Azote Cavitation et Centrifugation différentielle permet de surveiller la Distribution des protéines membranaires périphériques dans des cellules cultivées

Résumé

Nous présentons ici des protocoles pour l’homogénéisation sans tensioactifs des cellules mammifères cultivées basé sur la cavitation de l’azote et la séparation ultérieure des protéines cytosoliques et membranaires par ultracentrifugation. Cette méthode est idéale pour la surveillance de la répartition des protéines membranaires périphériques entre soluble et fractions de membrane.

Résumé

Les cellules cultivées sont utiles pour étudier la distribution subcellulaire des protéines, y compris les protéines membranaires périphériques. Codé génétiquement fluorescent étiquetés protéines ont révolutionné l’étude de la distribution des protéines subcellulaire. Toutefois, il est difficile de quantifier la distribution avec la microscopie fluorescente, surtout lorsque les protéines sont partiellement cytosoliques. En outre, il est souvent important d’étudier les protéines endogènes. Biochemical tests tels que l’immuno-Blot reste l’étalon-or pour la quantification de la distribution des protéines après fractionnement subcellulaire. Bien qu’il existe des kits commerciaux visant à isoler cytosolique ou certaines fractions de la membrane, la plupart de ces kits est basée sur l’extraction avec des détergents, qui peut ne pas convenir pour l’étude des protéines membranaires périphériques qui sont facilement extraits des membranes. Nous présentons ici un protocole sans tensioactifs pour l’homogénéisation cellulaire par la cavitation de l’azote et la séparation ultérieure des protéines cytosoliques et membranaires par ultracentrifugation. Nous confirmer les fractions de granulés et de séparation des organites subcellulaires dans soluble à travers différents types de cellules et comparer l’extraction de la protéine parmi plusieurs méthodes d’homogénéisation mécanique non détergent à base commune. Parmi les nombreux avantages d’azote cavitation est l’efficacité supérieure d’une perturbation cellulaire avec un minimum de dommages physique et chimique aux organelles délicats. Combiné avec l’ultracentrifugation, cavitation d’azote est une excellente façon d’examiner le passage des protéines membranaires périphériques entre cytosolique et fractions de membrane.

Introduction

Les protéines cellulaires peuvent être divisés en deux classes : celles qui sont associées aux membranes et ceux qui ne le sont pas. Non-membrane protéines associées sont trouvent dans le cytosol, le nucléoplasme et le lumina des organites tels que le réticulum endoplasmique (re). Il y a deux classes de protéines associées aux membranes, intégrante et périphériques. Protéines intégrales de membrane sont également connu sous le nom de protéines transmembranaires parce qu’un ou plusieurs segments de la chaîne polypeptidique s’étend sur la membrane, généralement dans une hélice α composée d’acides aminés hydrophobes. Des protéines transmembranaires sont protéines insérée....

Protocole

1. tampon et préparations de matériel

1. Chill bombes de désorganisation cellulaire 45 mL, 15 mL tubes et ultracentrifugation tubes à 4 ° C.
2. Préparer et refroidissez 25 mL de tampon d’homogénéisation par 2 x 10 ⁷ cellules à 4 ° C. Ajouter une protéase inhibiteur pastille juste avant l’utilisation.
   Remarque : Les tampons d’homogénéisation contiennent typiquement KCl plutôt que NaCl afin de mieux refléter la composition sel intracellulaire. Tampon d’homogénéisation utilisé dans le présent Protocole se compose de 10 mM HEPES à pH 7,4, KCl 10 mM et 1,5 mM MgCl ₂ (ci-après dénommé le tampon hypotonique homogénéisation). La plu....

Résultats

La figure 2 illustre la répartition des protéines cellulaires de PNS dans le cytosol soluble (S) ou d’une fraction membranaire de pellet (P). Nous avons examiné trois lignées représentatives de différents types de cellules : cellules HEK-293 (épithéliale), NIH-3 t 3 (fibroblastes) et Jurkat (lymphocytes). Inhibiteur de Dissociation de Guanine Rho (RhoGDI) et indépendante des cations mannose-6-phosphate récepteur (CIMPR) ont été utilisés comme témoins positifs.......

Discussion

Les avantages de cavitation d’azote par rapport aux autres méthodes de perturbation mécanique sont multiples. Peut-être l’avantage le plus significatif est sa capacité d’homogénéiser doucement mais efficacement les spécimens. Les principes physiques de décompression cools échantillons au lieu de générer dommages thermiques locales comme ultrasons et frottement/cisaillage des techniques basées sur. La cavitation est également extrêmement efficace à perturber la membrane plasmique. Parce que l’azote bulles sont générés au .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vaisseau de rupture cellulaire (45 mL)	Parr Instrument	4639	Bombe à cavitation d’azote
Homogénéisateur Dounce (2 mL)	Kontes	885300-0002	Pilon et tube Dounce
U-100 Seringue à insuline 28G½ ;	Anticorps Becton Dickinson	329461	Needle
Atg12 Anticorps	Santa Cruz	271688	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
bêta-actine	Santa Cruz	47778	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
bêta ;-tubuline Anticorps	DSHB	E7-s	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:5000
Anticorps contre la calnexine	Santa Cruz	23954	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps anti-calréguline	Santa Cruz	373863	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps contre la catalase	Santa Cruz	271803	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps CIMPR	Abcam	124767	Anticorps de lapin, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps EEA1	Santa Cruz	137130	Anticorps de souris, à utiliser à dilution 1:1000
Anticorps EGFR	Santa Cruz	373746	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution 1:1000
F0-ATPase Anticorps	Cruz 514419		Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps F1-ATPase	Santa Cruz	55597	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps contre	la fibrillarineAnticorps de souris Santa Cruz	374022	, utilisation à dilution 1:200
Anticorps Golgin 97 Anticorps	Santa Cruz	59820	Anticorps de souris, utilisation à dilution 1:1000
Anticorps HDAC1	Santa Cruz	81598	Anticorps de souris, utilisation à dilution 1:1000
Anticorps Hexokinase 1	Technologie de signalisation cellulaire	2024S	Anticorps de lapin, utilisation à dilution 1:1000
Anticorps	Lamin A/CSanta Cruz	376248	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps LAMP1	DSHB	H4A3-c	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Na+/K+ Anticorps ATPase	Santa Cruz	48345	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps Rab7 Anticorps	Abcam	137029	Anticorps de lapin, à utiliser à une dilution de 1:1000
Rab9 anticorps	Thermo	MA3-067	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps RCAS1 Anticorps	de Santa Cruz	398052	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps RhoGDI	Santa Cruz	360	Anticorps de lapin, à utiliser à une dilution de 1:3000
Anticorps anti-protéine ribosomique S6	Santa Cruz	74459	Anticorps de souris, à utiliser à une dilution de 1:1000
Anticorps Sec61a	Anticorps de chèvre Santa Cruz	12322	utilisation à dilution 1:1000
Tube d’ultracentrifugation en polycarbonate à paroi épaisse	Beckman Coulter	349622	Tube d’échantillonnage pour l’ultracentrifugation
Rotor TLK-100.3	Rotor Beckman Coulter	349481	pour l’ultracentrifugation
Optima MAX Ultracentrifugeuse personnelle haute capacité	Beckman Coulter	364300	ultracentrifugeuse
Comprimés cocktail d’inhibiteurs de protéase	Roche	11697498001	Inhibiteurs de protéase
Roche Grattoirs cellulaires avec poignée de 25 cm et lame de 3,0 cm	Grattoir à grandes cellules	Corning	353089
Barre d’agitation magnétique	Fisher Scientific	14-513-57SIX	micro barre d’agitation
Agitateur magnétique en céramique	Fisher Scientific	S504501AS

Anticorps contre la & Santa ,