

  1. Pesez et mincez le muscle squelettique des membres postérieurs, isolé à partir de souris mâles C57BL / 6 d'environ 20 semaines, dans une solution salée tamponnée au phosphate glacée (PBS) comme décrit en détail précédemment 22 .
    NOTE: Nous obtenons habituellement 1,0 à 1,5 g de muscle squelettique d'une souris.
    1. Placer le tissu squelettique du muscle squeletté dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de PBS sur de la glace.
  2. Centrifuger à 300 xg à 4 ° C pendant 5 min.
  3. Enlever soigneusement le surnageant PBS par aspiration.
  4. Évaluer le volume des pastilles dans chaque tube de 50 ml en utilisant des tubes de référence avec 1, 2, 3 et 4 ml d'eau.
  5. Ajouter 7 volumes de1% de formaldéhyde glacé dans du PBS et homogénéiser les échantillons sur de la glace à l'aide d'un homogénéisateur de tissu de sonde (voir Tableau des matériaux ).
    REMARQUE: en option: la procédure d'homogénéisation peut être effectuée dans une chambre froide.
  6. Reticuler l'échantillon en incubant à température ambiante pendant 10 min.
  7. Réduire la réaction de réticulation par addition de 1 M de glycine à une concentration finale de 0,125 M et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
  8. Centrifuger les échantillons à 3 000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant par aspiration.
  9. Rincer avec 10 ml de tampon de base glacé (HEPES-KOH 10 mM à pH 7,3, EDTA 10 mM, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM) contenant des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés (fluorure de phénylméthylsulfonyle 0,2 mM (PMSF) , Et 10 ug / mL de leupeptine). Centrifuger à 3 000 g pendant 5 min à 4 ° C et retirer soigneusement le surnageant par aspiration.
  10. Remettre en suspension le culot dans 6 ml de tampon de lyse (HEPES-KOH 10 mM à pH 7,3, 10 mM d'EDTA, 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 0,5 mM de DTT, 1% de Triton X-100) contenant des inhibiteurs de protéase fraîchement ajoutés (PMSF 0,2 mM et 10 ug / mL de leupeptine).
  11. Transférer l'échantillon à un homogénéisateur Dounce préchauffé de 15 ml et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. Dénuder homogénéiser chaque échantillon sur de la glace avec 15 coups lents en utilisant un pilon lâche suivi de 15 coups avec un pilon serré pour libérer les noyaux.
  12. Filtrer l'homogénat (6 mL) par filtre cellulaire (taille des pores: 100 μm) et rincer avec 4 mL de tampon de lyse. Centrifuger les échantillons à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans 5 mL de tampon de base glacé et dancer 10 fois avec un pilon serré pour libérer des noyaux.
    1. Supprimez une aliquote de 20 μL pour la mesure de la concentration d'ADN avec un spectrophotomètre (OD260 / OD280) et une observation microscopique avec du bleu de trypan si nécessaire (voir ci-dessous) ( Figure 1 A ).
  13. Filtrer la suspension à traversUn filtre cellulaire (taille du pore: 70 μm), rincer le tube et filtrer à nouveau avec 2 ml de tampon de base comme ci-dessus.
  14. Répétez la filtration comme à l'étape 1.13 avec des tamis cellulaires de taille de pores progressivement réduite (40 μm, 30 μm, 20 μm et 10 μm).
    NOTE: Au total, des tamis de 6 tailles de pores ont été utilisés aux étapes 1.12-1.14.
  15. Centrifuger à 1000 g à 4 ° C pendant 10 min. Retirer le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 500 μL de tampon de base.
  16. Mesurez la concentration d'ADN comme ci-dessus.
    NOTE: Environ 200 μg d'ADN nucléique ont été obtenus en combinant les deux membres postérieurs d'un animal. En option, économisez 20 μL pour une observation microscopique avec une coloration au bleu trypan (concentration de stock 0,4%, dilution 1: 5); Les noyaux verront le bleu ( Figure 1 B ).
  17. Centrifuger à 1000 g à 4 ° C pendant 10 min, et jeter le surnageant. Gain de magasin à -80 ° C.

2. Sonication

  1. Décongeler les échantillons dans 500 μL de tampon de lyse SDS et remettre en suspension avec un pipetage doux.
  2. Transférer la suspension d'ADN nucléique dans un flacon en verre sur glace.
  3. Exécutez la sonication avec des rafales ciblées d'énergie acoustique ultrasonique à partir d'un transducteur en forme de plat. Voir la Table des matériaux pour les détails de l'équipement. Utilisez le réglage suivant: cycles par éclatement: 200; Intensité: 5; Cycle de service: 20; Température 4 - 6 ° C; 30 s marche / arrêt.
    REMARQUE: Un exemple pour évaluer l'efficacité de la sonication est illustré à la figure 2 .
  4. Transférer la chromatine sonicée à un tube de 1,5 ml. Centrifugez à 12 000 xg pendant 15 minutes et transférez le surnageant à un nouveau tube. Transférer 50 μL d'échantillons sonés (~ 7-10 μg / échantillon musculaire) dans un nouveau tube de 1,5 ml pour la réticulation inverse pendant une nuit à 65 ° C. Geler les échantillons restants à -80 ° C.

3. Évaluation de la sonication et de la quantification

  1. Ajouter 1.0ΜL de RNase A (500 U / mL RNase A: 20 000 U / mL RNase T1) sur les échantillons soignés de 50 μL et incubés pendant 30 min à 37 ° C.
  2. Ajouter 8 μL de protéase K (10 mg / mL) et incuber 30 min à 55 ° C.
  3. Récoltez l'ADN en utilisant un kit d'extraction d'ADN.
    1. Ajouter 5 volumes de tampon de liaison, l'appliquer à la colonne de spin et centrifuger à 4000 xg, 10 min.
    2. Appliquer le passage sur la même colonne et centrifuger à nouveau.
    3. Laver avec un tampon de lavage deux fois à 13 000 xg, 1 min.
    4. Centrifuger à nouveau à 13 000 xg, 1 min pour sécher la colonne.
    5. Ajouter 50 μL de H 2 O et centrifuger à 13 000 xg, 1 min pour éluer l'ADN.
    6. Appliquer le passage sur la même colonne et centrifuger à nouveau.
  4. Quantifier la quantité d'ADN avec un spectrophotomètre (OD260 / OD280). Exécutez des échantillons sur 0,8% de gels pour évaluer la taille et la quantité (1 μg) des produits sonés ( figure 2 ).
    NOTE: Le rendement moyen de la chromatine est d'environ ~ 20%.

4. ChIP

  1. Décongeler la chromatine précédemment enregistrée à -80 ° C et allumer la chromatine à ~ 100 à 120 μg par tube. Diluer 1:10 avec un tampon de dosage de radioimmunoprécipitation (RIPA) (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 1 mM, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM, Cocktail inhibiteur de protéase 1x (PIC), 0,1% de Na-désoxycholate ( W / v), 1% Triton X-100).
    1. S'il y a plusieurs échantillons dans chaque groupe, combiner des quantités égales d'ADN de chromatine à la quantité finale de ~ 100 à 120 μg / échantillon. Économisez 10% comme contribution.
  2. Ajouter 40 μL (bouillie 50% v / v dans le tampon RIPA) d'agarose à base de protéine A / G pré-bloquée (~ 2 h, 4 ° C) pré-bloquée (2 h, 4 ° C) (anticorps anti-poulet) ou IgY (anticorps anti-poulet) et incuber sur Un rotateur pendant 3 h à 4 ° C.
  3. Centrifuger à 1000 xg, 10 min et transférer soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes.
  4. Ajouter des anticorps à 1 μg d'anticorps par ~25 - 100 μg d'ADN de chromatine.
  5. Tourner doucement à 4 ° C pendant une nuit à environ 15 tr / min.
  6. Ajouter 10 μL de protéines A / G agarassées (~ 2 h, 4 ° C) pré-bloquées (~ 2 h, 4 ° C) ou IgY (anticorrosion contre le poulet) et faire tourner dans la chambre froide pendant 2 h.
  7. Laver les perles comme suit. Laver avec 1 mL de tampon RIPA pendant 3 minutes deux fois, laver avec 1 ml de tampon salé élevé (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Triton X-100 à 1%) pendant 3 min deux fois , Laver avec 1 ml de tampon LiCl (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), LiCl 250 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Na-désoxycholate 1%, NP40 à 0,5%) pendant 3 minutes deux fois.
    1. Laver avec 1 ml de tampon Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) pendant 3 min une fois. Ensuite élucient de l'ADN avec un tampon d'élution (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM et SDS à 0,5%).
  8. Centrifuger à 1000 g, 1 min et retirer soigneusement le surnageant.
  9. Remettre en suspension le cordon avec 50 μl de tampon d'élution.
  10. Incuber pour 10Min à 65 ° C.
  11. Centrifugez à 12 000 g pendant 5 min.
  12. Transférer le surnageant dans un nouveau tube, ajouter encore 50 μL et centrifuger encore une fois à 12 000 g pendant 5 min. Le volume final d'élution sera de 100 μL.
  13. Réticulation inverse et élution d'ADN.
    1. Incuber la chromatine éluée pendant une nuit à 65 ° C.
    2. Ajouter 1,0 μL de RNase A et incuber pendant 30 minutes à 37 ° C.
    3. Ajouter 8 μL de protéase K (10 mg / mL) et incuber 30 min à 55 ° C.
    4. Récoltez l'ADN en utilisant un kit de nettoyage par PCR avec un volume d'élution à 50 μL selon le protocole du fabricant.
  14. Analyser les profils par qPCR en temps réel comme décrit précédemment 25 , 26 .
    REMARQUE: Les séquences d'amorces sont listées dans la Figure 3 Légende . Les données sont présentées comme moyen ± SEM ( Figure 3 ).

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Résultats

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Ici, nous avons effectué une réticulation au formaldéhyde immédiatement après la collecte des tissus pour préserver l'interaction ADN-protéine en temps réel. Cependant, nous avons constaté que le saccharose ou le gradient colloïdal, couramment utilisé pour l'isolement des noyaux 23 , 24 , n'était pas efficace pour séparer les noyaux des myofibrilles (données non présentées). La raison en est que cette réticulation confère une gra...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici une méthode robuste où les tissus de muscles squelettiques réticulés ont été utilisés pour isoler des noyaux de haute qualité. La filtration séquentielle a été effectuée pour séparer efficacement les noyaux des débris et l'énergie acoustique ultrasonore du transducteur en forme de plat a percé la chromatine pour l'analyse de ChIP. Les résultats ont montré une liaison circadienne spécifique au temps de BMAL1 aux promoteurs cibles.

ChIP peut être utilisé pour capture...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Karyn Esser, Nobuya Koike et Noheon Park pour des conseils utiles. Ce travail a été partiellement soutenu par NIH / NIGMS (R01GM114424) à S.-HY, et la Fondation Robert A. Welch (AU-1731) et NIH / NIA (R01AG045828) à ZC

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
fortFormaldéhydesolution Sigma AldrichF8775  ;
GlycineFisher ScientificBP381-5
Trypan Blue solution (0,4 %)Fisher Scientific15250061
RNase ASigma Aldrich10109142001
Protéase KSigma Aldrich3115887001
Poulet Anticorpsanti-BMAL1Généré dans le poulet (Cocalico Biologicals) contre l’antigène aa 318 - 579, et les IgY ont été purifiés par affinité à l’aide du même antigène.
Résine de précipitation IgY de pouletGenScriptL00405
Equipment
KINEMATICA  ; Polytron PT2100 Homogénéisateur de paillasseFisher Scientific08-451-178
15 mL Broyeur de mouchoirs à papierWhearton357544
Falcon Cell Strainers 100 µ ; mFisher Scientific08-771-19
Falcon Cell Strainers 70 & micro ; mFisher Scientific08-771-1
Falcon Cell Strainers 40 & micro ; mFisher Scientific08-771-2
pluriStrainer 30 & micro ; mPluriSelect43-50030-03
pluriStrainer 20 µ ; mPluriSelect43-50020-03
pluriStrainer 10 µ ; mPluriSelect43-50010-03
Covaris S2 Focaled-ultrasonicatorCovarisModel S2
Labquake  ;Thermo ScientificC415110
Caméra de microscope CCD’�nbsp ; Leica MicrosystemsDFC3000 G
Reagent Kit
DNA extractionkit Thermo ScientificK0691
Buffers
Tous les composants du tampon sont décrits dans le protocole. Chaque composant a été acheté auprès de Sigma Aldrich
Matériaux/

Références

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