Une méthode à base de filtration pour la préparation de noyaux de haute qualité à partir d'un muscle squelettique réticulé pour l'immunoprécipitation de la chromatine

Résumé

Nous présentons un protocole basé sur la filtration pour isoler des noyaux de haute qualité à partir du muscle squelettique de souris réticulé dans lequel nous avons supprimé le besoin d'ultracentrifugation, ce qui le rend facilement applicable. Nous montrons que la chromatine préparée à partir des noyaux est appropriée pour l'immunoprécipitation de la chromatine et les études probables de séquençage de l'immunoprécipitation de la chromatine.

Résumé

L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode puissante pour déterminer la liaison des protéines à l'ADN de la chromatine. Le muscle squelettique riche en fibres a toutefois été un défi pour le ChIP en raison de difficultés techniques en isolement de noyaux de haute qualité avec une contamination minimale des myofibrilles. Les protocoles antérieurs ont tenté de purifier les noyaux avant la réticulation, ce qui entraîne une altération de l'interaction ADN-protéine pendant le processus de préparation des noyaux prolongés. Dans le protocole actuel, nous avons d'abord réticulé le tissu musculaire squelettique recueilli chez la souris et les tissus ont été hachés et sonicés. Comme nous avons constaté que l'ultracentrifugation n'était pas capable de séparer les noyaux des myofibrilles à l'aide d'un tissu musculaire réticulé, nous avons mis au point une procédure de filtration séquentielle pour obtenir des noyaux de haute qualité dépourvus de contamination significative par myofibrilles. Nous avons ensuite préparé la chromatine en utilisant un ultrasons, et les tests de ChIP avec anticorps anti-BMAL1 ont révélé une liaison circadienne robusteModèle de BMAL1 pour cibler les promoteurs de gènes. Ce protocole de filtration constitue une méthode facilement applicable pour isoler des noyaux de haute qualité à partir d'un tissu musculaire squelettique réticulé, ce qui permet un traitement cohérent des échantillons pour les études circadiennes et autres études sensibles au temps. En combinaison avec le séquençage de la prochaine génération (NGS), notre méthode peut être déployée pour diverses études mécaniques et génomiques axées sur la fonction du muscle squelettique.

Introduction

Le muscle squelettique joue un rôle important dans la physiologie et le comportement. La fibre musculaire multi-nucléée se compose de myofibrilles où l'actine et la myosine forment des unités fonctionnelles appelées sarcomères pour générer une force contractile. Le muscle squelettique est également le plus grand organe métabolique du corps, ce qui représente> 80% d'apport de glucose postprandial et de régulation de la réponse à l'insuline et de l'homéostasie métabolique ^{1 , 2} . La physiologie musculaire et le métabolisme sont étroitement réglementés par l'horloge circadienne, une minuterie....

Protocole

Les soins aux animaux ont été effectués dans le cadre des lignes directrices du Comité d'utilisation et d'utilisation des animaux institutionnels (IACUC), et les procédures ont été menées selon un protocole animal approuvé par le Centre de sciences de la santé de l'Université du Texas à Houston.

1. Isolation des noyaux à partir du muscle squelettique réticulé

1. Pesez et mincez le muscle squelettique des membres postérieurs, isolé à partir de souris mâles C57BL / 6 d'environ 20 semaines, dans une solution salée tamponnée au phosphate glacée (PBS) comme décrit en détail précédemment ²² .

Résultats

Ici, nous avons effectué une réticulation au formaldéhyde immédiatement après la collecte des tissus pour préserver l'interaction ADN-protéine en temps réel. Cependant, nous avons constaté que le saccharose ou le gradient colloïdal, couramment utilisé pour l'isolement des noyaux ^{23 , 24} , n'était pas efficace pour séparer les noyaux des myofibrilles (données non présentées). La raison en est que cette réticulation con.......

Discussion

Nous décrivons ici une méthode robuste où les tissus de muscles squelettiques réticulés ont été utilisés pour isoler des noyaux de haute qualité. La filtration séquentielle a été effectuée pour séparer efficacement les noyaux des débris et l'énergie acoustique ultrasonore du transducteur en forme de plat a percé la chromatine pour l'analyse de ChIP. Les résultats ont montré une liaison circadienne spécifique au temps de BMAL1 aux promoteurs cibles.

ChIP peut être utilisé pour capture.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
fortFormaldéhyde	solution Sigma Aldrich	F8775  ;
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Trypan Blue solution (0,4 %)	Fisher Scientific	15250061
RNase A	Sigma Aldrich	10109142001
Protéase K	Sigma Aldrich	3115887001
Poulet Anticorps			anti-BMAL1Généré dans le poulet (Cocalico Biologicals) contre l’antigène aa 318 - 579, et les IgY ont été purifiés par affinité à l’aide du même antigène.
Résine de précipitation IgY de poulet	GenScript	L00405
Equipment
KINEMATICA  ; Polytron PT2100 Homogénéisateur de paillasse	Fisher Scientific	08-451-178
15 mL Broyeur de mouchoirs à papier	Whearton	357544
Falcon Cell Strainers 100 µ ; m	Fisher Scientific	08-771-19
Falcon Cell Strainers 70 & micro ; m	Fisher Scientific	08-771-1
Falcon Cell Strainers 40 & micro ; m	Fisher Scientific	08-771-2
pluriStrainer 30 & micro ; m	PluriSelect	43-50030-03
pluriStrainer 20 µ ; m	PluriSelect	43-50020-03
pluriStrainer 10 µ ; m	PluriSelect	43-50010-03
Covaris S2 Focaled-ultrasonicator	Covaris	Model S2
Labquake  ;	Thermo Scientific	C415110
Caméra de microscope CCD	’�nbsp ; Leica Microsystems	DFC3000 G
Reagent Kit
DNA extraction	kit Thermo Scientific	K0691
Buffers
Tous les composants du tampon sont décrits dans le protocole. Chaque composant a été acheté auprès de Sigma Aldrich

Matériaux/