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Article de méthode

Nanotubes d’ADN comme un outil polyvalent pour l’étude des polymères semi-flexibles

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DOI :

10.3791/56056

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25 octobre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Polymères semi-flexibles affichent des propriétés mécaniques uniques qui sont largement appliquées par les systèmes vivants. Toutefois, des études systématiques sur les biopolymères sont limitées puisque les propriétés telles que la rigidité de polymère sont inaccessibles. Ce manuscrit décrit comment cette limitation est contournée par programmable ADN nanotubes, permettant des études expérimentales sur l’impact de la rigidité du filament.

Résumé

Les propriétés mécaniques de la matière molle complexe, à base de polymères, tels que les cellules ou les réseaux de biopolymère, peuvent être comprises dans ni le cadre classique des polymères flexibles, ni de tiges rigides. Filaments sous-jacente restent tendus en raison de leur rigidité de la colonne vertébrale non-en voie de disparition, qui est quantifiée par la longueur de persistance (l,p), mais ils sont également soumis à fortes fluctuations thermiques. Leur rigidité en flexion finie mène à mécanique collective unique, non trivial de réseaux en vrac, ce qui permet la formation d’échafaudages stables à des fractions de faible volume, tout en offrant des tailles de mailles larges. Ce principe est répandu dans la nature (p. ex., dans les cellules ou les tissus), pour réduire le contenu moléculaire élevé et ce qui facilite diffusive ou transport actif. En raison de leurs implications biologiques et des applications technologiques potentielles dans les hydrogels biocompatibles, semi-flexibles polymères ont fait l’objet de nombreuses études. Cependant, enquêtes compréhensibles est resté difficiles puisqu’ils s’appuyaient sur des polymères naturels, tels que les filaments d’actine, qui ne sont pas librement réglables. Malgré ces limites et en raison du manque de polymères synthétiques et mécaniquement accordables semi-flexibles, filaments d’actine ont été établis sous le régime de modèle commun. Une limitation majeure est que la quantité central lp ne peut pas être librement à l’écoute afin d’étudier son impact sur les structures macroscopiques en vrac. Cette limitation a été résolue en employant des nanotubes ADN structurellement programmables, permettant la modification contrôlée de la raideur du filament. Elles sont constituées par des conceptions basées sur les carreaux, où un ensemble discret de brins partiellement complémentaires s’hybrident dans une structure d’anneau avec une circonférence de discrète. Ces anneaux disposent les extrémités cohésives, permettant la polymérisation efficace en filaments de quelques microns de longueur et affiche similaires cinétique de polymérisation sous forme de biopolymères naturels. En raison de leur mécanique programmable, ces tubes sont polyvalents, de nouveaux outils pour étudier l’impact de lp sur la molécule unique ainsi que l’échelle en vrac. Contrairement aux filaments d’actine, ils restent stables au cours des semaines, sans dégénérescence notable, et leur manipulation est relativement simple.

Introduction

En raison des comportements complexes activés par leurs propriétés mécaniques uniques, polymères semi-flexibles sont les blocs constitutifs de la matière vivante. À la différence des polymères flexibles, semi-flexibles polymères adoptent une configuration tendue en raison de leur rigidité d’épine dorsale non-en voie de disparition, tout en restant soumis à fortes fluctuations thermiques1. Ainsi, des modèles stochastiques purement impossible d’appliquer à leurs comportements, comme avec les extrêmes de polymères entièrement flexibles ou rigides. Le modèle de ce que l'on appelle ver-comme chaîne2,3,4 a été développé afin de quantifier cette rigidité via la lp, qui est la constante de désintégration de la corrélation de tangente tangente le long du filament4. Si lp est comparable à la longueur du contour (lc) du filament, le polymère est considérée comme semi-flexibles1. Analogue aux pôles d’une tente, leurs arrangements en réseaux ou bottes stabilise l’ensemble du système collectif à des fractions de faible volume, conduisant à une inhabituelle viscoélastique propriétés5,6,7, 8,9. Ces structures fournissent au grand haute élasticité mesh tailles10, maintien de l’intégrité mécanique tout en facilitant la diffusion et les processus de transport actif. Cette propriété est particulièrement adaptée aux systèmes biologiques comme le cytosquelette ou de la matrice extracellulaire, mais il est également employé couramment en nourriture génie1,11,12.

Au-delà de leur signification avec la matière vivante, il est crucial d’examiner globalement les propriétés physiques de ces structures afin d’avoir les outils pour développer des matériaux biomimétiques ou roman hydrogels. En ce qui concerne les polymères semi-flexibles, ceci implique la détermination systématique des propriétés collectives des réseaux résultant des propriétés de single-filament comme lp et l’élaboration d’un cadre théorique descriptive. Pionnier dans l’étude, l’actine cellulaire biopolymère a été établi comme un système modèle pour polymères semi-flexibles et est toujours considéré comme l’étalon-or5,13,14,15 , 16 , 17. Cependant, les études exhaustives sont limités avec ce système car ils sont liés aux propriétés intrinsèques de cette protéine. Différentes approches théoriques ont visant à donner une description des comportements mécaniques non négligeables au niveau de single-filament et ont entraîné notamment mise à l’échelle des prévisions différentes pour la dépendance de la module de cisaillement de plateau élastique linéaire, G 0 (c'est-à-dire, le « élasticité » du réseau), en ce qui concerne la concentration (c) et lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Alors que l’échelle de concentration est facilement accessible dans les expériences avec axée sur l’actine ou autres systèmes modèles et que les prédictions théoriques ont été rigoureusement vérifiés13,16,24, 25, la mise à l’échelle en ce qui concerne lp est resté expérimentalement inaccessible. Ceci, cependant, est une limitation majeure puisque lp est également une variable indépendante qui est la quantité déterminante de polymères semi-flexibles.

Cette limitation centrale, naturelle, imposée par le fixe lp de l’actine ou autres polymères d’origine biologique comme le collagène a récemment été résolue en employant basé sur l’ADN tubes qui sont accordables dans leurs propriétés mécaniques 9 , 26 , 27 , 28. légères variations dans les architectures des tubes (par exemple, un nombre différent de l’ADN constituant chapelets dans l’anneau d’unité) donnent des valeurs distinctes pour lp, qui peut être évaluée par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence, en analysant un tube fluctuant ou en évaluant les configurations de courbes de plusieurs tubes collés, comme décrit précédemment9,28. Ces analyses ont révélé que lp valeurs des populations différentes tube varient au cours de plus d’un ordre de grandeur, et que les techniques d’évaluation différentes donnent des résultats cohérents9,28.

Étonnamment, la mise à l’échelle globale du cisaillement module Gplateau élastiques linéaire0 en ce qui concerne la concentration et lp a été signalée est incompatible avec toutes les précédentes approches théoriques 9, montrant en particulier une bien plus forte que prévue tributaire de lp. Ces résultats mettent l’accent sur la valeur d’un nouveau système modèle pour étudier les propriétés centrales de polymères semi-flexibles. Employant des n-tubes à hélices ADN élargit considérablement la portée de ces enquêtes. Non seulement lp librement réglable sans changer le matériel de base, mais la nature inhérente programmable d’ADN peut permettre l’examen systématique des éléments supplémentaires, tels que les croisements ou processus de commutation cinétiques. En outre, ces tubes sont solubles dans l’eau et, contrairement à la plupart des protéines, stable au pH adéquat et des conditions ioniques pendant plusieurs semaines, sans dégradation détectable9.

Pour assembler ces tubes, sert un ensemble discret d’oligonucléotides d’ADN, dont chacune contient deux domaines qui partagent des séquences de base complémentaires à deux brins voisins (due à des séquences spécifiques, un seul brin ne peuvent pas constituer des structures telles que les épingles à cheveux). Les séquences complémentaires s’hybrident de façon cyclique, formant des anneaux fermés, moitié-chevauchement de segments double hélice n interconnectés (Figure 1 a et B). Ces forment des anneaux à un diamètre discrète (Figure 1) et leur configuration se chevauchent moitié expose les extrémités cohésives axiales complémentaires aux extrémités collantes d’une autre bague. Cet ajout sélectif des correspondants des oligonucléotides déclenche un empilement des anneaux, conduisant à la polymérisation efficace des tubes à hélices ADN filamenteux de taille n (nHT). Leurs longueurs contours mesurent généralement de quelques microns de longueur, et la distribution de leur longueur est comparable à celle des filaments d’actine9,26,27,28. Il a été démontré pour les nanotubes d’ADN similaires qu’ils présentent en effet cinétique de polymérisation semblable à celles des microtubules et des filaments d’actineclasse p = « xref » > 29. Selon le nombre n des brins d’ADN individuels qui composent la structure de l’anneau de base, l’architecture nHT, ainsi que sa circonférence et le diamètre, contrôlable réglable. À l’aide de brins d’ADN plus augmente la circonférence des anneaux/tubes, et le changement architectural correspondant déplace les propriétés mécaniques à des valeurs plus élevées dep l(Figure 1), correspondant à une rigidité supérieure. À l’échelle mésoscopique, ces valeurs plus élevées dep ltraduisent en conformations moins courbées en raison de la rigidité accrue (Figure 1 et E).

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Protocole

1. préparation des n HTs

Remarque : ici, n désigne le nombre de brins d’ADN unique différents impliqués dans la formation des tubes hélice d’une certaine taille. Pour n = 8, huit différents simples brins d’ADN forment un anneau unité.

  1. Des séquences d’ADN de l’achat (qualité HPLC pureté ou supérieur) d’une synthèse de l’ADN appropriée de service ou d’effectuer la synthèse de haute qualité et de la purification (exemplaires séquences indiquées au tableau 1).
  2. Remettre lyophilisé oligonucléotides dans l’eau purifiée et suivre la remise en suspension supplémentaire étapes figurant dans le manuel correspondant de la société. Ajuster la quantité d’eau pour obtenir une concentration finale de 200 µM.
  3. Déterminer les concentrations de l’ADN simple brins pour vérifier les valeurs indiquées par le distributeur (par exemple, via la spectroscopie UV-visible à 260 nm) puisque la stoechiométrie exacte est cruciale pour le processus d’assemblage. Calculer la concentration des oligonucléotides, en tenant compte du poids spécifique molaire et le coefficient d’extinction pour chaque oligonucléotides d’ADN monocaténaire.
    Remarque : Les valeurs de coefficient d’extinction intrinsèquement varient pour les différentes séquences et sont précisées dans la documentation de l’ADN acheté dans le commerce. Il peuvent aussi être calculées selon le modèle du plus proche voisin à l’aide d’un certain nombre d’outils en ligne disponibles gratuitement. Pour se conformer à la gamme linéaire du spectromètre, envisager de diluer l’échantillon utilisé pour la détermination de la concentration.
  4. à l’aide d’une micropipette, mélanger l’ADN chaque brins à la même concentration-dans un récipient qui convient pour le thermocycleur (p. ex., un tube de PCR de 200 µL) former la désirée n HTs (conditions de tampon final : 1xTE (10 mM Tris et 1 mM EDTA, pH 8) et 12,5 mM MgCl 2).
    Remarque : Des échantillons ADN Final n HT consistent en n - 1 brins, U 1 − U n − 1 et un brin de n T. La concentration / chapelet peut varier de sub-micromolaires à plus de 10 µM, selon les besoins de l’utilisateur (p. ex., < 1 µm par fil à la dilution subséquente d’observer des filaments simples ou des concentrations plus élevées pour l’examen des mécanique de réseau dense).
  5. Hybrider le n HTs dans un thermocycleur (dénaturation pendant 10 min à 90 ° C, avec une baisse rapide subséquente à 65 ° C ; température lente diminution de 65 ° C à 55 ° C, avec une synchronisation base complémentaire en 20 étapes de température de K-0,50 pendant 30 min chaque ; (et une baisse rapide de 55 ° C à 20 ° C) ; Voir la Figure 2 a.
    Remarque : Les étapes de la lente diminution de 65 ° C peuvent être rallongés pour augmenter la longueur du tube moyen ; Toutefois, la baisse rapide subséquente à 20 ° C est cruciale pour éviter l’agrégation des tubes polymérisés.
  6. Stocker l' hybride n HTs jusqu'à 3 semaines à 4 ° C sans dégradation détectable.
    NOTE : Pour la fluorescence microscopy, étiqueté n HTs sont hybridés en substituant (en partie) U1 avec la mis à jour le U1-Cy3 (tableau 1). Pour plus longues périodes d’observation, l’ajout d’agents anti-blanchiment établis est conseillé.
  7. Diluer soigneusement l’échantillon à la concentration finale souhaitée (par exemple, 4 µM pour les réseaux ou 20 nM pour les observations de single-filament) à l’aide de la solution tampon, si nécessaire. Pour minimiser les sources d’erreur possibles, assembler des échantillons à la concentration finale souhaitée.

2. Rhéologie de cisaillement

  1. choisir une bonne géométrie (plaque plaque ou plaque de cône) pour le rhéomètre à cisaillement dynamique. Pour les petits volumes (c'est-à-dire au-dessous de 200 µL), utiliser la géométrie de cône-plaque.
  2. Charger l’échantillon sur le rhéomètre à cisaillement dynamique.
  3. Passiver l’interface air-eau de l’échantillon et l’environnement en utilisant les étapes suivantes afin d’éviter les effets potentiels d’évaporation.
    1. Entourent l’échantillon avec 2,5 mL de la baignoire de tampon échantillon.
    2. Ajouter un surfactant juste en dessous de la concentration micellaire.
    3. Utiliser une seringue de Hamilton à entourer l’échantillon avec un lipide d’éviter le contact direct de l’échantillon avec de l’air.
  4. Sceller la chambre de l’échantillon avec un plafond avec des éponges humides et, si possible, avec un bain d’eau supplémentaire (pas au contact de l’échantillon) pour mieux réprimer évaporation.
  5. Démarrer la mesure en utilisant le logiciel spécifique rhéomètre à température ambiante, vous pouvez également effectuer la mesure à des températures différentes, tels que les 37 ° C (si conditions physiologiques sont nécessaires).
    Remarque : L’échantillon de refroidissement est souvent accompagnée par la condensation de vapeur d’eau de l’air ambiant, tandis que chauffage conduit à une évaporation accrue. Les deux effets peuvent changer incontrôlable de la concentration de l’échantillon, donc toutes les mesures dans une série doivent être effectuées à une température constante.
  6. Laisser l’échantillon s’équilibrer pendant 2 h à température ambiante. L’évolution temporelle peut être surveillée avec un balayage de temps (un données point par minute ; déformation γ = 5 % ; fréquence f = 1 Hz).
  7. Mesure les propriétés mécaniques avec les protocoles de test désiré. Partir d’une série de fréquences balayages (f-balaie) parce qu’elles quittent l’échantillon intact et permettent des mesures plus.
    NOTE : En outre, court f-balayages devraient être effectuées avant et après les mesures plus (comme long f-balaie avec une résolution beaucoup plus élevée) pour vérifier que l’échantillon ne varia pas dans tout le protocole de mesure complet.
    1. Effectuer un court f-balayage (p. ex., γ = 5 % ; f = 0,01 Hz à 30 Hz ; points de 5 données par décennie).
    2. Effectuer un long f-balayage (p. ex., γ = 5 % ; f = 0,001 Hz à 30 Hz ; 21 points de données par décennie) ; le régime de basse fréquence peut être omis si pas nécessaire de réduire les temps de mesure.
    3. Effectuer un court f-balayage.
    4. Effectuer un balayage de γ (p. ex., f = 1 Hz ; γ = 0,0125 % à 100 % ; points de 20 données par décennie).
      Remarque : Utilisez le court f - balayer tout d’abord, comme c’est généralement incompatible avec le précédent f - balaie parce que les réseaux habituellement se rompent au cours de la γ-coupe-bise ou détachent les plaques. Vous pouvez également utiliser γ-rampe (par exemple, = 0.025 s -1, t = 60 s) ; Toutefois, les rampes habituellement oblige à modifier le mode moteur, court donc ultérieurs f-balayages serait être falsifiées.
  8. Bin et/ou lisse les données brutes avec un noyau gaussien.

3. assistée par fluorescence analyse d’ADN recuit

  1. 8 préparer des aliquotes de 12 µL de chaque échantillon à l’aide de 1 à 4 µM ADN par brin, 12,5 mM MgCl 2 en 1 x tampon TE et 1 x gel d’acide nucléique taches provenant d’un DMSO 10 000 x stock. Faire un contrôle négatif avec aucun ADN, mais incluent des acides nucléiques gel teinté.
  2. Transférer les aliquotes dans une plaque PCR en temps réel et sceller avec un film adhésif (par exemple, une plaque de 96 puits réaction).
    Remarque : Les hautes températures utilisées dans le thermique recuit protocoles seront évaporera échantillons. Par conséquent, assurez-vous que les puits sont bien scellées avec un film adhésif pour empêcher l’augmentation d’évaporation et la concentration de l’eau, en particulier au cours d’expériences à long terme.
  3. Centrifuger la plaque à 100 x g pendant 1 min à température ambiante pour enlever les bulles de gaz ; si les bulles de gaz élargir, les puits ne peuvent pas être analysés.
  4. Charger la plaque scellée dans un système PCR quantitatif en temps réel.
  5. Exécuter un programme de recuit. Dénaturer l’ADN à 90 ° C pendant 10 min. baisse la température rapidement à 72 ° C. Ensuite, diminuer la température lentement de 0,5 ° C toutes les 30 minutes. Après que le signal a décru, accélérer la rampe de température.
    Remarque : 72 ° C est suffisamment au-dessus de la température réelle de l’hybridation ; ainsi, le signal est enregistré sur une plage de température large pour déterminer l’intervalle de température nécessaire.
  6. S’assurer que le couvercle de la cycler chauffe au moins 100 ° C pour éviter la condensation d’échantillon évaporé sur la pellicule adhésive.
  7. Au cours de l’Assemblée, excite les échantillons avec un laser argon-ion à 488 nm et détecter la fluorescence à 550 nm lors de l’utilisation d’une tache de gel d’acide nucléique (ou spectralement similaire). Pour les autres colorants, choisir une combinaison appropriée d’excitation/émission. Mesurer le signal de fluorescence aussi souvent que possible afin d’accroître l’ensemble la qualité du signal à l’aide de l’appareil photo intégré.
    NOTE : Ici, on a mesuré chaque 9 s.
  8. Si fusion prédéfinis et recuit de programmes sont appliqués, utilisez le logiciel fourni pour analyser les données. Si non, soustraire la valeur moyenne antérieure de la valeur moyenne pour chaque étape de la température obtenir la variation relative du signal fluorescent.

4. AFM Imaging

  1. Cleave mica (p. ex., mica " V1 ") en joignant un ruban adhésif disponible dans le commerce et arrachant ; la couche superficielle du mica doit être retirée.
  2. À l’aide d’une micropipette, déposer pré-formé n HT en Mg 2 + contenant un tampon pliant sur le mica fraîchement clivé et laissez-le se contenter de 10 min.
  3. Tourner les échantillons à intervalles courts 3 s à 2 000 x g sur une centrifugeuse de petite table pour enlever le liquide restant. Plusieurs n HTs doit toujours être attaché à la surface de mica.
  4. Utiliser un embout de cantilever avec une rigidité élevée (p. ex., 54 Nm -1) et de déterminer sa fréquence de résonance avec le logiciel interne de l’AFM.
  5. Enregistrement du profil de hauteur avec l’AFM dans l’air en tapant mode à balayage faible taux (par exemple, 1 ligne/s) pour éviter d’endommager ou de déplacer la n HTS.

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Résultats

L’Assemblée des nanotubes d’ADN via une rampe de température (Figure 2) est une méthode très fiable pour former ces polymères artificiels semi-flexibles. Ces polymères ont des caractéristiques comparables à leurs homologues naturels, tels que les filaments d’actine, mais fournissent un cadre expérimental beaucoup plus large, puisque leurs propriétés mécaniques peuvent être contrôlable modifié9,27 . Co...

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Discussion

Pour obtenir des réseaux correctement formés, assembler les nanotubes d’ADN est une étape cruciale. Erreurs lors du processus de synthèse des effets négatifs sur la qualité du tube ; par conséquent, il est recommandé que HPLC ou un processus plus rigoureux servir à purifier les oligonucléotides. Étant donné que la formation de discrètes plutôt qu’agrégées nanotubes d’ADN, ainsi que leur répartition, leur longueur dépend de la stoechiométrie équimolaire des oligonucléotides constitutifs n dans l’ensemble, il est ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous reconnaissons le financement par la DFG (1116/17-1) et la Faculté des Sciences naturelles de Leipzig « BuildMoNa » (CGC 185). Ce travail a été soutenu par le projet de Fraunhofer Attract 601 683. T. H. reconnaît le financement par le Fonds Social européen (FSE-100077106).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AFM cantilever ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
Caméra CCDAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
Oligonucléotides d’ADNBiomers.netPour les séquences, voir Tableau 1
Oligonucléotides marqués à l’ADN Cy3Biomers.netPour la séquence, voir le Tableau 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Micro-scope d’épifluorescenceLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica « V1 », 12 mm rondPlano GmbH50-12
MicroAmp® ; Plaque de réaction optique rapide à 96 puitsThermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp® ; Film adhésif optiqueThermo Fisher Scientific Inc.
Spectrophotomètre NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific Inc.
Objectif 100xLeica5506168
Eau purifiéeMerk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire Tubes PCRGreiner Bio-One683271
TProfessional Standard PCR ThermocycleurCore Life Sciences Inc.070- Standard
7900HT Système de PCR rapide en temps réelApplied Biosystems4351405
RhéomètreTA InstrumentsARES
SYBR® ; Colorant gel d’acide nucléique Green IThermo Fisher Scientific Inc.S7567
TrisSigma-AldrichT4661
Triton X-100Sigma-Aldrich Co.X-100Supprime l’évaporation de l’échantillon à l’interface air-eau
43469074306311

Références

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