Nous présentons ici des protocoles pour l’homogénéisation sans tensioactifs des cellules mammifères cultivées basé sur la cavitation de l’azote et la séparation ultérieure des protéines cytosoliques et membranaires par ultracentrifugation. Cette méthode est idéale pour la surveillance de la répartition des protéines membranaires périphériques entre soluble et fractions de membrane.
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Article de méthode
Azote Cavitation et Centrifugation différentielle permet de surveiller la Distribution des protéines membranaires périphériques dans des cellules cultivées
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules cultivées sont utiles pour étudier la distribution subcellulaire des protéines, y compris les protéines membranaires périphériques. Codé génétiquement fluorescent étiquetés protéines ont révolutionné l’étude de la distribution des protéines subcellulaire. Toutefois, il est difficile de quantifier la distribution avec la microscopie fluorescente, surtout lorsque les protéines sont partiellement cytosoliques. En outre, il est souvent important d’étudier les protéines endogènes. Biochemical tests tels que l’immuno-Blot reste l’étalon-or pour la quantification de la distribution des protéines après fractionnement subcellulaire. Bien qu’il existe des kits commerciaux visant à isoler cytosolique ou certaines fractions de la membrane, la plupart de ces kits est basée sur l’extraction avec des détergents, qui peut ne pas convenir pour l’étude des protéines membranaires périphériques qui sont facilement extraits des membranes. Nous présentons ici un protocole sans tensioactifs pour l’homogénéisation cellulaire par la cavitation de l’azote et la séparation ultérieure des protéines cytosoliques et membranaires par ultracentrifugation. Nous confirmer les fractions de granulés et de séparation des organites subcellulaires dans soluble à travers différents types de cellules et comparer l’extraction de la protéine parmi plusieurs méthodes d’homogénéisation mécanique non détergent à base commune. Parmi les nombreux avantages d’azote cavitation est l’efficacité supérieure d’une perturbation cellulaire avec un minimum de dommages physique et chimique aux organelles délicats. Combiné avec l’ultracentrifugation, cavitation d’azote est une excellente façon d’examiner le passage des protéines membranaires périphériques entre cytosolique et fractions de membrane.
Introduction
Les protéines cellulaires peuvent être divisés en deux classes : celles qui sont associées aux membranes et ceux qui ne le sont pas. Non-membrane protéines associées sont trouvent dans le cytosol, le nucléoplasme et le lumina des organites tels que le réticulum endoplasmique (re). Il y a deux classes de protéines associées aux membranes, intégrante et périphériques. Protéines intégrales de membrane sont également connu sous le nom de protéines transmembranaires parce qu’un ou plusieurs segments de la chaîne polypeptidique s’étend sur la membrane, généralement dans une hélice α composée d’acides aminés hydrophobes. Des protéines transmembranaires sont protéines insérées dans les membranes dans le cadre de leur biosynthèse et restent donc configurés jusqu'à ce qu’ils sont catabolisés. Les protéines membranaires périphériques sont secondairement poussés à membranes, généralement par suite de modification post-traductionnelle avec des molécules hydrophobes tels que les lipides. Contrairement aux protéines intégrales de membrane, la liaison des protéines membranaires périphériques avec les membranes cellulaires est réversible et peut être réglée. Nombreuses fonction de protéines membranaires périphériques dans les voies de signalisation et liaison réglementé avec membranes est un mécanisme pour activer ou inhiber une voie. Un exemple d’une molécule de signalisation qui est une protéine de membrane périphérique est la petite GTPase, RAS. Après une série de modifications post-traductionnelles qui incluent la modification avec un lipide farnésyl, mis à jour le C-terminal d’une protéine RAS mature insère dans le feuillet cytoplasmique de la membrane cellulaire. Plus précisément, la membrane plasmique est où le RAS engage son effecteur RAF1. Pour empêcher l’activation constitutive de voie de protéine mitogène-kinase (MAPK), plusieurs niveaux de contrôle de RAS sont en place. Sans compter que RAS rendu inactif par hydrolyse de GTP en PIB, RAS active aussi peut être libéré de la membrane plasmique par des modifications ou des interactions avec les facteurs pour inhiber la signalisation de solubilisation. Bien que fluorescent imagerie live offre aux biologistes cellulaires l’occasion d’observer la localisation subcellulaire des fluorescents membranaires périphériques marqués protéine protéines1, il demeure un besoin essentiel d’évaluer l’association de la membrane de protéines endogènes semi quantitativement avec des approches biochimiques simples.
Une évaluation appropriée biochimique des protéines cloisonnement entre la membrane et fractions solubles est critique dépend de deux facteurs : homogénéisation cellulaire et une séparation efficace de membrane et fractions solubles. Bien que certains protocoles, y compris les kits commercialisés plus largement utilisés, dépendent d’homogénéisation de la cellule de base de détergent, ces méthodes peuvent obscurcir l’analyse par l’extraction des protéines membranaires dans la phase soluble2. En conséquence, non détergente méthodes basés, mécaniques d’une perturbation cellulaire fournissent les résultats plus propres. Il existe plusieurs méthodes de rupture mécanique des cellules en culture ou récolte du sang ou d’organes. Il s’agit de Dounce homogénéisation, perturbation de la fine aiguille, roulement à billes homogénéisation, sonication et cavitation de l’azote. Ici, nous évaluons la cavitation d’azote et de le comparer à d’autres méthodes. Cavitation azote s’appuie sur l’azote qui est dissous dans le cytoplasme des cellules sous haute pression. Après équilibration, la suspension cellulaire est brusquement exposée à la pression atmosphérique tels que les bulles d’azote sont forment dans le cytoplasme qui déchirer la cellule en raison de leur effervescence. Si la pression est suffisamment élevée, effervescence d’azote peut perturber le noyau3 et membrane liée organites comme les lysosomes4. Toutefois, si la pression est maintenue suffisamment faible, la décompression perturbera la membrane plasmique et ER mais pas d’autres organites, déversant ainsi fois cytosol et les organites cytoplasmiques intacts dans l’homogénat désigné le cavitate5. Pour cette raison, la cavitation de l’azote est la méthode de choix pour isoler les organites comme les mitochondries et les lysosomes.
Toutefois, il est également un excellent moyen de préparer un homogénat qui peut être facilement séparé en fractions solubles et de membrane. L’appareil à pression (désormais appelé « the bomb ») utilisé au cours de la cavitation se compose d’un boîtier en acier inoxydable épais qui résiste à une pression élevée, avec une entrée pour la livraison du gaz d’azote d’un réservoir et un orifice de sortie d’une soupape de décharge réglable.
La cavitation d’azote a été utilisée pour l’homogénéisation de la cellule depuis les années 19606. En 1961, Hunter et Commerfold7 créé la cavitation de l’azote comme une option viable pour la rupture de tissus de mammifères. Depuis lors, les chercheurs ont adapté la technique à différentes cellules et tissus avec succès et cavitation de l’azote est devenu un aliment de base dans de multiples applications, y compris la membrane préparation8,9, les noyaux et les organites préparation10,11et extraction biochimique labile. Actuellement, biologistes cellulaires utilisent plus souvent les autres méthodes d’homogénéisation de la cellule parce que les avantages de l’homogénéisation de l’azote n’ont pas été largement annoncés, bombes d’azote sont chers et il y a un malentendu qui est un nombre relativement élevé de cellules Obligatoire. Protocoles de cavitation d’azote atteindre homogénats acellulaires avec noyaux intacts n’ont pas été publiés, et évaluations plus publiées volumes de 20 mL de suspension cellulaire ont été utilisées. Pour adapter cette technique classique aux besoins actuels de travailler avec petits échantillons, nous présentons un protocole modifié de cavitation azote, spécialement conçue pour les cellules cultivées. Après la cavitation de l’azote, l’homogénat est séparée en soluble (S) et les fractions membranaires (P) par centrifugation différentielle, tout d’abord avec une basse-vitesse d’essorage pour enlever les noyaux et ininterrompu de cellules, puis avec un essorage à haute vitesse (> 100 000 x g) pour séparer les membranes de la fraction soluble. Nous analysons l’efficacité de la séparation avec l’immuno-Blot et comparer la cavitation azote avec d’autres techniques de rupture mécanique. Nous étudions aussi l’effet osmotique du tampon de l’homogénéisation au cours de la cavitation de l’azote.
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Protocole
1. tampon et préparations de matériel
- Chill bombes de désorganisation cellulaire 45 mL, 15 mL tubes et ultracentrifugation tubes à 4 ° C.
- Préparer et refroidissez 25 mL de tampon d’homogénéisation par 2 x 10 7 cellules à 4 ° C. Ajouter une protéase inhibiteur pastille juste avant l’utilisation.
Remarque : Les tampons d’homogénéisation contiennent typiquement KCl plutôt que NaCl afin de mieux refléter la composition sel intracellulaire. Tampon d’homogénéisation utilisé dans le présent Protocole se compose de 10 mM HEPES à pH 7,4, KCl 10 mM et 1,5 mM MgCl 2 (ci-après dénommé le tampon hypotonique homogénéisation). La plupart des tampons peuvent être adaptées pour cavitation azote (voir Discussion). - Préparer et réfrigérer 6 mL de 1 x tampon salin Phosphate-Buffered (PBS) par échantillon à 4 ° C. Ajouter protéase inhibiteur comprimés frais avant utilisation.
NOTE : Tampon PBS utilisée dans le présent Protocole se compose de 10 mM Na 2 HPO 4 à pH 7,4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl et KCl 2,7 mM. - Préparer et réfrigérer 4 mL de tampon de solubilisation par échantillon à 4 comprimés ° C. Ajouter inhibiteur de la protéase un juste avant l’utilisation.
NOTE : Solubilisation tampon utilisé dans le présent protocole est 1 x Radioimmunoprecipitation (RIPA) tampon, qui se compose de 25 mM Tris à pH 7,4, NaCl 150 mM, SDS 0,1 %, désoxycholate de sodium 0,5 % et 1 % NP-40. Voir NOTE 4.6.
2. Récolte de cellules
- Grow 2 x 10 7 -10 x 10 cellules de culture de tissus 9 avec les recommandations des milieux de culture pour le type de cellule. En règle générale, un plat de 15 cm donne 2 x 10 7 cellules HEK-293 en DMEM à confluence de 90 % ( Figure 1).
- Supprimer le milieu de croissance par le vide.
- Pour les cellules adhérentes, placez les récipients de culture sur la glace, laver les cellules directement sur les récipients de culture doucement avec un tampon homogénéisation réfrigéré deux fois (10 mL de tampon par plat de 15 cm par lavage) et récolter les cellules avec un grattoir à grandes cellules dans un volume approprié de tampon d’homogénéisation ; Pour les cellules en suspension, recueillir et laver le culot cellulaire en homogénéisation réfrigérés tampon deux fois (10 mL de tampon par culture de 50 mL par lavage) avec spin g x 500 à 4 ° C pendant 5 min et Resuspendre le culot de cellules lavées dans un volume suffisant de tampon homogénéisation sur glace.
Remarque : le volume devrait être fondé sur les exigences relatives à la concentration de protéines dans les expériences prévues, mais aussi le volume minimal/maximal autorisé dans la bombe de désorganisation cellulaire. De manière générale est 2-10 x 10 7 cellules/mL, ou environ 10 volumes de la cellule de granule. Ce protocole est optimisé pour les trois plats de 15 cm de cellules HEK-293 dans 2 mL de tampon d’homogénéisation.
3. Cavitation azote
plaque- transfert la suspension cellulaire à une bombe propre et refroidie dans un bain de glace sur un émoi.
ATTENTION : La bombe a haute pression, basse température, l’azote gazeux – porter une protection personnelle appropriée . - Placer une barre de micro agitation magnétique à l’intérieur de la bombe et tourner sur la plaque de remuer pour maintenir l’homogénéité de la suspension.
- Ajouter un comprimé d’inhibiteur de protéase à la suspension et fermez la bombe par fabricant ' instruction de s.
- Progressivement pressuriser la bombe avec une bouteille de gaz azote par fabricant ' s instruction jusqu'à ce que le manomètre de bombe lit 300 à 600 lb/po2. Fermer toutes les vannes et débrancher le réservoir d’azote.
Remarque : La pression nécessaire peut varier selon le type de cellule. Ici, nous avons effectué la cavitation à 350 à 400 lb/po2 pour cellules HEK-293, NIH-3 t 3 et Jurkat. - Attendre 20 min permettre à l’azote à dissoudre et à atteindre l’équilibre au sein des cellules.
- Enlever les excès d’eau autour de la soupape de décharge à l’aide d’une serviette. Ouvrir la vanne de décharge doucement afin d’obtenir une libération goutte à goutte de l’homogénat et recueillir dans un tube préalablement réfrigérées 15 mL.
NOTE : Vers la fin de la collection il y aura une poussée de l’homogénat et gaz verront le jour avec un sifflement. Assurez-vous que le gaz n’est pas cause perçue antérieurement cavitation pour tirer hors du tube (d'où l’utilisation de 15 mL tubes au lieu de tubes de 1,5 mL). Une fois la Poussée commence, fermer la vanne au refoulement et ouvrez le robinet d’arrivé d’azote brusquement pour dépressuriser la bombe et d’atteindre la cavitation des cellules restantes dans la bombe. Ouvrir la bombe pour cavitation récupération et nettoyage en profondeur.
Remarque : Le cavitate final doit avoir un aspect laiteux avec de la mousse sur le dessus. Remuer doucement avec une pointe de pipette pour permettre à la mousse à se calmer avant la centrifugation.
NOTE : Examiner la cavitate par microscopie à contraste de phase pour déterminer l’efficacité de l’homogénéisation. Ajouter une goutte de 15 µL de cavitation à la surface d’une lame de microscope et recouvrir d’un lamelle couvre-objet. Répétez l’étape 3.4-3.6 que si trop de cellules ininterrompues sont détectés avec un objectif 20 X.
Remarque : Si le tampon d’homogénéisation ne contient-elle pas d’EDTA ou l’EGTA, ajoutez-le à la collecte cavitation à une concentration finale de 1 mM à 5 min après le congé.
4. Séparation des Fractions de Membrane et de Cytosolic
- centrifugeuse le cavitate à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les cellules ininterrompues et noyaux.
Remarque : Répétez l’étape de centrifugation jusqu'à ce qu’aucun culot visible n’est produite et recueillir le surnageant nucléaire Post (PNS) tout en évitant la mousse flottante sur le dessus. Re-Centrifuger la mousse pour rassembler et combiner PNS, si nécessaire ( Figure 1). - Traiter les PNS comme vous le souhaitez pour obtenir des fractions d’intérêt. Dans le but de séparer cytosolique et fractions membranaires, transférer le PNS dans un tube d’ultracentrifugeuse et effectuer ultracentrifugation comme vous le souhaitez. Ce protocole est optimisé pour un < 3,5 mL d’échantillon dans un tube d’ultracentrifugation en polycarbonate et d’ultracentrifugation à 350 000 x g pendant 1 h à 4 ° C.
- Recueillir le surnageant (la fraction S) à l’aide d’une pipette de 1 mL.
- Rincer soigneusement le culot avec 3 mL de PBS froid sans déranger il. Supprimer le PBS par vide.
Remarque : Si la contamination de la fraction de membrane de protéines cytosoliques est un plus grand souci que la perte d’échantillon, resuspendre le culot dans 3 mL de PBS et re-ultracentrifuge comme à l’étape 4.2 froid. Supprimer le PBS par vide. - Resuspendre le culot entièrement dans un volume approprié de détergent contenant des tampons de solubilisation de choix. Pour obtenir l’équivalence de la cellule, utilisez le même volume de tampon de solubilisation dans le cytosol.
NOTE : Nous recommandons d’utiliser 1 x RIPA tampon tampon de solubilisation pour extraction de protéine de membrane efficace. Si aucun test en aval n’est nécessaire pour la fraction de membrane, utiliser 1 x laemmli solution tampon d’extraction de protéine de membrane maximale.
NOTE : Nous vous suggérons délogeant et transvaser l’extrait concentré dans un tampon de solubilisation dans un tube propre sur un rotateur de tube à 4 ° C pour l’extraction de protéines membranaires maximale.
Remarque : Si la pastille est trop collantes (trop de lipides) à supprimer efficacement du thtube d’ultracentrifugeuse e dans un tampon de solubilisation, nous suggérons de clin d’oeil le culot de congélation dans l’azote liquide et déloger rapidement le culot du tube ultracentrifugeuse avec une spatule métallique minie avant le culot dégèle.
NOTE : Alternativement, boulettes de membrane peuvent être simplement remis en suspension et pas solubilisées dans un tampon contenant un détergent pas à produire une fraction P de suspension de vésicules de membrane, dans ce cas la centrifugation étape en 4.6 n’est pas requis. Ces fractions de P sont utiles lors de la vérification des fonctions telles que l’activité enzymatique qui dépendent de l’association de la membrane. - Centrifuger la suspension entièrement solubilisée pellet de l’étape 4,5 à 20 000 x g dans une centrifugeuse de table pendant 10 min à 4 ° C. recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL (la fraction de P) et jetez le culot (lipides insolubles).
- Effectuer des tests souhaitées comme Éponger occidental avec les fractions cytosoliques ou membrane, ou enregistrez-les à-80 ° C pour une utilisation future.
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Résultats
La figure 2 illustre la répartition des protéines cellulaires de PNS dans le cytosol soluble (S) ou d’une fraction membranaire de pellet (P). Nous avons examiné trois lignées représentatives de différents types de cellules : cellules HEK-293 (épithéliale), NIH-3 t 3 (fibroblastes) et Jurkat (lymphocytes). Inhibiteur de Dissociation de Guanine Rho (RhoGDI) et indépendante des cations mannose-6-phosphate récepteur (CIMPR) ont été utilisés comme témoins positifs...
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Discussion
Les avantages de cavitation d’azote par rapport aux autres méthodes de perturbation mécanique sont multiples. Peut-être l’avantage le plus significatif est sa capacité d’homogénéiser doucement mais efficacement les spécimens. Les principes physiques de décompression cools échantillons au lieu de générer dommages thermiques locales comme ultrasons et frottement/cisaillage des techniques basées sur. La cavitation est également extrêmement efficace à perturber la membrane plasmique. Parce que l’azote bulles sont générés au ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Remerciements
Ce travail a été financé par GM055279, CA116034 et CA163489.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Vaisseau de rupture cellulaire (45 mL) | Parr Instrument | 4639 | Bombe à cavitation d’azote |
| Homogénéisateur Dounce (2 mL) | Kontes | 885300-0002 | Pilon et tube Dounce |
| U-100 Seringue à insuline 28G½ ; | Anticorps Becton Dickinson | 329461 | Needle |
| Atg12 Anticorps | Santa Cruz | 271688 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| bêta-actine | Santa Cruz | 47778 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| bêta ;-tubuline Anticorps | DSHB | E7-s | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:5000 |
| Anticorps contre la calnexine | Santa Cruz | 23954 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps anti-calréguline | Santa Cruz | 373863 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps contre la catalase | Santa Cruz | 271803 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps CIMPR | Abcam | 124767 | Anticorps de lapin, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps EEA1 | Santa Cruz | 137130 | Anticorps de souris, à utiliser à dilution 1:1000 |
| Anticorps EGFR | Santa Cruz | 373746 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution 1:1000 |
| F0-ATPase Anticorps | Cruz 514419 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 | |
| Anticorps F1-ATPase | Santa Cruz | 55597 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps contre | la fibrillarineAnticorps de souris Santa Cruz | 374022 | , utilisation à dilution 1:200 |
| Anticorps Golgin 97 Anticorps | Santa Cruz | 59820 | Anticorps de souris, utilisation à dilution 1:1000 |
| Anticorps HDAC1 | Santa Cruz | 81598 | Anticorps de souris, utilisation à dilution 1:1000 |
| Anticorps Hexokinase 1 | Technologie de signalisation cellulaire | 2024S | Anticorps de lapin, utilisation à dilution 1:1000 |
| Anticorps | Lamin A/CSanta Cruz | 376248 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps LAMP1 | DSHB | H4A3-c | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Na+/K+ Anticorps ATPase | Santa Cruz | 48345 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps Rab7 Anticorps | Abcam | 137029 | Anticorps de lapin, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Rab9 anticorps | Thermo | MA3-067 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps RCAS1 Anticorps | de Santa Cruz | 398052 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps RhoGDI | Santa Cruz | 360 | Anticorps de lapin, à utiliser à une dilution de 1:3000 |
| Anticorps anti-protéine ribosomique S6 | Santa Cruz | 74459 | Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000 |
| Anticorps Sec61a | Anticorps de chèvre Santa Cruz | 12322 | utilisation à dilution 1:1000 |
| Tube d’ultracentrifugation en polycarbonate à paroi épaisse | Beckman Coulter | 349622 | Tube d’échantillonnage pour l’ultracentrifugation |
| Rotor TLK-100.3 | Rotor Beckman Coulter | 349481 | pour l’ultracentrifugation |
| Optima MAX Ultracentrifugeuse personnelle haute capacité | Beckman Coulter | 364300 | ultracentrifugeuse |
| Comprimés cocktail d’inhibiteurs de protéase | Roche | 11697498001 | Inhibiteurs de protéase |
| Roche Grattoirs cellulaires avec poignée de 25 cm et lame de 3,0 cm | Grattoir à grandes cellules | Corning | 353089 |
| Barre d’agitation magnétique | Fisher Scientific | 14-513-57SIX | micro barre d’agitation |
| Agitateur magnétique en céramique | Fisher Scientific | S504501AS |
Références
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Réimpressions et autorisations
