Par électrochocs saisies chez le rat et le fractionnement de leur hippocampe pour examiner la saisie-induced Changes in densité postsynaptique protéines

Résumé

Saisie par électrochocs (ECS) est un modèle animal expérimental de la thérapie par électrochocs pour dépression sévère. ECS dans le monde stimule l’activité dans l’hippocampe, conduisant à la synaptogénèse et la plasticité synaptique. Nous décrivons ici les méthodes pour l’induction de ECS chez les rats et pour fractionnement subcellulaire de leur hippocampe pour examiner les changements induits par saisie en protéines synaptiques.

Résumé

Saisie par électrochocs (ECS) est un modèle animal expérimental de la thérapie par électrochocs, le traitement le plus efficace pour la dépression sévère. ECS provoque des crises tonico-cloniques généralisées avec faible taux de mortalité et de la mort neuronale et est un modèle répandu aux médicaments anti-épileptiques écran. Nous décrivons ici une méthode d’induction de ECS dans lequel un courant 55-mA brève est livré pendant 0,5 s mâle rats poids via des électrodes clip oreille de 200-250 g. Cette stimulation bilatérale produite étape 4-5 crises cloniques qui a duré environ 10 s. Après la cessation des ECS aiguë ou chronique, la plupart des rats récupérés pour être distinguée sur le plan comportemental de simulacre de rats « aucune saisie ». Parce que ECS augmente globalement l’activité cérébrale, il a également servi à examiner des altérations liées à l’activité des protéines synaptiques et leurs effets sur la force synaptique en utilisant plusieurs méthodes. En particulier, fractionnement subcellulaire de la densité postsynaptique (PSD) en combinaison avec le Western Blot permet la détermination quantitative de l’abondance des protéines synaptiques à cette structure synaptique spécialisée. Contrairement à une méthode de fractionnement précédent nécessitant une grande quantité de rongeurs cerveaux, nous décrivons ici une méthode de fractionnement à petite échelle afin d’isoler le PSD de l’hippocampe du rat seul, sans la centrifugation en gradient de saccharose. En utilisant cette méthode, nous montrons que la fraction PSD isolée contienne des protéines de la membrane postsynaptique, notamment PSD95, GluN2B et GluA2. Marqueur présynaptique synaptophysine et tubuline α des protéines cytoplasmiques solubles ont été exclues de la fraction PSD, ce qui démontre la réussite de l’isolement PSD. En outre, ECS chronique a diminué l’expression de la GluN2B dans le PSD, indiquant que notre méthode de fractionnement PSD à petite échelle peut être appliqué afin de détecter les changements dans les protéines PSD hippocampe de rat seul après traitements génétiques, pharmacologiques ou mécaniques .

Introduction

La thérapie par électrochocs a été utilisée pour traiter les patients atteints de troubles dépressifs majeurs, y compris le sévère dépression résistante aux médicaments, dépression bipolaire, maladies de Parkinson et la schizophrénie^1,2. Dans cette thérapie, saisie est généré par des stimulus électrique livré à la tête des patients anesthésiés par l’intermédiaire d’epicranial électrodes^1,2,3. L’administration répétée d’ECS a été cliniquement bénéfique pour les troubles dépressifs résistants aux médicaments

Protocole

Toutes les procédures expérimentales, y compris les sujets animaux ont été approuvés par le soin des animaux institutionnels et Comité de l’urbanisme à l’Université de l’Illinois à Urbana-Champaign.

1. Comment entretenir une colonie de rats

1. Se reproduisent les rats Sprague-Dawley (voir la Table des matières) et les maintenir dans des conditions standards avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et l’accès à la nourriture et l’eau ad libitum.
2. Sevrer les ratons à jour après la naissance (P) 28 et les loger dans des groupes de 2 à 4 mâle ou femelle de même portée.
3. Marquer les queues de rats mâles a....

Résultats

À l’aide de la procédure détaillée présentée ici, un choc électrique (55 mA, 100 impulsions/s pendant 0,5 s) livrés par clip oreille électrodes induits non récurrente stade 4-5 tonico-cloniques chez les rats (Figure 1A-B). Un total de 8 des rats a reçu aiguë induction ECS et affiche 4-5e étape tonico-cloniques. Les saisies a duré environ 10 s et tous les rats récupérés dans les 1-2 min de la cessation de la saisie. Les rats SHAM « aucune sais.......

Discussion

Nous décrivons ici une méthode d’induction ECS chez les rats qui provoque la stimulation globale de l’activité neuronale dans leur hippocampe. ECS est un modèle animal de la thérapie par électrochocs, qui est cliniquement utilisé pour traiter les troubles dépressifs réfractaires de drogue chez les humains^1,2,3. Malgré l’utilisation de la thérapie par électrochocs pour traiter la dépression grave, le mécanisme sous-jacent précis .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Rat Spargue-Dawley	Charles River Laboratories		ECS fournit
un générateur d’impulsions	Ugo Bsile, Comerio, Italie	57800	ECS fournit
système de purification d’eau MilliQ	EMD Millipore	Z00Q0VWW	Fournitures de fractionnement subcellulaire
Sucrose	Em science	SX 1075-3	Fournitures
de fractionnement subcellulaireNa4O7P2	SIGMA-ALDRICH	221368 Alimentations	fractionnement subcellulaire
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	SIGMA-ALDRICH	E9884	Alimentations de fractionnement subcellulaire
HEPES	SIGMA-ALDRICH	H0527	Alimentations de fractionnement subcellulaire
Acide okadaïque	TOCRIS	1136	Alimentations de fractionnement subcellulaire
Inhibiteur de protéase Stop	Thermo Scientific	78429	Alimentations de fractionnement subcellulaires
NaVO3	SIGMA-ALDRICH	72060	Alimentations de fractionnement subcellulaires
EMD Millipore, Sterito Filtres stériles pour bouteilles sous vide,	Fisher Scientific	SCGPS05RE	Fournitures de fractionnement subcellulaire
, Ciseaux Iris,	WPI (World Precision Instruments)	500216-G	Alimentation de fractionnement subcellulaire
Boîte de culture tissulaire de 30 mm	Fisher Scientific	08-772B	Alimentation de fractionnement subcellulaire
Homogénéisateur en verre et un pilon en téflon	VWR	89026-384	Alimentation de fractionnement subcellulaire
Tube de microcentrifugation de 1,7 mL	DENVILLE SCIENTIFIC INC.  ;	C2170 (1001002)Alimentations	de fractionnement subcellulaire
Centrifugeuse Sorvall Legend XT/XF  ;	Thermo Fisher	75004521	Fournitures de fractionnement subcellulaire
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL	Thermo Fisher	#23228	Western blot fournit
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL	Thermo Fisher	#1859078	Western blot fournit
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)	BIO-RAD		Western blot supplies
Running Tampon	Fabriqué en laboratoire		Western blot fournit.  ;
Cellule d’électrophorse verticale Mini-PROTEAN Tetra pour gels MiniPrecast, 4 gels	BIO-RAD	#1658004	Western blot fournit
une membrane en difluorure de polyvinyle (PVDF)  ;	fournitures de transfert Milipore	IPVH00010	Western
Fabriqué	en laboratoire		.
Tris-base	Fisher Scientific	BP152-1	blot supplies
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5	Western blot supplies
Dodecyl sulfate	de sodium SIGMA-ALDRICH	436143	Western blot supplies
Methanol  ;	Fisher Scientific	A454-4	Western blot fournit le
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	pour l’isolation PSD
Mini Trans-Blot Module  ;	BIO-RAD	#1703935	Western blot supplies
Lait écrémé instantané en poudre	d’un excellent rapport qualité-prix		blot
rotateur polyvalent.	Thermo Scientific	Model-2314	Western blot fournit le
film d’autoradiographie Hyblot CL	DENVILLE SCIENTIFIC INC.  ;	E3018 (1001365)	Western blot fournit
un substrat de chimifluorescence amélioré  ;	Thermo Scientific	32106	Western blot fournit
un processeur de film Konica SRX-101A	KONICA MINOLTA	SRX-101A	Western blot fournit
Nom de l’anticorps
PSD-95	Cell Signaling	#2507	Dilution de l’anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, température de réaction = 4 ° ; C, Espèce hôte = Signalisation
cellulaire	la synaptophysine	#4329	Dilution des anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 ° ; C, Espèce hôte =
Alpha-Tubulin	de lapin Santacruz	SC-5286	Dilution des anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 ° ; C, Espèce hôte = Souris
GluN2B	Neuromab	75-097	Dilution des anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 ° ; C, Espèce hôte =
Souris GluA2	Sigma-aldrich	Sab 4501295	Dilution des anticorps = 1:500 - 1 000, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 ° ; C, Espèce hôte = Lapin
STEP	Santacruz	SC-23892	Dilution des anticorps = 1:200 - 500, temps = 9 - 12 h, Température de réaction = 4 ° ; C, Espèce hôte =
Peroxidas de souris AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoReserch laboratory	715-035-150	Dilution des anticorps = 1:2 000-5 000, temps = 1 h, température de réaction = RT, espèce hôte = Peroxidas d’âne
AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoReserch laboratory	711-035-152	Dilution des anticorps = 1:2 000-5 000, temps = 1 h, température de réaction = RT, espèce hôte = âne

le de , #4561086S , Tampon de transfert de Western détergent Western de de lapin