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Nanotubes d’ADN comme un outil polyvalent pour l’étude des polymères semi-flexibles

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DOI :

10.3791/56056

25 octobre 2017

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Polymères semi-flexibles affichent des propriétés mécaniques uniques qui sont largement appliquées par les systèmes vivants. Toutefois, des études systématiques sur les biopolymères sont limitées puisque les propriétés telles que la rigidité de polymère sont inaccessibles. Ce manuscrit décrit comment cette limitation est contournée par programmable ADN nanotubes, permettant des études expérimentales sur l’impact de la rigidité du filament.

Résumé

Les propriétés mécaniques de la matière molle complexe, à base de polymères, tels que les cellules ou les réseaux de biopolymère, peuvent être comprises dans ni le cadre classique des polymères flexibles, ni de tiges rigides. Filaments sous-jacente restent tendus en raison de leur rigidité de la colonne vertébrale non-en voie de disparition, qui est quantifiée par la longueur de persistance (l,p), mais ils sont également soumis à fortes fluctuations thermiques. Leur rigidité en flexion finie mène à mécanique collective unique, non trivial de réseaux en vrac, ce qui permet la formation d’échafaudages stables à des fractions de faible volume, tout en offrant des tailles de mailles larges. Ce principe est répandu dans la nature (p. ex., dans les cellules ou les tissus), pour réduire le contenu moléculaire élevé et ce qui facilite diffusive ou transport actif. En raison de leurs implications biologiques et des applications technologiques potentielles dans les hydrogels biocompatibles, semi-flexibles polymères ont fait l’objet de nombreuses études. Cependant, enquêtes compréhensibles est resté difficiles puisqu’ils s’appuyaient sur des polymères naturels, tels que les filaments d’actine, qui ne sont pas librement réglables. Malgré ces limites et en raison du manque de polymères synthétiques et mécaniquement accordables semi-flexibles, filaments d’actine ont été établis sous le régime de modèle commun. Une limitation majeure est que la quantité central lp ne peut pas être librement à l’écoute afin d’étudier son impact sur les structures macroscopiques en vrac. Cette limitation a été résolue en employant des nanotubes ADN structurellement programmables, permettant la modification contrôlée de la raideur du filament. Elles sont constituées par des conceptions basées sur les carreaux, où un ensemble discret de brins partiellement complémentaires s’hybrident dans une structure d’anneau avec une circonférence de discrète. Ces anneaux disposent les extrémités cohésives, permettant la polymérisation efficace en filaments de quelques microns de longueur et affiche similaires cinétique de polymérisation sous forme de biopolymères naturels. En raison de leur mécanique programmable, ces tubes sont polyvalents, de nouveaux outils pour étudier l’impact de lp sur la molécule unique ainsi que l’échelle en vrac. Contrairement aux filaments d’actine, ils restent stables au cours des semaines, sans dégénérescence notable, et leur manipulation est relativement simple.

Introduction

En raison des comportements complexes activés par leurs propriétés mécaniques uniques, polymères semi-flexibles sont les blocs constitutifs de la matière vivante. À la différence des polymères flexibles, semi-flexibles polymères adoptent une configuration tendue en raison de leur rigidité d’épine dorsale non-en voie de disparition, tout en restant soumis à fortes fluctuations thermiques1. Ainsi, des modèles stochastiques purement impossible d’appliquer à leurs comportements, comme avec les extrêmes de polymères entièrement flexibles ou rigides. Le modèle de ce que l'on appelle ver-comme chaîne2,

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Protocole

1. préparation des n HTs

Remarque : ici, n désigne le nombre de brins d’ADN unique différents impliqués dans la formation des tubes hélice d’une certaine taille. Pour n = 8, huit différents simples brins d’ADN forment un anneau unité.

  1. Des séquences d’ADN de l’achat (qualité HPLC pureté ou supérieur) d’une synthèse de l’ADN appropriée de service ou d’effectuer la synthèse de haute qualité et de la purification (exemplaires séquences indiquées au tableau 1).
  2. Remettre lyophilisé oligonucléotides dans l’eau purifiée et suivre la remise en suspension supplémentaire étapes figurant....

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Résultats

L’Assemblée des nanotubes d’ADN via une rampe de température (Figure 2) est une méthode très fiable pour former ces polymères artificiels semi-flexibles. Ces polymères ont des caractéristiques comparables à leurs homologues naturels, tels que les filaments d’actine, mais fournissent un cadre expérimental beaucoup plus large, puisque leurs propriétés mécaniques peuvent être contrôlable modifié9,27 . Co.......

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Discussion

Pour obtenir des réseaux correctement formés, assembler les nanotubes d’ADN est une étape cruciale. Erreurs lors du processus de synthèse des effets négatifs sur la qualité du tube ; par conséquent, il est recommandé que HPLC ou un processus plus rigoureux servir à purifier les oligonucléotides. Étant donné que la formation de discrètes plutôt qu’agrégées nanotubes d’ADN, ainsi que leur répartition, leur longueur dépend de la stoechiométrie équimolaire des oligonucléotides constitutifs n dans l’ensemble, il est .......

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous reconnaissons le financement par la DFG (1116/17-1) et la Faculté des Sciences naturelles de Leipzig « BuildMoNa » (CGC 185). Ce travail a été soutenu par le projet de Fraunhofer Attract 601 683. T. H. reconnaît le financement par le Fonds Social européen (FSE-100077106).

....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AFM cantilever ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
Caméra CCDAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
Oligonucléotides d’ADNBiomers.netPour les séquences, voir Tableau 1
Oligonucléotides marqués à l’ADN Cy3Biomers.netPour la séquence, voir le Tableau 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Micro-scope d’épifluorescenceLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica « V1 », 12 mm rondPlano GmbH50-12
MicroAmp® ; Plaque de réaction optique rapide à 96 puitsThermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp® ; Film adhésif optiqueThermo Fisher Scientific Inc.
Spectrophotomètre NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific Inc.
Objectif 100xLeica5506168
Eau purifiéeMerk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire Tubes PCRGreiner Bio-One683271
TProfessional Standard PCR ThermocycleurCore Life Sciences Inc.070- Standard
7900HT Système de PCR rapide en temps réelApplied Biosystems4351405
RhéomètreTA InstrumentsARES
SYBR® ; Colorant gel d’acide nucléique Green IThermo Fisher Scientific Inc.S7567
TrisSigma-AldrichT4661
Triton X-100Sigma-Aldrich Co.X-100Supprime l’évaporation de l’échantillon à l’interface air-eau
43469074306311

Références

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y.

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Mots-clés

Longueur de persistancemesure rh ologiquerh om tre cisaillement dynamiqued tection par fluorescencehybridation en thermocycleurPCR en temps r elcin tique de polym risationapplication d hydrogel

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