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Article de méthode

Alimentation de régime riche en graisses et haut débit triacylglycérides essai chez Drosophila Melanogaster

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DOI :

10.3791/56029

⸱

13 septembre 2017

 ,  , 
1Development, Aging and Regeneration Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Dans cet article

Résumé

Il s’agit d’un régime riche en graisses alimentation protocole pour provoquer l’obésité chez la drosophile, un modèle pour la compréhension des mécanismes moléculaires fondamentaux impliqués dans la lipotoxicité. Il fournit également un dosage de triacylglycérides à haut rendement pour mesurer l’accumulation de graisse dans la drosophile et potentiellement d’autres modèles (insectes) dans diverses conditions alimentaires, environnementale, génétiques ou physiologiques.

Résumé

Maladie cardiaque est la première cause de mortalité humaine dans le monde. Nombreuses études ont montré des liens solides entre l’obésité et de défaillance cardiaque chez les humains, mais plus d’outils et les efforts de recherche sont nécessaires pour mieux élucider les mécanismes impliqués. Pour plus d’un siècle, le modèle génétiquement très docile de la drosophile a contribué à la découverte de gènes clés et les voies moléculaires qui s’est avéré être hautement conservée à travers les espèces. De nombreux processus biologiques et les mécanismes de la maladie sont fonctionnellement conservées chez la mouche, tels que le développement (par exemple, plan du corps, coeur), le cancer et les maladies neurodégénératives. Récemment, l’étude de l’obésité et des pathologies secondaires, tels que les maladies cardiaques chez les organismes modèles, a joué un rôle critique dans l’identification des régulateurs clés impliqués dans le syndrome métabolique chez l’homme.

Ici, nous vous proposons d’utiliser cet organisme modèle comme un outil efficace pour induire l’obésité, par exemple, l’accumulation excessive de graisse et élaboration d’un protocole efficace pour surveiller la teneur en matière grasse sous la forme de l’accumulation de TAGs. Outre le hautement conservée, mais moins complex génome, la mouche a également une durée de vie courte pour une expérimentation rapide, combinée à la rentabilité. Ce document fournit un protocole détaillé pour haute graisse Diet (HFD) alimentation chez la drosophile pour provoquer l’obésité et un dosage de triacylglycérides (TAG) à haut débit pour mesurer l’augmentation connexe de la teneur en matière grasse, dans le but d’être hautement reproductible et efficace pour le dépistage génétique ou chimique à grande échelle. Ces protocoles offrent de nouvelles opportunités pour efficacement enquêter sur les mécanismes de régulation impliquées dans l’obésité, ainsi que fournir une plate-forme standardisée pour recherche de découverte de médicaments pour le test rapide de l’effet de médicaments potentiels sur le développement ou prévention de l’obésité, le diabète et les maladies métaboliques associées.

Introduction

Nous sommes dans un moment où l’obésité et ses contraintes économiques associés, est un problème mondial1. Deux de chaque trois Américains sont en surpoids ou obèses présentant des pathologies cardiaques connexes, la principale cause de décès au sein de la population adulte2. Nouvelles méthodes efficaces sont nécessaires pour enquêter adéquatement sur les composantes génétiques et moléculaires impliqués dans la régulation du syndrome métabolique à l’aide d’organismes modèles. Pour cette raison, nous choisissons la drosophile Drosophila modèle parce qu’elle partage les processus biologiques élémentaires avec les mammifères, y compris les souris et les humains3,4,5,6. Génome de la drosophileest hautement conservée au cours de l’évolution, mais dans l’ensemble beaucoup plus petites avec moins de duplication génique et complexité métabolique, ce qui est idéal pour la compréhension des mécanismes fondamentaux impliqués dans plusieurs maladies humaines4 , 7 , 8. en outre, caractéristique des processus effectué par le tissu adipeux, le tube digestif et pancréas sont représentés à la volée et médiation des fonctions de régulation dans le métabolisme de glucose et des lipides, par exemple, qui sont semblables aux êtres humains9, 10,11. En outre, les base voies moléculaires impliquées dans le contrôle de l’obésité, résistance à l’insuline et le diabète chez l’humain sont fonctionnellement conservés Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. comme les organismes supérieurs, Drosophila a un cœur qui bat qui est formé au cours du développement par un processus similaire à celui des mammifères coeur3,17. Ainsi, le développement d’un SIH fiable alimentant le protocole et le dosage de TAG à haut débit, adaptés à des fins de dépistage efficace à l’aide de la boîte à outils génétiques de la drosophile, constituent un moyen important d’étudier et de comprendre les bases génétiques fondamentales maladies métaboliques complexes sous-jacentes.

La nourriture HFD lui-même est issue d’un aliment de mouche de laboratoire standard additionné d’huile de coco, qui est composée principalement d’acides gras saturés, connus pour être associés avec le syndrome métabolique18. Induisant l’obésité chez les modèles mammifères, tels que les rongeurs, peut prendre des mois19,20, notre HFD optimisé, protocole d’alimentation chez la drosophile efficacement et de façon reproductible augmente organismique de matière grasse dans une affaire de jours12,14. Ce protocole, en conjonction avec un essai de débit élevé TAG, permet le dépistage de masse efficace pour les effets de facteurs génétiques, les influences de l’environnement et les médicaments candidats à découvrir de nouveaux modulateurs du métabolisme des graisses. En conséquence, ces protocoles sont probables pertinents pour comprendre et combattre l’obésité et les pathologies humaines associées à l’obésité.

Le protocole alimentaire est polyvalent et peut être appliqué à l’étude les effets métaboliques et fonctionnelles du seul des acide gras saturé ou insaturé. L’utilisation de ce test de TAG à haut débit n’est pas limitée à d. melanogaster, mais peut être adaptée à une variété d’organismes petit modèle avec cuticule ou difficiles matrices extracellulaires (p. ex., autres espèces de drosophile , c. elegans et les autres nouveaux organismes invertébrés modèles) pour mesurer la teneur en matières grasses dans différentes conditions environnementales, génétiques ou physiologiques, à tout stade de développement, à l’âge adulte ou phase de maladie métabolique. Le TAG est basé sur une mesure colorimétrique d’une série de réactions enzymatiques qui dégradent les balises en acides gras, le glycérol, le glycérol 3-phosphate et enfin H2O2 qui réagit avec l’amino-4 antipyrine (4-AAP) et 3,5- dichloro-2-hydroxybenzène sulfonate (DHBS 3,5) pour produire un produit de couleur rouge qui est mesuré à l’aide d’un spectrophotomètre de 96 puits.

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Protocole

1. HFD, protocole d’alimentation

figure-protocol-1
tableau 1. Recette de nourriture volée.
Ce tableau résume les différents ingrédients utilisés pour préparer notre contrôle alimentaire. Une fois fait, 10 mL de l’aliment est versé dans les fioles, refroidi et stocké à 4 ° C pour un stockage prolongé.

  1. Préparation HFD
    1. pour faire 1 kg de matières grasses alimentaires, pèse 700 g de pré-faites nourriture mouche normal (voir tableau 1) et 300 g d’huile de noix de coco dans deux récipients séparés à l’aide d’une balance analytique.
    2. Chauffer chaque conteneur individuellement au micro-ondes, jusqu'à ce que le contenu fond complètement. Versez l’huile de noix de coco dans le récipient de nourriture volée. Remuer à l’aide d’un fouet jusqu'à ce que l’huile est bien mélangé dans la nourriture volée.
      Remarque : Aucun des morceaux de nourriture ou de l’huile ne doivent être visibles. Lorsque la nourriture volée fond au four à micro-ondes, arrêter à intervalles de 1 min à mélanger les aliments et éviter les débordements.
    3. Repeser les aliments gras élevé. Si le poids total est inférieur à 1 kg (700 g de nourriture + 300 g d’huile de coco), ajouter de l’eau (environ 10 mL) pour compenser l’évaporation au cours du chauffage et de ramener le poids de 1 kg
    4. Verser environ 10 mL de bien mélangé aliments gras élevé par flacon (environ 25 % du volume du flacon). Ensuite, couvrir avec une gaze pour empêcher les mouches ' contamination. Refroidir pendant 1 h à température ambiante puis transférer les flacons à 4 ° C pour le stockage jusqu'à 4 semaines.
      Remarque : L’alimentation normale (NF) est utilisée comme contrôle alimentaire. Également verser 10 mL (environ 25 % du volume du flacon) de NF par flacon. Pour la nourriture HFD, remplacer 30 % de la nourriture NF avec de l’huile de noix de coco. Pour le contrôle et les conditions expérimentales, les mouches ont reçu la même quantité de NF et HFD (10 mL d’aliments par flacon).

figure-protocol-2
figure 1 . HFD alimentation chez la drosophile.
Le schéma montre les différentes étapes d’alimentation pour les mouches sur une alimentation de contrôle (alimentation normale sans ajout d’huile de coco-NF) ou HFD (avec l’ajout d’huile de noix de coco). L’ensemble du processus prend 10 jours après le prélèvement initial de mouches adultes. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

  1. HFD alimentation de d. melanogaster
    Remarque : ce protocole inclut le contrôle alimentaire et HFD alimentant les procédures qui sont compatibles avec n’importe quelle ligne mouche. Contrôle et mouches expérimentales sont mises en flacons contenant le même aliment quantité (NF ou HFD).
    1. Utilisation CO 2 à anesthésier les mouches.
      Remarque : Pour les néophytes, s’il vous plaît lire référence 21 pour avoir un aperçu sur le déclenchement et la gestion de d. melanogaster.
    2. Recueillir 0-5 mouches jour vieux de flacons et de transfert (par rotation) les mouches dans les nouveaux flacons contenant NF (préalablement chauffée à la température ambiante). Laissez l’âge mouches pendant 5 jours supplémentaires à 21 ° C.
    3. à la fin des 5 jours, sortir les flacons contenant du SIH et NF de 4 ° C.
      Remarque : comme les températures froides peuvent souligner mouches vivantes, laisser les flacons pendant 30 min à température ambiante pour se réchauffer avant de l’utiliser.
    4. à l’aide de lingettes, nettoyer et enlever l’excès de liquide sur les côtés du flacon.
    5. Insérer un petit morceau de papier filtre, sur 1 cm x 3 cm, dans les aliments gras élevé pour absorber les liquides excédentaires.
      Remarque : Cette étape est essentielle pour empêcher que les mouches ne s’en tenir à la nourriture HFD.
    6. Ensuite, transférer les mouches sur la nourriture graisse haute (par rotation). Posez les flacons horizontalement sur le côté, (non permanent) à 21-22 ° C pendant 5 jours.
      Remarque : Éviter les températures plus élevées, comme cela peut fondre partiellement les aliments gras élevé, provoquant les mouches s’en tenir à la nourriture et de mourir.
    7. Après 5 jours, transférer (par rotation) les mouches du NF et HFD dans les nouveaux flacons sans nourriture pour permettre à leurs tripes à vide pendant 30 min. Ensuite, procéder au pesage le mouches.
      Remarque : Une des étapes essentielles dans cette HFD, protocole d’alimentation est de préparer un bien mixte HFD, exempt de n’importe quel morceaux de nourriture volée ou huile condensée. Mélange homogène et le refroidissement du HFD à 45-30 ° C sont conseillé, avant de verser dans des flacons et de stocker la nourriture à l’âge approprié de 4 ° C. correspondance de contrôle et de mouches expérimentales est important ainsi que de l’accord préalable des conditions nutritionnelles et environnementales contrôlées à l’alimentation de SIH. Au cours de la phase d’alimentation, contrôle et expérimentales mouches il faut la même quantité de NF et HFD. Jamais recueillir des mouches de flacons surpeuplés ou bouteilles (pour éviter les effets transgénérationnels). Toujours mettre un maximum de 25 mouches par flacon pendant NF et HFD alimentation afin d’éviter les restrictions alimentaires ou autres effets d’encombrement. Le SIH est composé de 30 % d’huile de noix de coco, donc des températures supérieures à 22 ° C pourraient partiellement fondre le SIH, causant les mouches de s’en tenir sur la nourriture grasse et meurent. Avant de mettre les mouches sur le SIH, nettoyer les flacons pour retirer toute l’huile résiduelle et insérer un filtre en papier pour absorber tout excès de liquide dans l’aliment. Pendant l’incubation des mouches sur HFD, les flacons sont disposés sur les côtés pour fournir une surface horizontale sans matières grasses pour les mouches.
  2. Les mouches de pesage
    1. pour chaque génotype et du sexe à tester, utiliser une échelle ultra sensible pour noter le poids des tubes préalablement étiquetées, vide de 1,7 mL.
    2. à l’aide de mouche anesthésique ou CO 2, anesthésier et recueillir 36 mouches du même génotype, sexe, et alimentant un statut avec une brosse avant pesait 1,7 tube mL.
    3. Peser le tube contenant le mouches avec la même ampleur ultra-sensible.
    4. Déterminer le poids mouche moyen suivant cette formule :
      figure-protocol-3
      Remarque : le nombre de mouches dans le présent protocole est 36.
    5. Flash geler les tubes de 1,7 mL contenant des mouches en plongeant dans l’azote liquide pour 2 min. collecter et mettre les tubes dans des boîtes. Ensuite, transférer les boîtes pour stockage jusqu'à l’utilisation avec le test de TAG à-80 ° C (température préférable).
      ATTENTION : L’azote liquide est à une température extrêmement basse. S’il vous plaît utiliser un équipement de protection personnelle approprié.

2. Dosage de TAG

  1. préparation des concentrations standards TAG
    1. préparer 500 mL de PBT (PBS 1 X, 0.05 % Triton).
    2. Tubes de 0,5 mL à l’aide et la solution du TAG (Table des matières), préparer 100 µL de blanc (PBT seulement) et 100 µL de six concentrations de TAG standards (2 µg/µL ; 1 µg/µL ; 0,5 µg/µL ; 0,25 µg/µL ; 0,125 µg/µL ; 0,0625 µg/µL) avec le PBT.
    3. Placer les tubes sur la glace et aller de l’avant avec les mouches de meulage.
  2. Les mouches de meulage
    1. sortir les mouches congelés de-80 ° C (étape 1.3). Transférer les tubes contenant les mouches sur glace
    2. Tout d’abord, placez 2 mm métal boulets de broyage dans un distributeur de boule de 96 puits, utiliser un petit pinceau pour enlever les boules supplémentaires.
      3. Plaque de
    3. lieu le broyage de 96 puits à l’envers sur le distributeur de la boule et le flip pour transférer les boules métalliques directement dans la plaque de hachage. Il devrait y avoir une boule / puits.
    4. à l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 600 µL de PBT dans chaque ligne de la plaque de 96 puits hachage.
    5. Avec une pince, ajouter 3 mouches / puits. Indique l’état de génotype, le sexe et nourriture des mouches dans chaque rangée/puits de la plaque de 96 puits hachage.
    6. Bien placer les capuchons sur la plaque de ponçage de 96 puits. Ruban adhésif peut être placé sur le dessus pour s’assurer qu’il n’y a aucune fuite.
    7. Placer correctement les plaques de 96 puits broyage dans la rectifieuse. Régler la machine à la vitesse la plus élevée et la presse " exécuter " pour moudre les mouches pendant 3 min.
    8. Après 3 min, arrêter la mouture et de procéder à la centrifugation de la plaque : centrifuGE pour 15 min à 4 000 x g, 4 ° C. Après centrifugation, gérer la plaque de hachage avec précaution pour éviter de mélanger le liquide surnageant avec le pellet.
  3. Chargement d’échantillon et détermination contenue TAG
    1. prendre une nouvelle plaque de 96 puits spectrophotomètre. À l’aide d’une pipette multicanaux, charger 200 µL de réactif TAG dans chaque ligne de la plaque.
    2. Charge 20 µL de PBT dans le premier puits de la première ligne, pour créer un espace vide. La composition de pipetage de haut en bas. Éviter la formation de bulles.
    3. Charge 20 µL de chaque dilution standard (de l’étape 2.1.2) dans les autres puits de la première ligne et mix par pipetage de haut en bas. Éviter la formation de bulles.
    4. à l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 20 µL de surnageant de chaque ligne de la plaque de ponçage à la ligne correspondante dans la plaque de 96 puits spectrophotomètre. Pipetter en haut et en bas pour bien mélanger. Éviter la formation de bulles.
    5. Ensuite, placez une feuille perméable au gaz sur le dessus de la plaque à 96 puits.
    6. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 10 min.
      Remarque : S’il existe des bulles dans les puits, centrifuger la plaque pendant 2 min à 2 000 g pour enlever toutes les bulles. La présence de bulles n’interférera avec la lecture de l’absorbance.
    7. Lire l’absorbance de chaque puits de la plaque à 550 nm en utilisant un lecteur de microplaques compatibles. Ensuite, tracer la courbe d’étalonnage et déterminer la concentration [µg/µL] des échantillons inconnus.
    8. Pour déterminer la quantité de contenu de la balise par moyenne de poids mouche, utilisez la formule suivante :
      figure-protocol-4
      Remarque : dans ce protocole, 3 mouches étaient hachées dans 600 µL de PBT ; en conséquence, le volume moyen par mouche est 200 µL.
  4. Analyse de Bradford et la normalisation du contenu de la balise avec la teneur en protéines
    1. préparer sept 100 µL de l’albumine sérique bovine (BSA) dilutions standard (75 µg/mL ; 100 µg/mL ; 150 µg/mL, 200 µg/mL ; 250 µg/mL ; 500 µg/mL ; 1 000 µg/mL) avec le PBT.
    2. Prendre une nouvelle plaque de 96 puits et charger 200 µL de réactif de Bradford X 1 dans chaque ligne de la plaque.
    3. Dans le premier puits de la première ligne, ajouter 10 µL de PBT pour créer un espace vide. La composition de pipetage de haut en bas. Éviter la formation de bulles.
    4. Ajouter 10 µL de chaque dilution standard dans les autres puits de la première ligne et mix par pipetage de haut en bas. Éviter la formation de bulles.
    5. à l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 10 µL de la volée de surnageante de chaque ligne de la plaque de hachage dans la ligne correspondante dans la plaque à 96 puits. Pipetter en haut et en bas pour bien mélanger. Éviter la formation de bulles.
    6. Placer un papier perméable au gaz sur le dessus de la plaque à 96 puits.
    7. Incuber la plaque à température ambiante pendant 5 min. S’il existe des bulles dans les puits, centrifuger la plaque pendant 2 min à 2 000 x g pour les supprimer.
      Remarque : La présence de bulles gêne la lecture de l’absorbance.
    8. Utiliser un spectrophotomètre à lire l’absorbance de l’essai à blanc, des normes et des échantillons inconnus à 595 nm. Utiliser la courbe d’étalonnage pour déterminer les concentrations [µg/µL] des échantillons dans chaque ligne.
    9. Normaliser la balise content avec la teneur en protéines à l’aide de la formule suivante :
      figure-protocol-5

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Résultats

Chez d. melanogaster, comme c’est le cas avec d’autres espèces, il y un dimorphisme sexuel entre mâles et femelles22. Il est bien connu que les femelles sont plus grandes, avec plus de gras dans leur abdomen, que les hommes22. Pour tester l’efficacité de notre protocole, nous avons effectué TAG tests afin de déterminer les différences dans le contenu de la balise entre mâles et femelles de laboratoire standard type sauvage (w

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Discussion

Induction de l’obésité chez la souris peut prendre des mois19,20. Chez les mouches, ce HFD, protocole d’alimentation permet d’induction de l’accumulation de graisse excédentaire dans une affaire de jours ou moins, entraînant des augmentations dans l’accumulation de graisse seulement après 18 h (voir Figure 2). HFD alimentation avec le protocole décrit augmente le glucose contenu 12 et diminue la lipase Bmm...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Erika Taylor pour l’édition de ce manuscrit. Ce travail a été financé par des subventions accordées par le National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 et HL054732 R01) à R.B., un supplément de recherche postdoctorale (R01 HL085481) et la bourse (AAUW) à S.B.D. et aux dons de l’American Heart Association à S.B.D. et R.T.B.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Talboys Compte-gouttes/distributeurs de billesTalboys #: 930150
Homogénéisateur à haut débitTalboys #: 930145
billes de broyage, acier inoxydable.OPS Diagnostics, LLC# GBSS 156-5000-015000 billes
Masterblock 96 Microplaques profondesde puits Greiner Bio-One# T-3058-1caisse de 80 plaques
Greiner  ; Microplaque à fond plat de 96 puitsSigma Aldrich# M443640 plaques
Greiner CapMat pour l’étanchéité des plaques multipuitsSigma Aldrich# C360650 plaques d’étanchéité
Réservoirs de réactifs& nbsp ;Thomas Scientific# 1192T7112/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040Thermo Scientific# 46610401-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070Thermo Scientific# 466107030-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020Thermo Scientific#466102010-100ul multipipette
multicanaux pointesDenville Scientific Inc# P3131-Spour pipette de 10 uL
Pointes multicanauxDenville Scientific Inc# P3133-Spour pipette de 200 uL
Pointes multicanauxDenville Scientific Inc#P1125pour pipette de 100 uL
PinceRoboz Surgical# 5 DumontsPince super fine
Mettler Toledo Excellence XS Balance analytique N° de fabricant# XS64Cole-Parmer experts scientifiques# EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Balance à chargement par le hautCole-Parmer experts scientifiques# EW-11333-49
Microplaque à 96 puits CentrifugeuseHettich Zentrifugen# Rotina 420R
Microplaque LecteurDispositifs moléculaires# SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker IncubatorBiostad# 3527
Infinity Réactif de triglycéridesThermo Scientific# TR22421
Étalon de triglycéridesStanbio#2103 - 030
Démarrage rapide Bradford Protein AssayBio-RAD#500-02051x réactif de colorant
Huile de cocoNutiva# 69275220001415 0z pot
PBS 10XThermo Scientific# AM9625500 ml
Triton X-100Sigma Aldrich# 9002-93-1
Feuille perméable aux gazMacherey-Nagel# 74067550 pièces
Papier filtreVWR# 28317-241Paquet de 100
flacons dedrosophileGenesee ScientificCat # : 32-116SB
Démarrage rapide Sérum bovin Albumine StandardBio-Rad# 5000206
FlyNap AnesthésiqueCarolina# 173025100 mL
Kimwipes Low-LintUline# S-81151 pli, 4,4 x 8,4
"

Références

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