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Article de méthode

Confocale, imagerie du Neuropeptide Y-pHluorin : une Technique pour visualiser l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots murins et humains intacts

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DOI :

10.3791/56089

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13 septembre 2017

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1Department of Medicine, University of Miami, 2Department of Medicine, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

Les auteurs décrivent un protocole pour la visualisation de l’exocytose de l’insuline dans les îlots intacts à l’aide de pHluorin, une protéine fluorescente verte sensibles au pH. Les îlots isolés sont infectées par l’adénovirus encodage pHluorin couplé à la vésicule fret neuropeptide Y. Cela permet la détection des événements de fusion granule insuline par microscopie confocale.

Résumé

La sécrétion de l’insuline joue un rôle central dans l’homéostasie du glucose dans des conditions physiologiques normales aussi bien que dans la maladie. Approches actuelles à étudier l’insuline granules cytotoxiques qu'utiliser électrophysiologie ou microscopie couplée à l’expression de reporters fluorescents. Cependant, la plupart de ces techniques ont été optimisée pour les lignées clonales ou besoin se dissociant des îlots pancréatiques. En revanche, la méthode présentée ici permet de visualisation en temps réel de l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots pancréatiques intacts. Dans ce protocole, nous décrivons tout d’abord l’infection virale des îlots pancréatiques isolés par l’adénovirus qui encode une pH-sensibles à la protéine fluorescente verte (GFP), pHluorin, couplée au neuropeptide Y (NPY). En second lieu, nous décrivons le confocal imagerie des îlots cinq jours après une infection virale et comment contrôler la sécrétion d’insuline granule. Brièvement, les îlots infectés sont placés sur un lamelle couvre-objet sur une chambre d’imagerie et imagés sous un microscope confocal à balayage laser vertical tout en étant continuellement perfusés avec solution extracellulaire contenant divers stimuli. Images confocales couvrant 50 µm de l’îlot sont acquis en Time-lapse enregistrements à l’aide d’un scanner rapide résonant. La fusion de granules de l’insuline avec la membrane plasmique peut être suivie au fil du temps. Cette procédure permet de tester une batterie de stimuli dans une expérience simple également, est compatible avec les souris et les îlots humains et peut être combinée avec différentes teintures pour l’imagerie fonctionnelle (p. ex., colorants de calcium cytosolique ou potentiels de membrane).

Introduction

L’insuline est produite par les cellules bêta de l’îlot pancréatique et c’est un important régulateur du métabolisme de glucose1. La mort ou la dysfonction des cellules bêta perturbe l’homéostasie du glucose et mène au diabète2. L’insuline est emballé dans les granules denses-core qui sont libérés d’un Ca2 +-dépendante manière3. Élucider comment les granules cytotoxiques de l’insuline est régulée est essentiel pour bien comprendre ce qui détermine la sécrétion d’insuline et ouvre de nouvelles voies pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du diabète.

Exocytose d’insuline a été étudiée en utilisant des approches électrophysiologiques, telles que les mesures de capacité membranaire et approches microscopiques en combinaison avec des molécules fluorescentes. Les mesures de capacité membrane ont bonne résolution temporelle et permettent des enregistrements de cellule unique. Cependant, des changements dans la capacité reflètent la variation nette de surface de la cellule et ne pas capturer les événements de fusion individuels ou distinguer fusion de granules de l’insuline d’autres vésicules de sécrétion non insulino-3. Les approches microscopiques, telles que la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion interne totale ou deux photons en combinaison avec des sondes fluorescentes et protéines de vésicule de cargo, fournissent des détails supplémentaires. Ces techniques de capture des événements exocytotique uniques et aussi les phases préalables- et post-exocytotique et peuvent être utilisés pour l’étude des tendances exocytotique dans les populations de cellules3.

Fluorescents reporters peuvent être de trois types : 1) extracellulaire, 2) cytoplasmique ou 3) vésiculaire. 1) extracellulaires reporters sont des traceurs polaires (par exemple, dextrans, la sulforhodamine B (SRB), lucifer jaune, pyranine) qui peuvent être introduits dans le milieu extracellulaire4. L’utilisation de traceurs polaires permet d’enquête sur le pore de fusion dans une population de cellules et capture des différentes structures intercellulaires tels que les vaisseaux sanguins. Toutefois, ils ne signalent pas sur le comportement de cargaison de vésicule. 2) cytoplasmiques reporters sont des sondes fluorescentes, couplés à des protéines associées aux membranes qui face le cytoplasme et sont impliqués dans la station d’accueil et d’exocytose. Les exemples incluent des membres de la famille de récepteurs (SNARE) en protéines soluble Nfacteur sensible - éthylmaléimide attachement qui ont été utilisées avec succès en neurosciences pour l’étude des neurotransmetteurs release5. Ces protéines ont des partenaires multiples et ne sont pas l’insuline-granule spécifique. 3) vésiculaires reporters sont des sondes fluorescentes fusionnés aux protéines cargo vésiculaire qui permettent pour l’étude du comportement de la vésicule de marchandises spécifiques. Protéines spécifiques fret insuline-granule comprennent, entre autres, l’insuline, peptide c, polypeptide amyloïde d’îlot et NPY6,7. NPY n’est présent que dans l’insuline contenant des granules et est publié conjointement avec l’insuline, ce qui en fait un excellent partenaire pour un journaliste fluorescent8.

La fusion de différentes protéines fluorescentes NPY a été précédemment employée pour étudier divers aspects de l’exocytose dans les cellules neuroendocrines, telles que l’exigence de la synaptotagmine spécifique isoformes9,10 et comment le temps de sortie dépend sur le cytosquelette d’actine et la myosine II11,12. Dans cette étude, nous avons choisi pHluorin comme le journaliste fluorescent, qui est une mis à jour le GFP qui est non fluorescent au pH acide à l’intérieur du noyau dense granules mais devient brillamment fluorescent lors de l’exposition au neutre pH extracellulaire13. Granulés à insuline matures ont un pH acide inférieures à 5,5. Une fois que le granule fusionne avec la membrane plasmique et ouvre, sa cargaison est exposée au neutre pH extracellulaire de 7.4, permettant l’utilisation de la pHluorin de protéines sensibles au pH comme reporter7,14.

Compte tenu du caractère sensible de pH de pHluorin et l’expression sélective de NPY dans les granules de l’insuline, la construction de fusion NPY-pHluorin peut être utilisée pour étudier les différentes propriétés des granules cytotoxiques de l’insuline. La livraison virale de la construction de fusion assure un rendement élevé de transfection et travaille sur des cellules primaires de bêta ou de lignées cellulaires ainsi que sur les îlots isolés. Cette méthode peut également être utilisée comme ligne directrice pour étudier l’exocytose dans tout autre type de cellule avec vésicules contenant NPY. Il peut aussi être combiné avec n’importe quel modèle de souris transgénique pour étudier les effets de certaines conditions (passes rabattues, la surexpression, etc.) sur l’exocytose. Cette technique a été précédemment utilisée pour caractériser les tendances spatiales et temporelles de l’insulinosécrétion granule dans les populations de cellules bêta dans les îlots humains15.

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Protocole

le Comité d’éthique animale de l’Université de Miami a approuvé toutes les expériences.

1. viral Infection d’Intact isolée humaine ou les îlots pancréatiques de souris

  1. culture de l’Islet : préparer les milieux de culture d’îlot : Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10 % (v/v) de SVF et 2 mM de L-Glutamine.
    1. Homme îlots pancréatiques sont obtenus à partir du programme intégré de Distribution îlot (NIDDK, NIH). À l’arrivée, transfert des îlots (~ 500 équivalents d’îlot) à 35 mm non-culture de tissus traités Pétri avec 2 mL de milieu de culture CMRL à 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 pendant 24 h avant l’infection virale.
    2. Souris îlots pancréatiques peuvent être isolés suivant les protocoles établis précédemment 16. Suite à l’isolement, la culture ~ 200 équivalents d’îlot en 35 mm non-culture de tissus traitement Pétri avec 2 mL de milieu de culture CMRL à 37 ° C, 5/95 % CO 2/o 2 pendant 24 h avant l’infection virale.
      Remarque : Évitez d’utiliser des souris transgéniques avec des journalistes GFP ou YFP exprimées sur des îlots pour éviter les chevauchements de fluorescence avec NPY-pHluorin.
  2. Préparation de virus
    Remarque : la fusion de NPY-pHluorin a été clonée dans le vecteur de pcDNA3 10 et subcloned dans un vecteur adénoviral pour production adénoviraux [adénovirus sérotype 5 (DE1/E3)] par un adénovirus recombinant entreprise de fabrication. Le virus a été aliquotés et congelés à-80 ° C. Le stock viral est fourni par la compagnie aux concentrations de 10 12 à 10 particules virales 13 (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).
    1. Pour in vitro infection de l’îlot, utilisation 10 6 UFP/mL, ce qui entraîne une multiplicité approximative d’infection (MOI) d’environ 2 (voir la Discussion pour plus de détails)
  3. Infection virale des îlots pancréatiques
    ATTENTION : Travailler avec les adénovirus requiert de certification et des procédures de niveau de biosécurité 2 (BSL2). Vérifier avec l’agent de prévention des risques biotechnologiques institutionnels d’orientation et de formation sur les procédures BSL2.
    1. Préparer humain/souris îlots comme décrit ci-dessus.
    2. Ajouter 5 à 10 µL de virus stock dans chaque 35 mm boîte de Pétri contenant des îlots de l’homme/souris dans 2 mL de milieu de culture CMRL (avec 10 % FBS et 2 mM de L-Glutamine).
      Remarque : Régler le volume du virus utilisé après le titre viral tel que prévu par la feuille de données entreprise.
    3. Culture des îlots en contenant le virus médias à 37 °C/5% CO 2 pendant 24 h.
    4. Après 24h, aspirer le support contenant le virus et les remplacer par 2 mL de milieu de culture CMRL (avec 10 % FBS et 2 mM de L-Glutamine).
    5. Culture des îlots pour les 4-6 jours à 37 °C/5% CO 2, remplaçant les médias tous les 3 jours.
    6. Après 4 - 6 jours de culture, attendre environ 30 % des cellules des îlots pancréatiques d’être infectés. Îlots peuvent ensuite être utilisés pour des expériences d’imagerie live.

2. Confocal Imaging d’infectés îlots

Remarque : se référer à la Table des matières pour les matériaux et l’équipement requis pour l’imagerie confocale.

  1. Réactif préparation et montage expérimental
    1. préparent la solution extracellulaire : ajoutez 125 mM NaCl, KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, 0,1 % de BSA, 5,9 mM pH 7,4, stérile filtré.
      NOTE : Cette mémoire tampon est normalement préparé sans glucose et peut être stocké à 4 ° C pendant environ 1 mois. Le glucose est ajouté sur le jour de l’expérience pour atteindre la concentration finale souhaitée.
      1. Préparer un milieu glucosé basal (3 mM) : Ajouter 75 µL de stock de glucose de 2 M à 50 mL de solution extracellulaire.
      2. Médium hyperglycémiques (16 mM) : ajouter 400 µL du stock de glucose de 2 M à 50 mL de solution extracellulaire
    2. Diluer tout stimulus supplémentaire (p. ex., KCl ou adénosine triphosphate (ATP)) en solution extracellulaire contenant du glucose de 3 mM.
    3. Avant de commencer une expérience, Prétraiter les lamelles couvre-objet avec poly-D-lysine en ajoutant 30 µL de solution de poly-D-Lysine (1 mg/mL) à la lamelle pendant 1 h et il rincer abondamment avec de l’H 2 O.
      Remarque : Les lamelles de poly-lysine enduit peuvent être stockés à température ambiante jusqu'à 6 mois.
    4. Au moins 1 h avant l’expérience, à l’aide d’une pipette de 1 mL, transférer les îlots à un 35 mm boîte de Pétri contenant une solution extracellulaire avec 3 mM de glucose. Garder les îlots à 37 ° C et 5 % de CO 2.
      Remarque : Si nécessaire, la membrane plasmique peuvent être étiquetée dans cette étape. Pour étiqueter la membrane plasmique, ajoutez le colorant de di-8-ANEPP 2 µM à la solution extracellulaire avec 3 mM de glucose. Incuber les îlots en solution de colorant pendant 1 h à 37 °C/5% CO 2. La teinture de la membrane plasmique peut être excitée à 488 nm et détecté à 620 nm.
    5. min avant de commencer une expérience, fixez la lamelle à la chambre d’imagerie de sceller avec de la graisse de silicone sous vide. Difficulté à la chambre d’imagerie à la plate-forme d’imagerie. À l’aide d’une pipette, placez 20-30 îlots sur la zone de poly-D-Lysine-traités de la lamelle couvre-objet et laissez les îlots adhèrent à la surface pendant 20 min.
      Remarque : Il est important de ne pas laisser la lamelle sécher complètement pour éviter tout endommagement de l’îlot.
    6. Tandis que les îlots sont adhérentes à la lamelle, préparer le système de perfusion en les rinçant abondamment avec de l’eau. Ajouter chaque solution sur un autre canal : 3 mM de glucose (canal 1), 16 mM de glucose (canal 2), 16 mM de glucose avec 100 µM 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) et 10 µM la forskoline (canal 3), 25 mM de KCl à 3 mM de glucose (canal 4), 10 µM ATP dans (glucose) 3 mM canal 5). Enlever toutes les bulles du système en ouvrant chaque canal séparément et en laissant l’écoulement de la solution pendant quelques minutes et s’assurer que l’écoulement est uniforme (0,5 mL/min) et le tuyau ne coule pas.
    7. Connecter le radiateur de solution en ligne unique pour le tuyau de sortie de perfusion et de régler la température du tampon sortant à 37 ° C.
    8. Préparer la pompe d’aspiration. Enlever toutes les bulles du système et s’assurer que l’écoulement est uniforme et la tuyauterie ne coule pas.
    9. Une fois que les îlots adhèrent à la surface de la lamelle couvre-objet, remplir doucement vers le haut de la chambre d’imagerie avec la solution extracellulaire contenant du glucose de 3 mM. Éviter de laver les îlots de la surface de la lamelle.
    10. Place de la plate-forme d’imagerie avec les îlots sur la platine du microscope et branchez-le sur le système de perfusion et la pompe d’aspiration.
    11. Tournant sur l’écoulement et constamment perfuse les îlots avec la solution extracellulaire de la 3G. Le système est maintenant prêt pour l’imagerie confocale.
  2. Imagerie confocale
    1. localiser les îlots dans le champ du microscope avec un grossissement inférieur. Une fois porté sur les îlots, basculez sur objectifs de grossissement plus élevés (p. ex., objectif à immersion à l’eau X 63 (63 X / 0,9 NA)).
    2. Ouvrez l’acquisition à l’aide de logiciels (Table des matières) et activer le mode scanner résonnance.
    3. Sélectionner le mode d’imagerie XYZT et configurer les paramètres d’acquisition comme suit :
      1. tourner sur l’Argon laser et le laser à 488 nm ligne et ajuster la puissance du laser à 50 % pour l’excitation pHluorin.
      2. Recueillir des émissions à 505-555 nm.
      3. Choisir une résolution de 512 x 512 pixels. Appuyez sur la " Live " bouton pour démarrer l’imagerie et de régler les niveaux de gain (gain typique est environ 600 V).
      4. Définir le début et la fin de la pile-z : mettre l’accent sur le dessus de l’îlot et choisissez " begin " et passer au dernier plan qui peut se concentrer et choisissez " fin ". Utilisez une taille de z-étape de 5 µm. Le logiciel calculera automatiquement le nombre d’avions confocale.
      5. Définir l’intervalle de temps pour l’acquisition de chaque pile-z près de 1,5 à 2 s, puis choisissez l’option " acquérir jusqu'à l’arrêt " pour l’imagerie continu.
      6. Presse le " début " bouton pour initialize.
    4. Utiliser différents protocoles de stimulation pour induire des granules cytotoxiques en perfusant les îlots avec les stimuli désirées. Protocoles de stimulation peuvent être personnalisés pour s’adapter à l’objectif scientifique désiré (voir ci-dessous).
  3. Protocoles de stimulation
    Remarque : dans chaque protocole de stimulation, commencer par l’enregistrement au moins 2 min d’activité de fond d’îlot durant la perfusion constante avec solution extracellulaire contenant du glucose de 3 mM. Perfuse avec un stimulant pour la période souhaitée. L’ordre de stimulants, de la durée de la stimulation, ainsi que la durée des enregistrements peuvent être personnalisés pour s’adapter à l’application scientifique désirée. Assurez-vous de laver les îlots avec solution extracellulaire contenant du glucose 3 mM avant de commencer une nouvelle stimulation. Dessous de trouver les protocoles de stimulation d’échantillon qui ont été utilisés pour montrer les capacités de la méthode.
    1. Stimuler avec du chlorure d’ammonium (NH 4 Cl) comme témoin positif pour pHluorin pH sensibilité et l’efficacité de l’infection virale ( Figure 3) : 3 mM de glucose (2 min) → 50 mM NH 4 Cl (2 min) en glucose 3 mM → 3 mM de glucose (2 min)
      Remarque : dans le NH 4 Cl solution, remplacer NaCl sur une base équimolaire.
    2. Stimuler l’insuline granules cytotoxiques en augmentant la concentration en glucose ( Figure 5 et Figure 6) : 3 mM de glucose (2 min) → 16 mM de glucose (15-30 min) → 3 mM de glucose (2 min
      Remarque : Afin de voir de nombreuses salves d’activité, perfuse les îlots en permanence avec la solution de 16 G pendant au moins 15 min.
      NOTE : Afin d’accroître la cohérence des réponses sécrétrices 17, les utilisateurs peuvent ajouter de cAMP de sensibilisation des agents (100µm IBMX et 10 µM forskoline) aux solutions de la 3 G et 16 G. Cela ne modifie pas les patterns temporels de la sécrétion des granules. Pour détails, voir 15 et Discussion.

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Résultats

L’intégralité du workflow de la technique est illustré à la Figure 1. Brièvement, souris ou îlots humains peuvent être infectées par l’adénovirus encodage NPY-pHluorin et imagés, après quelques jours de culture, sous un microscope confocal. Comme granules fusionnent avec la membrane plasmique et ouverte, une augmentation de fluorescence est observée et peut être quantifiée (Figure 1). Pour déterminer si le NPY-pHluorin est en eff...

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Discussion

Cet article décrit une technique qui permet de visualiser l’exocytose des granules de l’insuline dans les cellules bêta dans les îlots pancréatiques intacts par microscopie confocale. Il utilise NPY-pHluorin comme le journaliste fluorescent cloné dans adénovirus pour assurer une efficacité de transfection élevé.

Bien que la méthode était très efficace dans nos mains, il pourrait avoir besoin de quelques modifications qui dépendent principalement de deux paramètres : 1) la qualité de la prépara...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Les auteurs remercient Marcia Boulina de la DRI laboratoire central de l’aide avec les microscopes d’imagerie. Ce travail a été soutenu par les NIH subventions 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), DK111538 R01, ES025673 R33 et R56 DK084321 (AC).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope confocal à balayage laser droitLeica Microsystems, Wetzlar, AllemagneTCS-SP5comprend LAS AF, le logiciel d’acquisition d’images
Chambre d’imagerieWarner instrumentsRC-26
Plate-forme de chambre d’imagerieWarner instrumentsPH-1
22 x 40 lamelles en verreDaiggerbrandG15972H
Vacuum graisse siliconeSigmaZ273554-1EA
Système de perfusion multicanauxWarner instrumentsVC-8
Réchauffeur de solution unique en ligneWarner instrumentsSH-27B
Régulateur de températureWarner instrumentsTC-324C
Pompe d’aspiration péristaltiquePharmaciaP-1
35 mm Boîte de Pétri, VWR10861-586
Milieu, sans glutamineThermoFisher11530037
FBS, inactivé thermiquementThermoFisher16140071
L-Glutamine 200 mMThermoFisher25030081
5 M NaCl solutionSigmaS5150
3 M KCl solutionSigma60135
1 M CaCl2 solutionSigma21115
1 M MgCl2 solutionSigmaM1028
Albumine sérique bovineSigmaA2153
1 M HEPES solutionSigmaH0887
Filtre à videVWR431098
D-GlucoseSigmaG8270
Bromhydrate de poly-D-lysineSigma-aldrichP6407
Di-8-ANNEPThermoFisherD3167
3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)SigmaI5879
ForskolinSigmaF3917
CMRL non traité par culture tissulaire

Références

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Réimpressions et autorisations

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