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Article de méthode

Transplantation de Schwann des cellules à l’intérieur des Conduits de PVDF-TrFE pour combler les souches moelle épinière sectionnée Rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé

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DOI :

10.3791/56077

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3 novembre 2017

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Dans cet article

Résumé

Cet article décrit une technique pour insérer un tube creux entre les souches de la moelle épinière après transection complète et remplissez-le de cellules de Schwann (SCs) et matrice injectable membrane basale afin de combler et de promouvoir la régénération axonale dans le fossé.

Résumé

Parmi les différents modèles pour la blessure de la moelle épinière chez le rat, le modèle de la contusion est le plus souvent utilisé parce que c’est le type le plus commun de la moelle épinière humaine. Le modèle de transection complète, bien que pas aussi cliniquement pertinente que le modèle de la contusion, est la méthode la plus rigoureuse pour évaluer la régénération axonale. Dans le modèle de la contusion, il est difficile de distinguer régénérée des axones germés ou épargnés en raison de la présence d’autres lésions post. Dans le modèle de transection complète, une méthode de raccordement est nécessaire pour combler le vide et de créer une continuité de la rostrale des caudales souches afin d’évaluer l’efficacité des traitements. Une chirurgie de pontage fiable est indispensable pour tester les mesures de résultats en réduisant la variabilité due à la méthode chirurgicale. Les protocoles décrits ici sont utilisées pour préparer Schwann, cellules (SCs) et conduits avant la greffe, une résection complète de la moelle épinière au niveau thoracique 8 (T8), insérer le tube et transplant SCs dans le conduit. Cette approche utilise également en situ gélifiant d’une matrice injectable membrane basale avec transplantation SC qui permet la croissance axonale améliorée via les interfaces rostrales et caudales avec les tissus de l’hôte.

Introduction

Réparation de lésions de la moelle épinière est un problème complex et difficile qui nécessitera une stratégie de traitement combinatoire impliquant, par exemple, l’utilisation de cellules et un biomatériau pour fournir un micro-environnement favorable pour la fonction des cellules transplantées et axon régénération sur le site de lésion. Hémisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 et....

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Protocole

rats femelles adultes de Fischer (180-200 g de poids corporel) sont logés conformément aux directives NIH et USDA. L’utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Miami et un animalier institutionnel approuvé toutes les procédures animaux.

1. préparation avant Transplantation

  1. préparation Conduit.
    1. Coupe le conduit à 5 mm de longueur à l’aide d’une lame #10 sous un microscope à dissection.
      NOTE : Le diamètre intérieur du conduit est entre 2,4 et 2,7 mm ; le diamètre extérieur est de 2,5-2,8 mm.
    2. Plier le conduit doucement le long de la face longitudinale ( Figure 1 a....

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Résultats

L’objectif de l’utilisation de cette technique chirurgicale consiste à évaluer l’utilisation d’un conduit structuré et matrice injectable qui maximise la fonction SC après la transplantation en rempli sectionnées moelles épinières. Trois semaines après la transplantation, les animaux sont perfusés avec paraformaldéhyde à 4 % et les colonnes vertébrales sont grossièrement disséqués et fixe le même fixateur pour encore 24 h. La moelle épinière est ensuite disséquée et les échantillons pour .......

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Discussion

L’étape la plus importante dans la création d’un modèle efficace de transection est sectionnant la moelle épinière dans une ou deux coupes. Un écart de 2 à 2,5 mm entre les souches médullaires rostral et caudale devrait être présent sur le site de transection. Les trois raisons très probables de tel un fossé n’apparaissant ne pas sont (1) les racines dorsales/ventrale n’étaient pas correctement supprimés, (2) la dure-mère ventrale n’a pas été éliminée adéquatement et/ou (3) l’animal n’était pas correctement positionné su.......

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le vecteur Viral et les noyaux de l’Animal au projet de Miami à la paralysie de la Cure pour produisant la lenti-GFP-virus et fournissant soins des animaux, respectivement et l’histologie et noyaux d’imagerie pour l’utilisation du cryostat, microscope confocal, et microscope à fluorescence avec stéréo enquêteur. Financement a été assuré par NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) et NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge est le Christine E Lynn distingué professeur de neurosciences.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacons cryogéniquesThermoFisher Scientific5000-0020
10 cm Boîte de PétriVWR25382-428
Milieu d’Eagle modifié de Dulbecco : mélange de nutriments F-12ThermoFisher Scientific11039-021"DMEM/F12 » dans le protocole.
Pénicilline-streptomycineThermoFisher Scientific15140-122"Pen/Strep » en protcol.
Sérum fœtal bovinHycloneSH300-70-03"FBS » dans le protocole.
Extrait hypophysaireBiomedical TechnologiesBT-215
ForskolinSigma-AldrichF6886
HeregulinR& D Systems396-HB/CF
Poly L-lysineSigma-AldrichP2636"PLL » dans le protocole.
Le milieu d’Eagle modifié de DulbeccoThermoFisher Scientific11965-092« DMEM » dans le protocole.
La solution saline équilibrée de HankThermoFisher Scientific14170-112« HBSS » dans le protocole.
Tryspin-EDTAThermoFisher Scientific15400-054
Rat Fischer femelle (160-180g)Ciseaux Envigo
Vannas, droitFST15018-10
KétamineVedco Inc5098976106100 mg/ml
XylazineLloyd IncAnaSed20 mg/ml
GentamycineAPP PharmaceuticalsNDC 63323-010-02Peut être n’importe quelle marque de choix.
Micro SpatuleFST10089-11Peut être n’importe quelle marque de choix.
Ciseaux incurvés à extrémité émousséeFST14017-18Peut être n’importe quelle marque de choix.
Pince émousséeFST11006-12Peut être n’importe quelle marque de choix.
rongeurFST16121-14Peut être n’importe quelle marque de choix.
Ciseaux à ressort coudésFST15006-09Peut être n’importe quelle marque de choix.
Triangles d’absorptionFST18105-03Peut être n’importe quelle marque de choix.
GelfoamHenry Schein9083300"Mousse compressée » dans le protocole.
#10 lamesSklar06-3010Peut être n’importe quelle marque de choix.
MatrigelCorning354234"Matrice injectable » dans le protocole.
Anticorps anti-protéine fluorescente verte de pouletMilliporeAB16901
Souris RT97 Anticorps anti-hybridomeDSHBRT97
Anticorps anti-neurofilament de lapinEncor Biotechnology, IncPRCA-NF-H
Vaccin polyclonal de lapin anti-Glial Fibrillary Acidic Protein AnticorpsDakoZ033401
Alexa Fluor 488 chèvre anti-poulet IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11039
Alexa Fluor 546 chèvre anti-lapin IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-11035
Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21244
Alexa Fluor 647 chèvre anti-souris IgG (H+L)ThermoFisher ScientificA-21236
Microscopie confocaleNikonclsi

Références

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y.

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Réimpressions et autorisations

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