Microscopie épiscopique à haute résolution (HREM) - Protocoles simples et robustes pour le traitement et la visualisation des matières organiques

L'analyse structurale des matériaux organiques et anorganiques est la première étape dans la compréhension de leurs propriétés physiques et de leur fonction. La base de cette analyse est souvent l'information bidimensionnelle (2D) obtenue grâce à une observation minutieuse des sections histologiques, avec une variété de méthodes d'imagerie simples et sophistiquées qui extraient les détails de l'architecture tissulaire, la morphologie cellulaire et la topologie, la composition moléculaire et les propriétés biomécaniques ^{1 , 2 , 3} . Cependant, les informations 2D ne conviennent pas pour rechercher des arrangements spatialement complexes. Par conséquent, un nombre croissant de méthodes in vivo et ex vivo qui permettent la génération de données de volume numérique ont été établies au cours des dernières décennies ⁴ et beaucoup d'autres sont en cours de développement.

Le principe méthodique de la plupart des méthodes de génération de données de volume est la génération de piles virtuellesD'images numériques affichant des sections obtenues par sectionnement virtuel ou physique d'un objet. Si les images de la section sont alignées correctement, cela crée un volume, qui peut être recoupé dans des plans de section virtuels, ou utilisé pour créer des modèles 3D en surface et en volume. Les techniques populaires pour visualiser les humains et les spécimens biologiques plus importants sont la tomographie par résonance magnétique (MRT), la tomodensitométrie (CT), la tomographie par émission de positons (PET) et la tomodensitométrie par émission de photons (SPECT). Les petits échantillons sont habituellement visualisés en utilisant l'imagerie par résonance magnétique (μMRI), la tomographie par projection optique (OPT), la tomographie par cohérence optique (OCT), la tomographie photoacoustique (PAT), les méthodes de sectionnement histologique, la microscopie confocale et la tomographie électronique ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10} 11 ^{, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} .

Une technique de génération de données de volume relativement nouvelle, qui produit des données numériques de petits spécimens et d'échantillons de tissus histologiques, est la méthode HREM, qui a été développée en étroite collaboration avec Tim Mohun ^{18 , 19} . C'est une simple technique basée sur le microscope, qui génère des données de volume numériques à partir de matériaux intégrés en résine qui sont sectionnés sur un microtome. Les données facilitent l'analyse détaillée de l'architecture des tissus et des distributions cellulaires ainsi que l'analyse métrique de petites caractéristiques sur un niveau microscopique optique intermédiaire.

HREM produit des piles d'images numériques alignées de manière inhérente qui semblent capturées à partir d'eSections histologiques colorées aux osines. Le contraste des tissus et la résolution des données par rapport au champ de vision dépassent ceux des données produites avec μCT, μMRI et OPT, mais sont inférieures à celles réalisables avec la fibre confocal, la lumière et la microscopie électronique ²⁰ . Cependant, contrairement à ce dernier, HREM est capable de visualiser des échantillons avec des volumes relativement importants allant jusqu'à 5 x 5 x 7 mm ³ en qualité histologique. Un certain nombre d'études récentes fournissent des caractérisations et des comparaisons détaillées des avantages et des inconvénients des techniques d'imagerie unique et, dans un souci d'objectivité, nous nous référons à ceux pour plus d'informations concernant leurs limites et champs d'application potentiels ^{4 , 21 , 22 , 23 , 24} .

Cette étude met l'accent sur la méthode d'imagerie HREM et vise à fournirDes protocoles très simples pour générer des données HREM d'un large éventail de matériaux organiques, ainsi que des exemples de leur application. Le flux de travail pour créer des données HREM est simple et s'applique à tous les matériaux qui peuvent être intégrés dans la résine de méthacrylate ( figure 1 ). Pourtant, il existe des différences spécifiques de tissus dans la préparation des échantillons, qui doivent être prises en considération. Nous proposons donc trois protocoles standard pour préparer différents échantillons. L'intégration et les étapes de protocole de génération de données sont identiques pour toutes.

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives éthiques de l'Université médicale de Vienne.

1. Préparation de l'échantillon

1. Préparation des embryons et des tissus embryonnaires (jusqu'à 5 x 5 x 5 mm ³ )
   1. Fixer les embryons ou les parties des embryons dans 4% de PFA / PBS ou de fixateur de Bouin à 4 ° C pendant au moins 16 à 24 h sous un basculement constant.
      REMARQUE: On peut utiliser des embryons de plusieurs espèces et de diverses étapes de développement, comme le poisson zèbre 48 h, le poussin et la caille de 19 h, ainsi que des embryons prénataux de souris, qui ont été utilisés ici (voir Résultats représentatifs ). Les échantillons ont été récoltés et transférés dans du PBS à température ambiante pour la mise en scène avant leur mise en fixation. Si nécessaire, couper les éprouvettes avec des microcisres ou des scalpels avant la fixation pour s'adapter aux moules d'encastrement.
   2. Retirer le fixateur et laver le tissu embryonnaire dans du PBS à 4 ° C sous un balancement constantG pendant 24 h (2-3 changements).
   3. Déshydratez les échantillons dans 70%, 80%, 90%, 96% d'éthanol à 4 ° C pendant 2 à 3 h chacun. Placer les tubes contenant les échantillons sur un rotateur.
      REMARQUE: pour les petits échantillons (<2 x 2 x 2 mm ³ ), le temps pendant lequel un échantillon repose dans chaque éthanol peut être réduit à 60 min. Pour les gros échantillons (> 5 x 5 x 5 mm ³ ), il peut être prolongé jusqu'à 4 h.
   4. Effectuez les étapes d'infiltration suivantes sous une hotte portant des gants de protection.
      1. Préparer la solution d'infiltration en ajoutant 1,25 g de peroxyde de benzoyle (catalyseur plastifié) et 0,4 g d'éosine à 100 ml de solution A (pour plus de détails, voir Tableau des matériaux ). Mettez ceci dans un bécher sur une plaque d'agitation magnétique à 4 ° C jusqu'à ce que l'éosine et le catalyseur soient complètement dissous (2 à 3 h).
      2. Placez les échantillons pendant 12 à 24 h dans la solution d'infiltration. Gardez-le à 4 ° C sous un basculement continu ou une rotation. Remplacer la solution d'infiltration avec une solution fraîche après 3 et 12H.
         REMARQUE: Étendre le temps d'infiltration à 48 h pour les grands embryons (> 1 cm de couronne / longueur de croupe).
2. Préparation des échantillons de tissus adultes (jusqu'à 5 x 5 x 7 mm ³ )
   1. Fixer les tissus dans 2% de PFA / PBS contenant 4% d'acide carbolique à 4 ° C pendant au moins 3 jours.
      REMARQUE: L'échantillon de tissu provenant de la peau, du foie, du pancréas, des reins, de la thyroïde, du cœur, du muscle strié, du cerveau, des nerfs et des modèles de tumeur de plusieurs humains néonatals et adultes, des rongeurs, des porcs, des mouches des fruits et des poissons zèbres peut être résolu dans cette solution Puis traité pour l'imagerie HREM (nous démontrons la fixation des échantillons, voir les résultats représentatifs ). Exciser les échantillons de tissus avec des scalpels, des ciseaux ou des punaises de biopsie et les transférer directement en fixateur. Pour la fixation de l'utilisation du tissu nerveux, 4% de PFA / PBS.
   2. Retirez le fixateur et lavez le tissu sous l'eau courante du robinet pendant 3-6 h.
   3. Déshydratez les échantillons par la suiteEn 70%, 80%, 90%, 96% d'éthanol, mélangé avec 0,4 g d'éosine par 100 mL (2 à 3 h chacun). Conservez les solutions avec des échantillons à 4 ° C sous un basculement constant ou sur un rotateur.
      REMARQUE: pour les petits échantillons (<2 x 2 x 2 mm ³ ), le temps pendant lequel un échantillon repose dans chaque éthanol peut être réduit à 60 min. Pour les gros échantillons (> 5 x 5 x 5 mm ³ ), il peut être prolongé jusqu'à 4-8 h.
   4. Effectuez toutes les étapes d'infiltration suivantes sous une hotte munie de gants de protection.
      1. Préparez la solution d'infiltration en ajoutant 1,25 g de peroxyde de benzoyle (catalyseur plastifié) et 0,4 g d'éosine à 100 ml de solution A (pour plus de détails, voir Tableau des matériaux ). Incorporer un bécher sur une plaque d'agitation magnétique à 4 ° C jusqu'à ce que l'éosine et le catalyseur soient complètement dissous (2 à 3 h).
      2. Placez les échantillons dans la solution d'infiltration pendant 24 à 36 h. Gardez-le à 4 ° C sous un basculement continu ou une rotation. Remplacer la solution d'infiltration avec une solution fraîche après 3 et12 h.
         REMARQUE: pour les gros échantillons (> 5 x 5 x 5 mm ³ ), prolonger le temps d'infiltration à 48 h.
3. Préparation d'autres matières organiques
   REMARQUE: Coupez les substituts de la peau et le papier à la taille souhaitée avec des ciseaux ordinaires. Aucune fixation n'est nécessaire.
   1. Étapes de fixation, de lavage et de déshydratation du saut.
   2. Effectuez toutes les étapes d'infiltration suivantes sous une hotte munie de gants de protection.
      1. Préparez la solution d'infiltration en ajoutant 1,25 g de peroxyde de benzoyle (catalyseur plastifié) et 0,4 g d'éosine à 100 ml de solution A (pour plus de détails, voir Tableau des matériaux ). Incorporer un bécher à 4 ° C sur une plaque d'agitation magnétique jusqu'à ce que l'éosine et le catalyseur soient complètement dissous (2 à 3 h).
      2. Placez les échantillons dans la solution d'infiltration pendant 3 à 12 h. Gardez-le à 4 ° C sous un basculement continu ou une rotation. Remplacer la solution d'infiltration avec une solution fraîche après 1 et 2 - 4 h.
      </ Li>

2. Incorporation

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes sous une hotte avec des gants de protection.

1. Préparez une solution d'infiltration fraîche telle que décrite ci-dessus (étape 1.1.4.1). Ajouter 4 mL de solution B (pour plus de détails, voir le tableau des matériaux ) à une solution d'infiltration de 100 mL pour préparer la solution d'encastrement.
   REMARQUE: si une orientation précise de l'échantillon dans les moules d'encastrement est nécessaire et pour permettre l'encastrement de plusieurs échantillons en parallèle, ralentir la polymérisation de la solution mère en mettant le bécher dans un bain de glace.
2. Utilisez des plateaux de moulage (pour plus de détails, voir Table des matériaux ) avec des moules ayant un volume de routine de 6 x 8 x 5 mm ³ ou 13 x 19 x 5 mm ³ , ou des moules personnalisés avec des volumes jusqu'à 8 x 10 x 15 mm ³ ( figure 2 ).
3. Remplissez les moules avec une solution d'encastrement et transférez l'échantillon dans le moule en utilisantune cuillère. Pendant le transfert, s'assurer que l'échantillon est entièrement recouvert d'une solution d'encastrement pour éviter le piégeage d'air.
   REMARQUE: ceci peut être effectué à température ambiante, si démarré immédiatement après la collecte des échantillons et la solution d'incorporation du réfrigérateur.
   1. Orientez l'échantillon dans le moule en utilisant des aiguilles ou des pinces.
   2. Dès que la solution d'encastrement commence à devenir visqueuse, placez un support de bloc (voir la Table des matériaux ) sur le dessus du moule et ajoutez une solution d'encastrement à travers le trou central du support de bloc jusqu'à ce que la base du support de bloc soit recouverte de 1 à 2 Mm de solution d'encastrement.
   3. Sceller le plateau de moulage en le recouvrant avec de la paraffine liquide et attendre jusqu'à ce qu'il soit durci. Alternativement, placez un deuxième plateau de moulage à l'envers sur le plateau de moulage avec des échantillons et scellez-le avec du ruban adhésif à l'air.
4. Permettre aux blocs de terminer la polymérisation en stockant les plateaux de moulage scellés pour 1 -2 jours à température ambiante.
5. Pour le traitement post-polymérisation, placez les plateaux de moulage avec les blocs polymérisés dans un four de laboratoire standard et faites cuire à une température de 70 à 80 ° C pendant au moins 1 à 2 jours jusqu'à ce qu'ils deviennent de couleur rouge foncé. Recueillir les plateaux du four et retirer les blocs du moule.
   REMARQUE: La cuisson peut se faire dans des conditions environnementales normales. Le plateau de moulage de revêtement, qui assure une étanchéité à l'air dans la première phase après l'encastrement, peut être retiré pour permettre de vérifier la couleur de la résine après 10 h. Immédiatement après la cuisson, la résine est douce et les blocs peuvent être facilement retirés du plateau de moulage. Dans les 2 à 3 heures, ils sont durs et peuvent être conservés à température ambiante pendant plusieurs mois.

3. Génération de données

REMARQUE: Le prototype HREM ^{18 , 25} utilisé ici comprend les éléments suivants: (i) Microtome rotatif avec un support de blocQui s'arrête après chaque coupe à son point de virage supérieur. (Ii) Couteau à microtome standard, non jetable, métal dur, profil D (pour plus de détails, voir Tableau des matériaux ). (Iii) Tête de microscope à fluorescence avec revolver objectif et un cube de filtre GFP (excitation 470/40; filtre d'émission 525/50) dans son axe optique. L'axe optique est disposé perpendiculairement à la surface fraîchement découpée d'un bloc monté sur le microtome et est maintenu par un dispositif qui permet des mouvements ascendants et descendants. (Iv) table transversale motorisée portant le microtome. La table peut être déplacée dans la direction de l'axe optique et latéralement. (V) Caméra vidéo numérique attachée au microscope à cristaux liquides. (Vi) Source de lumière monochrome (470 nm). (Vii) Ordinateur connecté à la caméra, avec logiciel de génération de données (pour plus de détails, voir Table des matières ).

1. Procédure
   1. Indiquez la région d'intérêt.
      1. Utiliser un laboratoire standardGht source (voir Table of Materials ) pour diriger la lumière blanche obliquement sur la surface du bloc.
      2. Identifiez les contours du matériau embarqué en projetant la surface du bloc. Indiquez la région d'intérêt et le dernier champ de vision sur la surface du bloc en utilisant un stylo ou une lame de rasoir.
         REMARQUE: cette étape est obligatoire pour définir l'étendue du champ de vision avant la section.
   2. Définissez le champ de vision.
      1. Monter le bloc de résine avec un échantillon sur le microtome.
      2. Déplacez le support de bloc à sa position d'arrêt (point de virage supérieur de l'excursion du porte-bloc).
      3. Démarrez l'appareil photo numérique et le logiciel de génération de données, et obtenez une image en direct.
      4. Choisissez un objectif, avec un grossissement approprié pour couvrir la région d'intérêt indiquée sur la surface du bloc.
         REMARQUE: les objectifs avec des agrandissements 2.5X, 5X, 10X, 20X et des ouvertures numériques entre 0.07 et 0.40 sont couramment utilisés. Déplacez l'optique vers le haut et vers le bas et le microtome latéralement en utilisant la table transversale motorisée jusqu'à ce que la région d'intérêt correspond au champ de vision affiché sur l'écran de l'ordinateur.
   3. Concentrer.
      1. Effectuez une coupe manuelle étape par étape jusqu'à ce que les premières structures de l'échantillon deviennent visibles.
      2. Disposez la surface du bloc dans le plan de focalisation de l'optique, en déplaçant le microtome dans la direction de l'axe optique.
      3. Choisissez l'épaisseur de la section; Des épaisseurs de section de 0,5 à 5 μm sont recommandées.
2. Production et traitement de données
   1. Démarrez la routine du logiciel qui organise la section et la capture d'image. Suivez les instructions documentées du logiciel de capture d'image.
   2. Arrêtez la routine du logiciel et placez une diapositive de mise à l'échelle devant la surface du bloc dès que l'échantillon est complètement sectionné.
   3. Capturez une image de manière interactive pour un étalonnage ultérieurTion.
      REMARQUE: ceci doit être fait chaque fois qu'un objectif est utilisé dans une configuration nouvellement organisée.
   4. Convertissez la série d'images en images à l'échelle de gris de 8 bits au format jpg.
   5. Chargez des séries d'images dans un logiciel de visualisation 3D et ajustez les contrastes.
      REMARQUE: la conversion d'image et la visualisation 3D peuvent être effectuées avec différents progiciels standard disponibles dans le commerce ou en libre-service, en suivant les instructions du logiciel concerné.

HREM génère des séries d'images numériques alignées de façon inhérente avec des contrastes similaires aux images des coupes histologiques colorées à l'hématoxyline / éosine. Contrairement aux images de la section 2D, les piles d'images HREM permettent une visualisation et une analyse de l'architecture des tissus, de la morphologie et de la topologie d'une grande variété de matériaux organiques en 3D. Le contraste élevé facilite souvent la visualisation 3D rapide et simple des modèles informatiques volumineux et des résultats de contour semi-automatique pour la génération de modèles rendus en surface.

La taille des données HREM varie selon la taille de la cible de la caméra, le mode de capture d'image (8, 12, 16 bits, échelle de gris, couleur) et le nombre d'images de face à bloc unique. Les plus petits ensembles de données de 1000 images 8-bit.jpg en échelle de gris de 2,048 pixels x 2,048 pixels ont une taille d'environ 900 Mo. Plus grands ensembles de données de 3 000 images à l'échelle de gris de 8 000.jpg de 4,096 pIxel x 4,096 pixels ont des volumes d'environ 20 Go.

Les protocoles fournis sont simples et robustes, et au cours de la dernière décennie, ils ont été employés pour générer des données HREM de nombreux spécimens différents. La section de protocole 1.1 a été optimisée pour traiter des embryons entiers d'organismes modèles biomédicaux avec une longueur de jusqu'à 1 cm et des échantillons de tissu embryonnaire d'une dimension allant jusqu'à 5 x 5 x 5 mm 3 ; Nous avons utilisé cette méthode pour produire des données HREM d'embryons des espèces suivantes: souris ( Mus musculus) , poussin ( Gallus gallus ), poisson zèbre ( Danio rerio ), cailles ( Coturnix coturnix) , grenouille africaine ( Xenopus laevis ), cheval ( Equus ferus caballus ), un insecte d'amidon ( Oncopeltus fasciatus ), crocodile ( Crocodylia ) et pieuvre ( Octopus vulgaris ). Les données de toutes les espèces étaient d'excellente qualité ( p . Ex. , Figure 3 )

3 et utilisé pour visualiser des échantillons de tissu de la La peau, le foie, le pancréas, le rein, la thyroïde, le cœur, les muscles striés, le cerveau, les nerfs et les modèles de tumeurs récoltés chez les humains ( Homo sapiens ), les souris ( Mus musculus ), les rats ( Rattus norvegicus ), les porcs ( Sus scrofa domestica ) le furet ( Mustela Furo ), la mouche des fruits ( Drosophila melanogaster ) et le poisson zèbre ( Danio rerio ). Bien que les résultats soient excellents avec la plupart des spécimens ( p . Ex. , Figure 4 , Animation 1 ), les parties centrales de la peau (avec l'épiderme) et les échantillons de cerveau supérieurs à 3 x 3 x 3 mm 3 sont souvent restés non colorés en raison de la pénétration insuffisante de l'éosine à travers Ces tissus.

Protocole sLa section 1.3 a été optimisée pour le traitement de la matière organique fibreuse et utilisée pour visualiser l'architecture des fibres de papier couché, du papier non revêtu, du matériau de substitution dermique natif et du matériau de substitution dermique semé par les cellules souches. Ces échantillons ont été faciles et rapides à traiter. Les données du papier non revêtu et de la plupart des substituts de la peau étaient de bonne qualité ( Figure 5 , Animation 2 ). Des problèmes se sont produits dans le traitement du papier couché, lorsque le matériau anorganique entravait la pénétration de l'éosine. Un autre problème s'est produit lors du traitement des substituts de la peau sur la base de l'agar car ils ont été partiellement digérés par la solution d'infiltration.

Figure 1: flux de travail. Les étapes indiquées dans les boîtes rouges nécessitent des modifications selon les caractéristiques de l'échantillon. Les étapes dans les cases vertes sont celles quiSont similaires dans tous les échantillons. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Moules personnalisés. Les moules peuvent être adaptés en coupant un trou dans le moule d'origine, en insérant l'ampoule d'une pipette Pasteur et en l'étanchant avec des matériaux de modélisation. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: Embrayages illustrés de manière exemplaire. (A, B) embryon de souris récolté au jour embryonnaire, E = 9,5. L'image de la section HREM est affichée dans (A) (B) . (C) Section sagittale virtuelle à travers un modèle volumétrique du cou d'un embryon de souris E15.5. (D) embryon de poulet au stade de développement Hamburger Hamilton (HH) étape 18. Modèle de surface de la luminaire des composants cardiovasculaires combiné avec le rendu du volume de tous les tissus embryonnaires. Barres d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Échantillons de tissus adultes illustrés de manière exemplaire. (A) Partie d'une image de section HREM à travers un nerf humain. Inlay montre une partie de l'image plus en détail. (B) Partie d'une image de la section HREM à travers le foie porcin. Notez le nUclei. (C) Partie d'une image en coupe HREM du tissu lymphatique humain. (D, E) Peau épaisse d'un pouce humain. Modèle 3D volumineux de la totalité de la biopsie. (D) Modèles rendus en surface des artères, des veines et des nerfs devant une résection virtuelle à travers les données HREM (E) . (F) Tumeur expérimentale dans un tissu de souris adulte. Le modèle 3D converti en volume devant trois sections virtuelles à travers les données HREM. Notez les parties nécrotiques (pointes de flèche). Barres d'échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5: matériau fibreux illustré de manière exemplaire. (A, B) Image de la section HREM de papier brun non revêtu. (B) (A) . Notez les fibres et leur lumière. (C) section HREM du papier couché. Notez que les fibres restent non colorées. (D) Modèle de volume de matériau substitutif dermique natif. Notez le calibre différent et la forme des fibres. Barres d'échelle = 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Animation 1: Modèle sous forme de volume de la peau épaisse d'un coussin humain. La taille du bloc de tissu est d'environ 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . La taille de Voxel est de 1,07 x 1,07 x 2 μm 3 . Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.