Évaluation de la fonction microvasculaire tissu adipeux humain en utilisant la vidéomicroscopie

Summary

Vidéomicroscopie systèmes sont utilisés pour étudier les propriétés fonctionnelles des artérioles isolée du tissu adipeux en réponse à des stimuli physiologiques et pharmacologiques. Cette technique permet d’examiner des phénotypes microvasculaires dans des domaines différents du tissu adipeux chez les humains obèses.

Abstract

Alors que l’obésité est étroitement liée au développement de maladies cardiovasculaires et métaboliques, on en sait peu sur les mécanismes qui régissent ces processus. On fait l’hypothèse que pro-athérogènes médiateurs libérés des tissus adipeux en particulier en liaison avec l’adiposité viscérale/centrale pourraient favoriser des changements vasculaires pathogènes localement et systémique, et la notion que les maladies cardiovasculaires peuvent être le conséquence d’un dysfonctionnement du tissu adipeux ne cesse d’évoluer. Nous décrivons ici une méthode unique de vidéomicroscopie qui implique une analyse des réponses de vasodilatateur et vasoconstricteur d’intacts petites artérioles humains retirés du dépôt adipeux des sujets humains vivants. Vidéomicroscopie est utilisé pour examiner les propriétés fonctionnelles des microvaisseaux isolés en réponse à des stimuli pharmacologiques ou physiologiques en utilisant un système sous pression qui imite des conditions in vivo . La technique est une approche utile pour comprendre la physiopathologie et les mécanismes moléculaires qui contribuent à une dysfonction vasculaire localement dans le milieu du tissu adipeux. Par ailleurs, les anomalies de la microcirculation sous-cutanée ont également été liés avec les maladies systémiques. Nous avons appliqué cette technique pour examiner le dépôt des réponses vasculaires chez les obèses. Nous avons évalué la vasodilatation endothélium-dépendante à la fois augmentation du flux et l’acétylcholine en artérioles adipeuses (50-350 µm de diamètre interne, 2-3 mm de long), isolé de deux dépôts adipeux différents au cours de la chirurgie bariatrique de l’individu même. Nous avons démontré que les artérioles de la graisse viscérale montrent avec facultés affaiblies vasodilatation endothélium-dépendante par rapport aux vaisseaux isolés du dépôt sous-cutané. Les résultats suggèrent que le microenvironnement viscéral est associé à la dysfonction endothéliale vasculaire qui peut-être être pertinente à l’observation clinique qui relie l’adiposité viscérale accrue aux mécanismes de la maladie systémique. La technique de vidéomicroscopie peut servir à examiner les phénotypes vasculaires de différents dépôts de graisse mais aussi de comparer les résultats entre les individus avec différents degrés d’obésité et de troubles métaboliques. La méthode peut également être utilisée afin d’examiner les réponses vasculaires longitudinalement en réponse aux interventions cliniques.

Introduction

Vidéomicroscopie est une technique utile utilisée pour examiner la fonction vasomotrice des petites artérioles retirés des sujets humains vivants ex vivo. Notre laboratoire a mis l’accent sur la dissection des microvaisseaux minuscules des compartiments différents tissus adipeux pour caractériser les effets des divers microenvironnements adipeuses sur la microcirculation. Un avantage majeur de cette technique est que les vaisseaux sanguins éliminé de l’organisme humain restent fonctionnels et peuvent être examinés facilement dans les minutes à heures qui suivent la biopsie. Conditions physiologiques sont imitées et stabiliser la pression transmurale maintenue dans l’espace intraluminal via des canules micro-verre qui récapitule beaucoup de caractéristiques en vivo . ^{1 , 2} en outre, un set-up de vidéomicroscopie fiable avec logiciel de détection de bord automatisé permet pour une évaluation qualitative et quantitative de capacité de vasodilatateur et vasoconstricteur indépendante et dépendante de l’endothélium des isolés disposition des vaisseaux en temps réel, permettant une évaluation rapide physiologique en réponse à des stimuli physiques et pharmacologiques. ³ autres techniques microvasculaires sont également disponibles comme des fils myographie qui tend à être beaucoup moins de temps et de mesurer des tensions réponses à divers agonistes par un capteur de force.

Notre laboratoire a demandé vidéomicroscopie afin d’examiner la relation entre l’obésité et la dysfonction vasculaire, mettant l’accent sur les effets de différents tissus adipeux domaines sur le système vasculaire. Adiposité centrale avec une accumulation de graisse viscérale intra-abdominaux a été plus étroitement liée à la production adipocytokine, dysfonction métabolique et risque cardiométabolique. Il a été postulé que le dysfonctionnement du tissu adipeux avec surproduction de dysrégulation de cytokines et adipokine pro-athérogènes sont fortement impliquées dans ces processus, mais les molécules régulatrices spécifiques et des objectifs de traitement restent largement Undiscovered. ⁴ par ailleurs, au niveau local le tissu adipeux, raréfaction capillaire et perfusion altérée ont été liés à la pseudohypoxia du tissu adipeux et le dérèglement métabolique. L’hypothèse que les maladies cardiovasculaires peuvent être la conséquence d’un dysfonctionnement du tissu adipeux est en évolution. Pro-athérogènes médiateurs libérés des matières grasses, en particulier en liaison avec adiposité viscérale/centrale, probablement promouvoir la dysfonction endothéliale et pathogènes changements vasculaires qui peuvent être manifestent localement dans la vascularisation du tissu adipeuse et détectés en utilisant le a décrit dans la présente méthodologie. ⁵

L’évaluation fonctionnelle des artérioles isolée du tissu adipeux est une approche utile pour comprendre la physiopathologie et les mécanismes moléculaires qui contribuent à la dysfonction vasculaire dans l’obésité humaine. Pour étudier les mécanismes qui contribuent à la graisse dysfonction de dépôt spécifiques, nous avons développé des méthodes pour examiner l’endothélium-dépendante et - des réponses vasodilatatrices indépendantes de la microcirculation, évalue l’expression de diverses réglementaires candidats en paires viscérales et sous-cutanée (SC) du tissu adipeux spécimens provenant de sujets obèses au moment de la chirurgie bariatrique.

Protocol

le protocole et les exemples décrits ici ont été approuvés par Boston University School de médecine Institutional Review Board (IRB, protocole #H-25644) et ont été menées conformément à la déclaration d’Helsinki. Tous les sujets fournis consentement éclairé avant participation.

1. préparation des Solutions et des canules Micro-verre

1. Préparez la solution saline acide 4-2-hydrosyethyl-1-piperazineethanesulfonic (HEPES). Pour 1 L, dissoudre 8,059 g de NaCl, 0,298 g KCl, g 0,296 MgSO ₄ • 7 H ₂ O, g 0,235 CaCl ₂ • 2 H ₂ O, 0,16 g KH ₂ PO ₄, 0,01 g EDTA, 1,081 g D-Glucose et 2,383 g d’acide HEPES dans 950 mL d’eau désionisée eau. Porter au volume à 1 L avec de l’eau désionisée. Ajuster le pH à 7.4 à l’aide de NaOH. Un tampon HEPES peut être conservé jusqu'à 7 jours à 4 ° C.
2. Préparer les 20 x Stock tampon salin. Pour 1 litre, ajouter 143,8 g de NaCl, 7,0 g KCl, 5,9 g MgSO ₄ et 7,4 g CaCl ₂ • 2 H ₂ O dans 900 mL d’eau distillée. Composent de volume à 1 L avec de l’eau désionisée. Conserver la solution-mère à 4 ° C.
3. Préparer les 20 x Stock régulateur. Pour 1 litre, ajouter 26,8 NaHCO ₃ et 0,2 g EDTA·2H ₂ O dans 900 mL d’eau désionisée. Composent de volume à 1 L avec de l’eau désionisée. Conserver la solution-mère à 4 ° C.
4. Prépare la Solution de KREBS à utiliser pendant les expériences physiologiques. Pour 1 litre, ajouter 50 mL 20 x Stock tampon, 900 mL d’eau désionisée, 50 mL de 20 x tampon salin, 0,99 g D-Glucose et 0,16 g KH ₂ PO ₄. Ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Pour maintenir le pH du tampon, remuez constamment et couvrir avec de la paraffine ou bouillonner continuellement.
   1. Vérifier le pH chaque 20 min. faire la solution de KREBS fraîches par jour.
5. Faire des canules micro-verre d’un diamètre intérieur de 40 à 240 µm à l’aide d’un extracteur d’aiguille/pipette disponible dans le commerce. La taille des canules de verre est déterminée par la taille du diamètre interne des vaisseaux sanguins isolés (50-350 µm). Vous pouvez également acheter des canules micro-verre de la taille prédéterminée.

2. Préparation des réactifs

1. Prepare l’acétylcholine (Ach, 10 ^-2 M, la solution-mère). Dissoudre 18,29 g dans 10 mL d’eau désionisée. Stocker 1 ml de solution mère (10 ^-2 M) à-80 ° C. Le jour de l’expérience en série diluée pour obtenir les concentrations suivantes de travail : 10 ^-5, 10 ^-6, 10 ^-7, 10 ^-8 10 ^-9 M.
2. Préparer la papavérine (2 x 10 ^-2 M, solution-mère). Dissoudre 0,07517 g dans 10 mL d’eau désionisée. Préparer 10 µL d’extraits de solution-mère et les conserver à -80 ° c en série diluer pour obtenir 10 ^-4, 10 ^-5, 10 ^-6, 10 ^-7, 10 ^-8 M le jour de l’expérience.
3. Préparer l’endothéline-1 (ET-1, 2 x 10 ^-5 M, solution-mère). Dissoudre 50 µg de l’endothéline-1 dans 1 mL de 1 % BSA/PBS. Stocker 1 ml de solution mère (2 x 10 ^-5 M) à-80 ° C. Le jour de l’expérience diluée pour obtenir une concentration de travail de 10 ^-10 M le jour de l’expérience.
4. Conserver les réactifs en langage-20 ° C ou jusqu'à-80 ° C selon le type de congélateur disponible, mais pas plus de 6 mois.

3. Collection de tissus adipeux et préparation de bateau

1. recrue hommes obèses et les femmes (indice de masse corporelle (IMC) ≥ 35 kg/m², l’âge ≥ de 18 ans) inscrits au programme de chirurgie bariatrique à Boston Medical Center (BMC). Un total de 40 sujets ont participé à ces expériences.
2. Recueillir des échantillons de tissu adipeux sous-cutané et viscéral lors de chirurgies bariatriques prévues par le chirurgien effectue l’opération.
   1. Récolte la sous-cutanée le tissu adipeux viscéral et de la paroi abdominale inférieure de graisse de l’épiploon grandes, respectivement. Taille de l’échantillon de tissu graisseux typique varie de 3 à 10 mg de tissu.
   Tissus de
   2. lieu immédiatement au froid HEPES tampon solution avec un pH de 7,4 et conserver à 4 ° C pendant 24 h jusqu'à
      NOTE : En outre, artérioles adipeuses peuvent provenir de personnes maigres aussi bien au cours d’autres types d’interventions chirurgicales telles que la réparation d’hernie ou de chirurgie plastique et peut également être biopsiés du dépôt sous-cutané par biopsie cutanée trans coussinets adipeux abdominal < sup Class = « xref » > 6.
3. à l’aide d’un microscope de dissection tissulaire, les micro-ciseaux et les micro-pinces, retirez soigneusement environnantes de graisse et de tissu conjonctif des petites artérioles adipeuses (50-350 µm de diamètre ENDOLUMINAL, 2-3 mm de long).
4. Tie toutes les branches sur les artérioles à l’aide de minuscule nylon ou soie sutures avant canulant sur les pipettes capillaires de verre. Décortiquer soigneusement les artérioles puisque même légers dommages de la paroi de l’artériole provoque des changements fonctionnels importants.
   1. Minimize navire exposition à la lumière et la chaleur qu’elle peut provoquer une vasodilatation. Puisqu’il peut être parfois difficile à distinguer des artérioles de veinules, identifier le ton taille et des muscles lisses des vaisseaux par mordiller les bouts des vaisseaux. Artérioles sont généralement plus petits et démontrer ton supérieur par rapport aux veinules.
5. Préparer la chambre de l’orgue. Remplir lentement les pipettes capillaires de verre et tubes en caoutchouc avec une solution de KREBS à l’aide d’une seringue de 10 mL.
6. Une fois que les tubes en caoutchouc est rempli et pipettes capillaires de verre sont immergés dans une solution de KREBS dans la salle d’orgue, canule dans les artérioles solidement sur les pipettes sécurisés et attacher les deux extrémités de l’artériole avec du nylon ou nœuds de suture en soie soigneusement.
7. Remplir la chambre d’orgue avec une solution de KREBS à 2 mL.
8. Fixer la chambre d’orgue sur une scène avec le microscope inversé (objectif de grossissement 10 X / 0.25) et caméra vidéo.
9. Tourner sur le logiciel de détection de bord qui est diffusé en temps réel à une fréquence d’échantillonnage de 1 kHz (1 image/s).
10. Branchez un côté du tuyau sous pression à la solution de KREBS réservoirs remplis de pression libre de microbulles, que bulles peuvent présenter des erreurs expérimentales. Connectez l’autre extrémité du tuyau sous pression de la chambre d’orgue.
11. Relier les réservoirs de pression KREBS solution remplie vers le transducteur de pression avec la tuyauterie propre.
12. Contrôle les flux intra-luminale en réglant la hauteur de ces deux réservoirs ; par conséquent, lorsque les réservoirs sont placés à la même hauteur, aucun flux intra-luminal se produira.
13. Une fois que tous ces processus sont terminés, allumez le chauffage bloc et logiciel programme pour maintenir la température à 37 ° c en continu perfuse le bateau avec une solution de KREBS et aérer avec un mélange de gaz de 5 % de CO ₂, 21 % O ₂ et 74 % N ₂ ^{7 ,}, ⁸, pendant toute la procédure expérimentale.
14. Pour atteindre la pression désirée inside la lumière des vaisseaux isolés augmenter graduellement la pression intraluminale (5 mmHg, toutes les 5 min) par l’intermédiaire de l’unité de commande de pression dans le panneau de myo-interface, faisant lentement pour éviter d’endommager la couche endothéliale.
    Remarque : Lorsque la pression atteint 60 mmHg, une période d’équilibration de 20 à 30 min est nécessaire pour stabiliser le navire. Toutes les études de la fonction vasculaire sont effectuées à 60 mmHg et 37 ° C à un pH de 7,4. ⁷

4. Évaluation de la fonction microvasculaire adipeuse

Remarque : en général, la vasodilatation endothélium-dépendante arteriole adipeuse peut être déclenchée en réponse à physiologiques (induite par le flux) et des stimuli pharmacologiques (induite par l’Ach).

1. 1. De la vasodilatation induite par l’écoulement, dépendant de l’endothélium pressurisation, enregistré le diamètre de l’artériole adipeuse au repos (Di). Ceci est dénommé le diamètre de base au repos.
   2. Pré constriction des vaisseaux sanguins de ~ 55 % du diamètre de base au repos (Dp) en ajoutant 1 µL de l’endothéline-1 (ET-1, 10 ^{− 10} M) directement à la salle de bain et attendre 5 min pour effet. Répétez ce processus jusqu'à ce qu’atteignant les désiré ~ 55 % resserrée pré État.
   3. Suite pré constriction, induisent un flux continu dans l’espace intraluminale des artérioles de tissu adipeux, en égalité et en directions opposées afin qu’une différence de pression peut être développée à travers le navire sans altérer la pression intraluminale moyenne de 60 mmHg.
      NOTE : par exemple, si un seul réservoir se déplace vers le haut de 10 cm de hauteur, celle-ci doit être déplacé vers le bas de 10 cm à altérer les gradients de pression et ainsi changer le débit intraluminale. Si des mesures de taux de flux plus précises sont nécessaires, un système de débitmètre quantitative peut être appliqué pour le montage expérimental.
   4. Mesurer la dilatation médiée par les flux 3-5 min après le début de l’induction de l’écoulement. Les niveaux de flux intraluminal (gradients de pression) peuvent être de l’ordre de 0 - 100 cmH ₂ O. augmenter chaque incrément de gradient de pression de Δ10 cmH ₂ O toutes les 5-6 min, jusqu'à un maximum de 100 cmH ₂ O.
      NOTE : Afin d’inciter à flux laminaire stable dans la lumière, les deux diamètres de verre micro canule ont besoin d’être très proche de diamètre intérieur des artérioles ; dans le cas contraire, il produira un écoulement turbulent à l’intérieur de lumen et induire des erreurs de mesure non désirées.
   5. Suite à l’évaluation des flux-médiée par dilatation, réservoirs de pression de retour à la même hauteur (60 mmHg).
   6. Puis, laver l’artériole et chambre en retirant immédiatement solution chambre et remplacer par une solution fraîche de KREBS. Cela se fait avec prudence pour ne pas perturber l’artériole suspendu au sein de la chambre de.
   7. Répéter cette opération 3 ou 4 fois pendant 20-30 min, ou jusqu'à ce que le navire isolé renvoie au repos diamètre base.
2. La vasodilatation induite par l’acétylcholine, dépendant de l’endothélium,
   1. lorsque l’artériole adipeuse est revenue au diamètre de base au repos, avant de se contracter navire ~ 55 % par l’administration de l’endothéline-1 (ET-1, 10 ^{− 10} M) directement à la salle de bain, comme décrit ci-dessus dans la section 4.1.2.
   2. Suite pré constriction, séquentiellement administrer des doses croissantes (2 µL) de l’acétylcholine qui est un agoniste médiée par les récepteurs, l’oxyde nitrique (Ach, 10 ^-9 à 10 ^-5 M) directement dans le bain. Enregistrer le changement de diamètre artériolaire 5 min après l’administration de chaque dose.
   3. Une fois que le navire a atteint un plateau après l’administration de la dernière dose de Ach, laver le bateau de 3 - 4 fois avec une solution de KREBS. Laisser 20 à 30 min de bateau récupérer et retourner au diamètre de la base de repos. Afin de maintenir le pH dans la cambrure de l’orgue, changer une solution de KREBS chaque 15 min.
3. Incuber l’artériole avec N _w - nitro - l-arginine méthyl ester (L-NAME, 10 ^-4 M), un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase pendant 30 min et puis répétez 4.2.1 et 4.2.2 pour caractériser la contribution relative des l’oxyde nitrique pour la vasodilatation induite par l’Ach.
4. Évaluer la vasodilatation indépendante de l’endothélium (fonction de muscle lisse vasculaire) et la viabilité de navire par une administration séquentielle des doses croissantes de la papavérine (10 ^-8 à 10 ^-4 M) directement dans le bain. Si le diamètre du vaisseau n’a pas revenir, ou dépasser le diamètre de base (Di) au repos en réponse à la papavérine (c.-à-d. la vasodilatation approprié), examiner le navire non viables et jeter les points de données.

5. Analyse des données et calcul

1. calculer la réactivité vasculaire. Vasodilatation pourcentage pour l’expression de données permet de tenir compte des différences de niveau de référence au diamètre du vaisseau et de calculer à l’aide de l’équation suivante :
   % vasodilatation = (DT-Dp/Di-Dp) × 100
   où DT est le diamètre enregistré à un moment donné (au maximum diamètre), le Dp est le diamètre enregistré après l’addition de l’agent de la vasoconstriction (i.e. ET-1 induite par le diamètre de constriction), et Di est le diamètre enregistré juste avant l’ajout de l’agent de la vasoconstriction (diamètre de base au repos). ⁹
2. définir la sensibilité de la vasodilatation et la vasoconstriction (dose-réponse) à un agoniste comme la concentration de l’Ach, papavérine ou ET-1 qui obtient 50 % de la réponse maximale (EC ₅₀) qui peut être définies par un paramètre sigmoïde et tracés, comme décrit plus haut. ¹⁰
   Remarque : les études de reproductibilité inter observateur de vasodilatation des microvaisseaux adipeuses a un coefficient de corrélation élevé (CC) de 0,99 (n = 10 expériences de navire) dans notre laboratoire.

6. analyse statistique

1. Express continue de mesures en moyenne ± SEM Ceux-ci tendent à être normalement distribué. Analyser la réactivité vasculaire en artérioles adipeuses par mesures répétées ANOVA bidirectionnelle.
2. Sinon, comparer l’aire sous la courbe (AUC) de la courbe cumulative vasodilatation dose-réponse entre les groupes de traitement. Dans tous les cas, envisager de P < 0,05 statistiquement significative.

Results

Notre laboratoire a utilisé la vidéomicroscopie à examiner l’endothélium-dépendante et - vasodilatation indépendante, ainsi que vasocontractile fonction des artérioles de tissu adipeux isolé de gras sous-cutané et viscéral de l’homme obèse. Le montage expérimental caractéristique est affiché dans la Figure 1 a. Le tissu adipeux artérioles sont suspendus entre deux pipettes capillaires de verre et maintenus en place avec des sutures dans la salle d’orgue comme...

Discussion

La dissection et l’isolement des artérioles adipeuses des tissus environnants peuvent être un processus long et fastidieux avec une attention particulière aux détails et le protocole technique. La procédure de microdissection nécessite compétences méticuleux et ustensiles de dissection spécialisées pour prévenir les dommages potentiels pour le muscle lisse ou endothéliale de cellules couches de la microcirculation. Même minuscules piqûres accidentelles dans la paroi artériolaire peuvent empêcher intraluminal pressurisati...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom chimique
Acétylcholine	Sigma Aldrich	A6625
Chlorure de calcium (CaCl2)	Sigma Aldrich	223506
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G5767
Endothéline-1	Sigma Aldrich	E7764
Éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N,N,N',N'-acide tétraacétique (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889
Acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
Nw-nito-L-arginine chlorhydrate d’ester méthylique	Sigma Aldrich	N5751
Sulfate de magnésium (MgSO4)	Sigma Aldrich	M7506
Chlorure de potassium (KCL)	Sigma Aldrich	P3911
Phosphate de potassium (KH2PO4)	Sigma Aldrich	P5655
Papaverine	Sigma Aldrich	P3510
Bicarbonate de sodium (NaHCO 3 )	Sigma Aldrich	S6014
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma Aldrich	S7653
Phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH2Po4)	Sigma Aldrich	S9638
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Equipment
Forceps	Outils de sciencefine	15000-08
Microscope inversé	Zeiss Achromat
Tubulure de laboratoire	Euro-Pharm	250100306F999
Extracteur d’aiguilles/pippettes	David kopf instruments	720
Suture ophtalmique en nylon monofilament	Spécialités chirurgicales	A7756N
Ciseaux	Outils Finescience	150000-08
Chambre	vasculaire DMT	VAS v.2.1