Article de méthode

Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

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DOI :

10.3791/56035

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1 février 2018

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Dans cet article

Résumé

Gènes essentiels à la survie posent des obstacles techniques pour créer des lignées mutantes. Saute-mouton contourne la létalité en combinant génome édition avec la transplantation de cellules germinales primordiales pour créer des animaux sauvage porteurs de mutations germinales. Brûler les étapes permet également la génération efficace des homozygotes mutants null dans la génération de1 F. Ici, l’étape de la transplantation est démontrée.

Résumé

La création de lignées mutantes en éditant de génome s’accélère l’analyse génétique chez de nombreux organismes. Méthodes CRISPR/Cas9 ont été adaptés à l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, un organisme modèle de longue date pour la recherche biomédicale. Régimes de reproduction traditionnelle pour la création de lignées mutantes homozygotes avec mutagénèse CRISPR/Cas9-ciblés ont plusieurs étapes longues et laborieuses. Pour faciliter la création d’embryons mutants, notamment pour surmonter les obstacles associés à assommer les gènes qui sont essentiels pour l’embryogénèse, une nouvelle méthode appelée Bond a été développée. Cette technique s’appuie sur la robustesse des embryons de Xenopus à « copier / coller » méthodes embryologiques. Saute-mouton utilise le transfert de cellules germinales primordiales (PGC) provenant d’embryons de donneurs efficacement-mutagénisées tant en frères et sœurs PGC-ablation de type sauvage. Cette méthode permet une mutation efficace de gènes essentiels en créant des animaux chimériques avec cellules somatiques de type sauvage qui transportent un mutant germline. Lorsque deux animaux de0 F porteurs « leapfrog greffes » (c'est-à-dire, les cellules germinales mutant) sont intercroisées, ils produisent des homozygotes, ou hétérozygotes, null F1 embryons, sauvant ainsi un temps de génération complet pour obtenir des données phénotypiques. Saute-mouton fournit également une nouvelle approche pour l’analyse des gènes effet maternel qui sont réfractaires à l’analyse phénotypique0 F suite CRISPR/Cas9 mutagenèse. Ce manuscrit détaille la méthode de brûler les étapes, avec un accent particulier sur la façon de réaliser avec succès la transplantation du PGC.

Introduction

Comment le génotype encode phénotype a été une question majeure en biologie depuis la redécouverte des lois de Mendel. Comprendre les rôles des gènes, leur régulation et interactions au sein des réseaux de gènes et les fonctions des promesses de produits codés de fournir des outils pour découvrir nouvelle biologie et amélioration des états pathologiques. Pour plus d’un demi siècle1, l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, a été un modèle pour les études sur un large éventail de sujets en biologie fondamentale et de la biomédecine, y compris le contrôle génétique du développement. Historiquement, la plupart des recherches sur Xenopus a utilisé la grenouille allotétraploïde, X. laevis, mais plus récemment, en raison de la diploïdie, X. tropicalis a été conçu comme un modèle génétique amphibie. Séquences de génomes complets ont été assemblés entre les deux espèces de Xenopus 2,3. La « communauté de la grenouille » est maintenant à un moment charnière où la technologie de modification du génome de base permet l’étude de la fonction des gènes, pratiquement à volonté. Programmable CRISPR/Cas9 endonucléases ont fait la mutagénèse de gènes très efficace, avec mutations bialléliques possible dans la plupart des cellules de l’animal4,5,6,7, 8,9,10,11. Ces études, mise en évidence par Blais et al. 12 et Shigeta et al. 13, ont montré que la fonction de plusieurs gènes peut être étudiée par mutagenèse chez les animaux de mosaïque de0 F. Cette approche présente de nombreux avantages ; Cependant, embryons Cas9-sgRNA-micro affichent souvent des phénotypes variables en raison de la perte incomplète de la fonction (LOF). Plus important encore, la génération des lignées mutantes est très avantageuse pour certaines applications, en particulier lorsque l'on étudie les gènes qui ont une contribution d’ARNm maternels. ARNm maternels et protéines et leurs influences sur l’épigénétique, persistent pendant une longue période dans l’embryogenèse14,15,16, rendant les contributions du développement précoces de plusieurs gènes réfractaire aux analyses de0 F. Par conséquent, les autres approches LOF sont nécessaires.

Lorsqu’on cherche à créer des lignées mutantes, le chemin d’accès à l’obtention d’embryons homozygotes de LOF a plusieurs obstacles. Mutagenèse tout d’abord, efficace pour produire des mutations bialléliques peut être désavantageux car perte des fonctions des gènes essentiels se traduit par l’incapacité à survivre à la maturité sexuelle, interférant avec la production d’une ligne viable. Une solution commune est le titrage minutieux d’un montant de Cas9-sgRNA envoyée. Ici, l’objectif est d’atteindre un équilibre entre réduction de létalité tout en optimisant également l’efficacité de la lignée germinale mutagenèse. Un autre problème se pose du schéma standard d’élevage, où les analyses phénotypiques sont différés jusqu'à la génération de2 F. À l’aide de l’approche standard, sexuellement matures animaux de0 F qui transmettent mutant allèles par le biais de la lignée germinale sont croisées pour produire des F1 hétérozygote « entreprises », qui sont ensuite cultivées à la maturité sexuelle. Deux hétérozygotes de1 F sont ensuite intercroisées pour produire des embryons mutants, F2 à une fréquence mendélienne prévue de 25 %. Ainsi, deux générations d’élevage sont nécessaires pour l’analyse des phénotypes mutants. Animaux mutants pourrait être homozygotes ou hétérozygotes (c.-à-d. descendants contenant deux allèles mutants différents, qui dépend des génotypes des parents animaux utilisés dans la population de1 F).

Ces obstacles peuvent être surmontés en limitant programmable mutagenèse induite par la nucléase de cellules germinales, qui sous-tend une nouvelle méthode appelée former17. Saute-mouton possède deux composantes principales : (1) la microinjection des ARNm de Cas ainsi que sgRNA ou nucléase-sgRNA complexes (ou, en principe, TALENs ou zinc nucléases de doigt) au stade unicellulaire de mutagenize efficacement les génomes embryonnaires, suivie (2) la transplantation de PGC dans des embryons de frère de type sauvage, où le PGC endogènes ont été supprimés. Quand les deux étapes sont le remplacement de germline efficace, complète avec les cellules germinales mutantes peut être obtenue. Blackler démontré dans les années 1960 que Xenopus PGC pourrait être transplanté entre embryons à la neurula fin et18,de stades précoces tailbud19. Pour brûler les étapes, l’approche de Blackler modification en effectuant les transplantations d’organes au stade blastula17, lorsque PGC est localisées dans le pôle végétal de l’embryon20,21. Transplantation avant la gastrulation a deux principaux avantages. Tout d’abord, la prise de greffe des greffes et le développement subséquent de normal s’est avéré plus efficace lorsque la greffe est réalisée au stade blastula (inédites). Deuxièmement, en effectuant des transplantations d’organes stade blastula peu après que transcription zygotique a commencé, on peut éviter la létalité découlant du développement génétique mutations qui perturbent la gastrulation, ou qui autrement mener à neurula fin malformé. PGC transplantation portant les embryons (« leapfrogged ») sont cultivés à la maturité sexuelle, et les croisements entre ces animaux de0 F ont démontré que, dans bien des cas, 100 % de la progéniture de1 F afficher le phénotype LOF (la plupart étant composé hétérozygotes), indiquant la lignée germinale complète de remplacement avec les mutations ciblées.

Il est prévu que Bond s’accélérera les approches génétiques chez Xenopus. Brûler les étapes prévoit également une alternative à la méthode de « transfert d’accueil »22 pour l’analyse LOF des gènes effet maternel (inédites). Dans la présente publication, une description détaillée de la méthode, en focalisant sur la transplantation de PGC, est présentée dans X. tropicalis (avec des modifications mineures pour X. laevis). La transplantation du PGC est démontrée ici, pour faciliter un transfert plus rapid de cette technologie à d’autres laboratoires qui travaillent avec Xenopus. Les principes de cette méthode doivent être réussies chez les autres amphibiens (p. ex., urodèles), et modifications de l’organisme-spécifiques dans la méthodologie devraient permettre pour application à de nombreux autres animaux dont mutagénèse efficace peut être accompli et PGC est facilement transplantables.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université de Californie, Irvine et d’institutionnels animalier.

1. les préparations destinés à la Transplantation de PGC

  1. Préparer des outils de dissection à l’avance, comme décrit précédemment23.
    NOTE : Couteaux de cheveux sourcil servent à faire des incisions avec l’aide d’une boucle de cheveux pour stabiliser l’embryon tout en effectuant les chirurgies. Poils des sourcils et des boucles de cheveux sont collés en verre borosilicaté, pipettes Pasteur qui ont d’abord été attiré dans une flamme et cassés sur la partie amincie (voir Figure 1 a, pointe de flèche) pour créer une pointe plus courte et plus étroite (Figure 1 b) pour une plus grande dextérité Lorsque vous effectuez des interventions chirurgicales.
  2. Générer des sgRNAs à l’aide des procédures décrites précédemment24 .
    NOTE : Brièvement, courts matrices d’ADN codant pour sgRNAs sont créés à l’aide de deoxyoligonucleotides qui se chevauchent, contenant 5' instigateurs du bactériophage T7, qui sont recuits et « rempli » par une ADN polymérase thermostable, exempt d’erreurs. Réactions de synthèse in vitro sgRNA sont incubées pendant plusieurs heures à la nuit (selon le kit utilisé). Les réactions sont traitées pour supprimer le modèle de la DNAse. Les sgRNAs sont purifiés par les méthodes usuelles de phénol/chloroforme extraction et ammonium acétate/isopropanol précipitations, selon instructions24 du fabricant kit.
  3. Peu de temps avant d’effectuer des microinjections, préparer des complexes de Cas9-sgRNA par la première dénaturation ~ 250 ng de sgRNA dans un volume total de 3 µL de RNAse-libre (traités diéthylpyrocarbonate) H2O à 60-65 ° C pendant 5 min, suivie par refroidissement rapide sur la glace pendant 5 min. Centrifuger le sgRNA pendant quelques secondes, ajouter 1 µL de 1 protéine de Cas9 µg/µL et incuber pendant 10 min à 37 ° C, pour promouvoir la formation d’un complexe.
    Remarque : Après l’incubation, le tube peut être gardé sur glace tout en préparant les embryons microinjection.
  4. Obtenir X. tropicalis embryons par fécondation in vitro à l’aide de méthodes normalisées, comme décrit précédemment25. Gelée de25,26 les embryons à 10 min après la fécondation.
    NOTE : Temps de la fécondation est considéré comme le temps après la suspension de sperme est ajoutée aux oeufs et le plat est inondé de 1/9thX modifiée sonneries (MMR)26 de Marc. X. tropicalis25, contrairement à X. laevis, effectuer la radiation gelante dans le 1/9 x MMR contenant 3 % base cystéine libre (pas le sel HCl), pH ajusté à 7,8-8.0, suivie par plusieurs lavages dans le 1/9 x MMR. Transférer les embryons dans un gel d’agarose (1 %)-enduit plat contenant 1/9 x MMR à température ambiante.
  5. Transférer immédiatement les embryons pour être injecté dans un plat enduit de gel d’agarose à 1 % contenant 1 x MMR à l’aide d’une pipette Pasteur.
  6. Injecter à l’étape 1-cellule. Voir références26,27 pour une description détaillée des méthodes de micro-injection de Xenopus .
    1. Injecter chaque embryon sur un seul site au pôle animal, avec 4 nL du complexe Cas9-sgRNA (montant final = 1 ng de Cas9 et ~ 250 pg de sgRNA ; Voir la Discussion)24. Après 10 à 20 min d’injection site guérison, transférer les embryons dans un plat recouvert d’agarose contenant 1/9 x MMR et incuber à 25 ° C. Également créer un plat de jumelle non des embryons qui serviront de receveurs de greffe.
  7. Préparer des plats de Pétri (60 mm) qui contiennent un ~ 5 mm-couche épaisse de 1 % d’agarose dans 0,3 x MMR, si faire des transplantations d’organes à X. tropicalis, ou 1 x MMR pour X. laevis.
    1. Créer des dépressions ~ 3-4 mm de profondeur en insérant un 3-x 4 puits moule (créée en coupant une plaque à 96 puits PCR) dans l’agarose fondu lorsque vous versez les plaques (voir Figure 1 et D). Maintenez le moule quelques millimètres au-dessus du fond de la boîte de Pétri à l’aide d’une pince fixée à un support de bague jusqu'à ce que l’agarose a durci.
    2. En outre, faire une plaque 24 puits à des embryons de maison individuelle en enduisant les puits avec une fine couche d’agarose à 1 % en 1/9 x MMR.
      Remarque : Le milieu de culture a ajouté à ces puits est de 1/9 x que ROR additionné de 50 µg de gentamycine sulfate/mL.

2. transplantation du PGC

  1. Quand les embryons atteignent seulement Nieuwkoop et Faber28 stade blastula 9 (Figure 2 a), ~4.5 h après la fécondation (hpf) pour X. tropicalis, retirez-les de l’incubateur de 25 ° C et laissez-les s’équilibrer à la température de la pièce pour une autre 0,5 h.
  2. Pour commencer la transplantation à 5 hpf (Figure 2 b), utiliser une pipette Pasteur pour transférer un embryon de donneur PGC (injecté avec Cas9-sgRNA) au plat 60 mm d’agarose contenant des dépressions (créées à l’étape 1.7) dans 0,3 x MMR (ou 1 x MMR si vous utilisez X. laevis). Également transférer un embryon non frère, le bénéficiaire de la greffe, de ce plat.
    Remarque : Il est essentiel que les identités de chacun de ces embryons ne sont pas confondues.
  3. Retirez l’enveloppe vitelline de chaque embryon avec une pincette et faire pivoter les deux embryons afin que leurs mâts vegetal sont en vue et accessible pour la chirurgie manuellement.
    NOTE : Une description du manuel de-vitellination des embryons a été précédemment décrit26.
  4. En utilisant le bout pointu d’un couteau de cheveux sourcil, faire des incisions peu profondes quatre sous la forme d’un carré sur le pôle végétal de l’embryon du destinataire, à l’intérieur de la zone où les cellules bouteille futurs qui jalonnent le blastopore formeront. Faire des incisions en insérant la pointe du couteau cheveux sourcil dans l’embryon, juste en dessous de la surface, puis les faire trancher vers le haut des mouvements tout en stabilisant l’embryon avec la boucle de cheveux.
    Remarque : La Figure 2 illustre végétales vues d’un embryon à moyennes sur une demi-heure d’intervalle de 4,5 à 7,0 hpf pour montrer la taille des cellules et de fournir un guide pour l’estimation où les bouteilles de cellules formeront (cercle en pointillés blanc). Le but est de faire des incisions où la boîte noire pointillée est indiquée.
  5. Une fois que les quatre côtés du carré sont délimitées par des incisions, approfondir chaque incision avec un couteau de cheveux sourcil à l’aide des requêtes similaires de coupe pour atteindre une profondeur d’environ 1/3 à 1/2 de la distance au sol blastocèle.
  6. Libérer l’explant végétal tissus de l’embryon destinataire (Figure 3 a et B) en faisant une horizontale (parallèle à la surface végétale) cliché (s) dans la région profonde végétale.
    Remarque : La taille de l’explant végétal contenant du PGC est d’environ 0,4 à 0,45 mm par côté et 0,25 à 0,3 mm de profondeur. Cette explant végétal de l’embryon du bénéficiaire n’est plus nécessaire et devrait donc être mis de côté pour être mis au rebut.
  7. Travailler rapidement, répétez cette procédure (étapes 2,4-2,6) sur l’embryon donneur PGC pour créer un fragment de tissu végétal de même taille pour une transplantation.
    Remarque : Il est important d’effectuer cette deuxième dissection avec peu de retard pour minimiser le temps de l’embryon bénéficiaire guérir sa blessure ouverte.
  8. Une fois le tissu contenant le PGC est retiré de l’embryon donneur, utiliser la boucle de couteau et de cheveux de cheveux sourcil pour déplacer cette explant dans une position dans l’ouverture créée dans l’embryon de destinataire.
    Remarque : La surface intérieure de la greffe donneur doit être orienté vers l’intérieur de l’embryon du destinataire. Il n’est pas nécessaire faire correspondre les orientations des axes dorsale-ventral et gauche-droite de la prothèse avec l’embryon destinataire.
  9. Le côté long de la tige du couteau cheveux sourcil, qui s’est tenue parallèlement à la surface de la prothèse, permet d’appuyer doucement le greffon dans l’ouverture dans la surface végétale de l’embryon destinataire.
  10. Une fois la prothèse a été placée, utiliser un hairloop ou l’arbre d’un couteau de cheveux sourcil doucement glisser la « carcasse » de l’embryon donneur sur toute la surface du gel d’agarose et dans une dépression d’agarose. Assurez-vous que la plaie ouverte de la carcasse fait face le liquide en vrac. Si ce n’est pas le cas, utilisez le couteau de cheveux sourcil pour faire pivoter l’embryon pour parvenir à cette orientation.
  11. Glissez l’embryon bénéficiaire, avec le greffon guérison en place, dans une dépression adjacente et de même s’assurer que le tissu greffé pole vegetal fait face le liquide en vrac.
  12. Répétez cette procédure (étapes 2.1-2.11) en utilisant une autre paire de donateur et bénéficiaires embryons pour créer une autre paire de transplantation/carcasse ; transférer ces dépressions vide.
    Remarque : Il est essentiel qu’on fait des notations pour garder une trace des paires appariées des carcasses et des embryons de transplantation-roulement. Les carcasses de donateurs seront utilisés comme un proxy pour l’efficacité de la mutagénèse induite par Cas9-sgRNA dans le PGC transplanté, qui ne peuvent pas être facilement dosés jusqu'à ce que les animaux porteurs de transplantation atteignent la maturité sexuelle (Voir l’étape 3.3, ci-dessous et la Discussion de ).
  13. Continuer à faire des greffes les embryons jusqu'à environ début gastrulation 10, qui est d’environ 6,5 hpf dans X. tropicalis (voir la Figure 2E).

3. après guérison soin d’embryons

NOTE : Greffes guérissent en place au sein de ~ 30 min, et il est normal d’observer quelques débris vitellus de lyse cellulaire exsudant de l’embryon (Figure 3).

  1. Une fois guéri, utiliser une pipette Pasteur pour très doucement transfert embryons de dépressions à chaque puits d’une plaque de 24 puits recouvert d’agarose. L’exsudat sera retiré (Figure 3D) par mélange durant le transfert des fluides.
    1. Faites pivoter les embryons qu’ils sont placés végétale pôles vers le haut, face à la solution en vrac. Encore une fois, placez les carcasses de donateur et greffer des destinataires dans des puits adjacents afin d’aider à garder la trace des paires de l’embryon ; enregistrer ces informations.
  2. Transférer la plaque 24 puits contenant des embryons à un incubateur de 25 ° C pour la culture au jour le jour.
    Remarque : Le jour suivant, les embryons auront atteint tailbud étapes.
  3. Déplacez les destinataires de greffe pour nettoyer les plaques de 6 puits recouvert d’agarose contenant x 1/9 que RRO additionné de 50 µg de gentamycine sulfate/mL, avec 1 embryon / puits. Tenir un registre clair des carcasses de donateurs qui correspondent à ces receveurs de greffe.
  4. Afin d’évaluer l’efficacité de la mutagénèse par séquençage PCR amplicons5,17,24 ou à l’aide d’autres méthodes qui s’appuient sur les amplimères PCR (voir la Discussion), déplacer des carcasses aux tubes de bande PCR 0,2 mL. Enlever la plupart du milieu et homogénéiser dans 100 µL lyse tampon24 contenant la protéinase K (PK) par répété pipetage va-et-vient à l’aide d’une pipette de P200.
  5. Effectuer l’embryon lyse24 à 56 ° C pendant 6 h à la nuit pour permettre la digestion PK. Inactiver PK en le chauffant à 90-95 ° C pendant 10 min, suivie d’un refroidissement rapide à 4 ° C. Utilisez les lysats sans autres étapes de nettoyage pour amorcer les réactions de PCR pour obtenir des amplicons courts pour direct de séquençage ADN Sanger24. Stocker les lysats à-20 ° C.
    NOTE : Quelques jours après, les têtards atteindront alimentation stades (environ étape 45-46) et peuvent être nourris avec une suspension de poudre planctonique (sérums Micron).
  6. Après environ 1 semaine, avec des variations quotidiennes de milieu de culture pour maintenir la propreté et de minimiser la prolifération microbienne, déplacer les têtards à petits réservoirs dans un circuit aquatique avec écoulement goutte à goutte. Les données de séquençage permet de séparer les têtards avec fortement efficacement mutagénisé PGC de têtards avec une efficacité moindre mutagenèse. Une fois la métamorphose terminée, déplacez les petites grenouilles au système aquatique adult dans le laboratoire.
    NOTE : Les schémas développés par la ressource nationale de Xenopus (laboratoire de Biologie Marine, Woods Hole, MA) fournissent un guide pour têtard alimentation29 et grenouille adulte maintenance30.

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Résultats

Après la transplantation, la détermination qualitative de l’efficacité de la mutagénèse CRISPR/Cas9 doit être effectuée avant de dépenser de l’effort dans l’élevage pour développer et maintenir les animaux à la maturité sexuelle. Parce que les animaux porteurs de leapfrog greffes est somatiquement type sauvage et la lignée germinale est difficile d’accès pour des mesures directes, il devient important de sauver les carcasses d’embryons de donneurs. Analyse de l’ADN de la carcasse fait off...

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Discussion

Ce rapport fournit un protocole détaillé pour la transplantation de tissu végétal contenant PGC. Transplantation de PGC est utilisé en conjonction avec les technologies de modification du génome (p. ex., CRISPR/Cas9) pour modifier les cellules germinales d’un animal tout en maintien de la quasi-totalité de ses tissus somatiques comme génétiquement le type sauvage. Pour brûler les étapes pour réussir, il y a un certain nombre de facteurs critiques à considérer avant d’effectuer des transplantations d’organes.

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Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été réalisé avec le soutien d’une subvention, 5R21HD080684-02, de l’Institut National de santé de l’enfant et le développement humain. L’auteur tient à remercier Ken Cho pour son enthousiasme et le soutien continus. L’auteur tiens également à remercier Bruce Blumberg utilisation de sa caméra, Rébecca Charney, à la lecture critique du manuscrit et Sean McNamara et Marcin Wlizla à la ressource nationale de Xenopus (RRID:SCR_013731), pour le précieux conversations au sujet de X. tropicalis d’alimentation et de régimes de protection des animaux.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pince Dumont #5Outils scientifiques fins11252-20 ou 11252-30
cheveux pour sourcilsBoucle
Pipettes Pasteur maison
, verre borosilicatéFisher Scientific13-678-20A
Colle Krazy (à base de cyanoacrylate)Elmer’s Products, Inc.KG581Pour fixer les cheveux des sourcils et les boucles de cheveux dans les pipettes Pasteur, d’autres colles similaires peuvent être utilisées.
Oligodésoxynucléotides, technologiesd’ADN intégréescommandées sur mesure Oligos modèles commandés sur mesure pour la synthèse de l’ARNsg, voir Nakayama et al., 2014 pour les détails de conception.
Kit Megascript T7Ambion/ThermoFisherAM1334Ou utilisez le kit Megashortscript T7 (AM1354)
Phénol, tamponPhénol distillé de haute qualité de n’importe quel fournisseur commercial
Chloroformede haute qualité de n’importe quel fournisseur commercial
Éthanolhaute qualité de n’importe quel fournisseur commercial
Diéthylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Chemical Co.D5758-50ML
Protéine Cas9, avec signal de localisation nucléairePNA Bio, Inc.CP01Reconstitué à partir d’eau traitée au DEPC selon les recommandations du fabricant
10X la solutionde Marc Maison. La recette (ref 26) pour 1X MMR (sans EDTA) est de 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Le pH de la solution est ajusté à 7,4.
AgaroseN’importe quelle agarose de qualité biologie moléculaire est suffisante
60 X15 mm Plaques de PétriFalcon351007
24 puitsFalcon3047
L-CysteineSigma Chemical Co.C7352-100GBase libre, pas de sel HCl
Protéinase KRoche03 115 828 001Généralement ~20mg/ml de Roche
sera MicronseraTadpole food. Remettre en suspension dans le milieu de croissance. Peut être acheté auprès d’une variété de détaillants en ligne
Couteau à pour cheveux faite maison Tris de de bagues modifiées

Références

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