Nous avons décrit un protocole permettant d’effectuer une hépatectomie partielle (PHx) et la transplantation de cellules par l’intermédiaire de rate en clin de œil. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris. Dans ce protocole, une incision est faite pour exposer et résection du lobe gauche du foie suivi d’une autre incision pour la transplantation intra-splénique de cellules.
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Article de méthode
Intra-splénique Transplantation d’hépatocytes après hépatectomie partielle en clin de œil. Souris SCID
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une hépatectomie partielle est une méthode polyvalente et reproductible pour étudier la régénération du foie et l’effet de la thérapeutique de la cellule en fonction dans diverses conditions pathologiques. Une hépatectomie partielle facilite également l’augmentation de prise de greffe et la prolifération des cellules transplantées en accélérant la néovascularisation et la migration des cellules vers le foie. Nous décrivons ici un protocole simple pour effectuer une hépatectomie 30 % et la transplantation de cellules dans la rate d’un diabétique/sévère non obèses combinées NOD immunodéficients. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris.
Dans cette procédure, deux petites incisions sont pratiquées. La première incision est d’exposer et de résection du lobe gauche du foie, et une autre petite incision est faite pour exposer la rate pour la transplantation intra-splénique de cellules. Cette procédure ne nécessite pas des compétences chirurgicales spécialisées, et il peut être complété en 5-7 minutes avec moins de stress et douleurs, une récupération plus rapide et meilleure survie. Nous avons démontré la transplantation des hépatocytes isolés d’une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant des souris (transgéniques C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), mais aussi des hépatocytes comme des cellules d’origine humaine (NeoHep) en partiellement hépatectomisés clin de œil. Souris SCID.
Introduction
Actuellement, la transplantation hépatocytaire est proposée comme une alternative à la transplantation d’organes entiers pour le traitement des patients ayant des troubles hépatiques graves. On croit qu’il peut combler les patients de transplantation organes entiers1. En plus de l’allogreffe hépatocytes2, hépatocytes xénogène3 et dérivées de cellules souches4 les hépatocytes sont également étudiés dans des modèles animaux. Dans ce contexte, la domiciliation et la greffe le potentiel des cellules transplantées chez le receveur est un critère important pour la thérapie cellulaire basé dans l’insuffisance hépatique aiguë (AHF).
Pour enquêter sur la transplantation d’hépatocytes ou cellules semblables à des hépatocytes5, AHF est créée dans un modèle animal par chirurgie6 ou pharmacologiques7 procédures, suivies par la transplantation de cellules. Pour faire un modèle animal de l’AHF de réactifs pharmacologiques, nombreux hépatotoxines comme d-galactosamine8, acétaminophène9, tétrachlorure de carbone10, thioacétamide11, concanavaline A12, lipopolysaccharide13 , etc.., ont été utilisés. Dans cette liste, chaque réactif génère un ensemble unique de fonctionnalités pour AHF, mais malheureusement aucun réactif unique n’imite l’AHF humaine. En outre, l’AHF induite par les hépatotoxines prend beaucoup de temps, ce qui place les animaux sous stress chronique, et des résultats reproductibles sont difficiles à obtenir.
En revanche, l’intervention chirurgicale d’une hépatectomie partielle (PHx) est dépendante de compétence, et des résultats reproductibles sont faciles à obtenir après avoir développé les compétences requises. Pour provoquer l’AHF par elle seule une intervention chirurgicale, la résection de plus de 70 % du foie est nécessaire ; Toutefois, moins d’une hépatectomie 70 % peut encore servir pour étudier la prise de greffe et la prolifération des transplanté des cellules du foie pour analyser leur capacité thérapeutique lors de lésions du foie14. La transplantation des hépatocytes ont été exécutées après hépatectomie par le péritoine15, queue veine16,17de la veine hépatique ou la rate18. Actuellement, la perfusion veineuse hépatique et la transplantation intra-splénique des hépatocytes sont les procédures privilégiées, car ils sont plus faciles à reproduire.
Dans cet article, nous avons décrit une procédure pour une hépatectomie partielle de 30 % en clin de œil. SCID (CLIN De ŒIL. CB17-Prkdcscid/J) souris dont le lobe gauche du foie est excisé. Il est suivi par la transplantation de 0,2 millions hépatocytes de souris (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J) exprimant GFP ainsi que leur origine humaine NeoHep19 dans la rate. Cette procédure conduit à la prise de la greffe des cellules transplantées dans le foie. Cette procédure est la moins invasive et une technique peu douloureuse.
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Protocole
Les procédures présentées dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité d’éthique animale institutionnel du National Institute of Immunology, New Delhi. Le numéro de série de référence de l’agrément est AIVE #319/13.
Remarque : Il y a d’excellentes ressources sur les procédures de chirurgie générale20 et des protocoles spécifiques pour chirurgie de rongeur,21. Pour ceux qui font de la chirurgie animale pour la première fois, il est recommandé de pratiquer intensivement des interventions chirurgicales sur des mannequins avant d’utiliser sur les animaux.
1. préparation
- Avant l’expérience, garder salin stérile tamponnée au phosphate (PBS) ou prêt saline.
- Assembler un kit de chirurgie contenant ciseaux, pinces dentelées, forceps tissue, coton, cotons-tiges, fils de nylon et différentes micro porte-aiguilles. Le kit de chirurgie d’autoclave. Spécial il faut si un clin de œil immunodéprimé. La souris SCID est incluse dans le protocole.
- Effectuer l’ensemble de la procédure expérimentale, de la préparation à la fin de la chirurgie, de la bio-sécurité de classe I du cabinet.
- Peser un clin de œil. Souris SCID 6-8 semaines avant la chirurgie. Pesant entre 14-18 g de souris sont utilisées dans cette étude.
- Raser la région abdominale supérieure centrale et hypocondriaque de la souris avec la tondeuse. Appliquer uniformément dans toute la région, la crème épilatoire avec une spatule pour supprimer complètement les poils taillés. Enlever les poils doucement à l’aide d’un morceau de coton stérile humide après 2 à 5 min.
- Placez votre souris dans la chambre de l’isoflurane et ouvrir le robinet de la bouteille d’oxygène. Maintenir le débit d’oxygène à raison de 4 L/min et la vaporisation isoflurane à 4 % pour induire l’anesthésie.
- Veiller à ce que la souris a été anesthésiée convenablement en pinçant doux orteil.
- Placez une planche en chirurgie à l’intérieur d’une prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Mettez l’animal sur le plateau de chirurgie, de sorte que la partie ventrale de la souris vers le haut et la partie antérieure de la souris est placée à l’intérieur du cône de nez connecté à l’alimentation en oxygène et isoflurane.
- Réduire la vaporisation isoflurane à 2 % et l’entretenir tout au long de l’intervention chirurgicale.
- Désinfecter la peau de la souris et stériliser en les essuyant avec du coton stérile imbibé d’éthanol à 70 %.
2. opération chirurgicale
-
Hépatectomie partielle
- Faire une incision transversale d’environ 1 cm dans la peau juste sous le sternum, perpendiculaire au processus xiphoïde et parallèle à la cage thoracique, avec l’aide de ciseaux d’exploitation droites.
- Doucement, séparer la peau attachée avec la couche de muscles abdominaux dans le voisinage de la zone incisée avec une pince ou conseils de coton humide stérile d’établir une distinction entre la peau et la couche de muscles abdominaux. Faites tremper la région intradermique avec du PBS à l’aide de bouts de coton stérile pour échapper à la dessiccation.
- Exposer la zone du lobe gauche en douceur en faisant une incision transversale à travers la couche péritonéale juste en dessous de la xiphoïde. Deux bouts de coton humide permet d’exposer et de soulever le lobe gauche du foie.
- Placez un des conseils de coton sur la partie abdominale de la coupe, puis placez une autre astuce de coton sur le côté du diaphragme. Appuyez la pointe vers le diaphragme doucement et donner un coup de pouce coulissant par l’autre extrémité pour soulever le lobe gauche du foie.
- Glisser un fil de nylon avec une boucle dans le lobe gauche levé et glisser la boucle vers la base du lobe gauche près du hile, avec l’aide des conseils micro-pince ou coton. Pousser doucement vers le bas de la boucle de fil de nylon à la base du lobe gauche.
- Nouer les deux extrémités du fil en nylon sur le dessus du lobe gauche en utilisant un porte-aiguille de microchirurgie et la pince micro. Faire deux nœuds supplémentaires de l’autre côté.
- Disséquer sur le lobe lié à l’aide de ciseaux. N’essayez pas de couper de très près le thread. Dans le cas où la procédure dure plus de 5 min, gardez la cavité péritonéale et les organes humide avec du PBS stérile pour éviter la dessiccation en raison de la perte de fluide.
- Coudre le péritoine en continu suture utilisant une suture de Catgut 4-0. Par la suite, fermez la peau par une suture discontinus aussi rapidement que possible.
-
Transplantation de cellules
Remarque : Les hépatocytes exprimant de la GFP ont été isolés chez des souris transgéniques de GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 Scha/J), selon la procédure décrite par Lee et al. 22 et Shen et al. 23 cellules semblables à des hépatocytes (NeoHep) d’origine humaine différenciée des monocytes24 servaient aussi à la transplantation. Toutefois, cellules provenant d’autres sources peuvent également être employées dans le protocole.- Suspendre les 0,2 millions de cellules viables dans environ 50 µL de Dulbecco modifiée de Iscove Medium (IMDM) et il aspirer dans une seringue à insuline 1 mL avec aiguille 30 G. Garder au froid la seringue en le plaçant sur la glace.
- Placer la souris de manière que la partie latérale gauche vers le haut vers la personne qui effectue l’intervention chirurgicale. Identifier la région splénique et transversalement disséquer la peau près de la région hypocondriaque, suivie par une courte incision à travers la couche péritonéale juste pour exposer la rate.
- Soulever la rate délicatement et maintenez à l’extérieur de la cavité à l’aide de deux PBS humidifié bouts de coton.
- Tenez la rate avec soin avec deux bouts de coton dans une main et placez l’aiguille de la seringue exactement verticale à la rate. Doucement, percent la rate et pousser l’aiguille très lentement à l’intérieur ; l’aiguille ne devrait pas recevoir plu de 2 mm.
- Abaissez lentement le piston de la seringue pour injecter les cellules de la rate. Après la transplantation, maintenir la stabilité de l’aiguille de la seringue et retirez-la lentement de la rate afin d’éviter un saignement ou une perte de cellules.
- Après avoir placé la rate dans la cavité péritonéale avec les bouts de coton, fermer la couche péritonéale en suturant continue avec une suture de Catgut 4-0. Coudre la peau discontinue avec la suture même. Évitez d’utiliser des clips de la plaie pour la fermeture de la peau ; au lieu de cela, le fermer par une suture 4-0. Les clips de plaie restreignent le mouvement naturel de la souris, et souvent les clips sont desserrent et sortent rapidement.
3. post-opératoire soins
- Après la fermeture de la peau, essuyez les environs des deux sites suture avec la solution d’iode (Bétadine) à l’aide d’un bout de coton stérile.
- Injecter une dose d’antibiotique céfotaxime que 600 mg/kg par voie intrapéritonéale de poids (en général 12 mg céfotaxime dans 100 µL de solution saline/souris) corporel à l’aide de la seringue de 1 mL.
- Donner des doses quotidiennes de Meloxicam analgésique 1 mg/kg de poids corporel (en général 12 µg Meloxicam dans 100 µL de solution saline/souris) à l’animal par voie intrapéritonéale, jusqu'à trois jours après la chirurgie.
- A l’issue de la chirurgie, arrêter l’écoulement du gaz isoflurane et replacez la souris dans la cage ventilée individuellement.
4. euthanasie et caractérisations
- Après les paramètres expérimentaux (1 jour et 10 jours post chirurgie), euthanasier les souris selon les directives d’éthique animale institutionnels.
- Recueillir le sang par un saignement en phase terminale aux animaux, perforant le plexus terminal oculaire.
- Isoler le sérum du sang.
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Résultats
Prolifération des hépatocytes après hépatectomie partielle de 30 % : La prolifération des hépatocytes dans le reste du foie après hépatectomie 30 % a été examinée par immunohistochimie (IHC) coloration d’un marqueur de prolifération cellulaire, Ki-67. Une journée après hépatectomie, les souris ont été euthanasiés, les lobes du foie restants ont été excisées et sections de paraffine ont été obtenues. Les sections ont été colorées avec les anticorps de Ki-67, suivi par marquage avec l’anticorps secondaire ...
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Discussion
Une hépatectomie partielle est une technique établie pour la régénération du foie chargée de l’enquête, et une hépatectomie excessive est signalée à imiter le modèle de l’AHF. Parmi les modèles animaux de l’AHF, rongeurs, en particulier des souris, sont le modèle plus étudié. Pour obtenir un modèle de lésions hépatiques chez les souris, jusqu'à une hépatectomie 70 % ont été signalés avec une bonne survie taux25,26. Cependant en nu et autres souris immunodéficient...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention de base provenance du département de biotechnologie, gouvernement de l’Inde à l’Institut National d’immunologie, New Delhi. Adresse actuelle de m. Bhattacharjee est Division de gastro-entérologie, hépatologie et Nutrition, Hospital de Los Angeles pour enfants.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Système d’anesthésie gazeuse | Ugo Basile ; Italie | 211000 | |
| Balance | Goldtech ; Inde | Approvisionnement local | |
| Cabinet de sécurité biologique (Classe I) | Kartos international ; ; Inde | Achat local | |
| Tondeuse à cheveux | Panasonic ; ; Japon ; | ER-GY10 ; | |
| Ciseaux de travail droits avec lames tranchantes / tranchantes | Major Surgicals ; Inde | Forceps d’approvisionnement local | |
| avec dentelures Chirurgies | majeures ; Inde | Approvisionnement local | |
| porte-aiguilles ; droits & courbes ; | Mercienne ; ; Angleterre ; | BS-13-8 | |
| Seringue à insuline de 1 ml avec aiguilles 30G *5/16 | Dispo Van ; Inde | ||
| 1 ml seringue avec 26 G * 1/2 aiguille | BD ; États-Unis ; | REF 303060 | |
| Fils de nylon ; ; | puissant; Inde | (1-0) Approvisionnement local | |
| MERSUTURES 4-0 Suture chirurgicale aiguilletée stérilisée | Ethicon, Johnson & Johnson, Inde | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 suture chirurgicale résorbable Sutures | India Pvt. Ltd ; Inde | SN 5048 | Suture chirurgicale aiguilletée stérilisée Catgut Cotons-tiges chromiques |
| Écouvillons purs Pvt Ltd ; ; Inde | Approvisionnement local | ||
| Ruban chirurgical | 3M Inde ; Inde | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italie | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; Microscope | ||
| Zeiss ; Allemagne ; | LSM 510 META | ||
| Microscope à champ clair | Olympus, Japon | LX51 | |
| Analyseur automatisé | Tulip, Alto Santracruz, Inde | Écran Maaster 3000 | Analyseur biochimique pour test fonctionnel hépatique |
| Cytomètre en flux | BD ; États-Unis ; | BD FACSverse | Évaluation de la présence de cellules après la transplantation |
| Crème dépilatoire Veet ; | Reckitt Benckiser , Inde | ||
| FORANE | Abbott ; isoflurane USP | 99,9 %² | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution ; | Win-Medicare ; ; Inde | Bétadine | |
| , Paraformaldéhyde, | Himedia ; Inde | GRM 3660 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Saccharose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissu-Tek | Sakura ; US | 25608-930 | O.C.T composé |
| DAPI | Himedia ; Inde | MB 097 | |
| anti-albumine chèvre Polyclonal | Thermo Scientific, Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexine 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP lapin polyclonal ; | la biotechnologie de Santa Cruz ; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 âne anti-chèvre | Sondes moléculaires , Thermo Fisher Scientific ; ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 âne anti-moutons | ; Sondes moléculaires , Thermo Fisher Scientific ; ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 poulet anti lapin | ; Sondes moléculaires , Thermo Fisher Scientific ; ; US | A21442 | |
| Chèvre anti lapin IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific ; États-Unis ; | 65-6120 | |
| anticorps anti-Ki67 | abcam, UK | ab15580 | |
| Solution de démasquage d’antigène, Laboratoire vectoriel à base d’acide citrique | , US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientifique ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Système clinique de corail, Inde | ||
| KIT SGPT (ALAT) | Système clinique de corail, | ||
| Inde Kit de phosphatase alcaline (DEA) | Système clinique de corail, | ||
| de Mayer | ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, Sigma alcoolique | ; Montage DPX HT110132 | ||
| ; | sigma; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd ; Inde | Meloxicam injection ; | |
| Système de substrat liquide amélioré DAB tétrachlorhydrate | Sigma ; États-Unis | D3939 |
Références
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Réimpressions et autorisations
