Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

Résumé

Le protocole AWESAM décrit ici est optimal pour la culture des astrocytes murines isolément des autres cellules du cerveau une manière rapide, simple et peu coûteux. AWESAM astrocytes présentent spontanée Ca^{2 +} signalisation, la morphologie et génétique des profils d’expression semblables aux astrocytes in vivo.

Résumé

Le AWESAM (un low- easy stellate unestrocyte modes de coûts) protocole implique un moyen rapide, simple et peu coûteux de produire de grandes quantités de in vivo-comme la souris et le rat des monocultures astrocyte : Cerveau cellules peuvent être isolées de différentes régions du cerveau, et après une semaine de culture cellulaire, les cellules non-astrocytaires sont secoués en plaçant les récipients de culture sur un agitateur pendant 6 h dans l’incubateur. Les astrocytes restants sont ensuite repiquées dans les nouvelles plaques avec un milieu astrocyte spécifiques (appelé NB + H). NB + H contient des concentrations faibles heparin-binding EGF-like du facteur de croissance (HBEGF), qui est utilisé à la place de sérum dans le milieu. Après une croissance en NB + H, astrocytes AWESAM ont une morphologie stellaire et les longs processus fine. En outre, ces astrocytes ont plus en vivo-comme l’expression des gènes que les astrocytes générées par les méthodes publiées antérieurement. Ca^{2 +} imagerie, la dynamique de la vésicule et autres événements à proximité de la membrane peuvent ainsi être étudiés dans le processus astrocytaires fine in vitro, par exemple, à l’aide de cellules vivantes confocale ou microscope TIRF. Notamment, AWESAM astrocytes présentent aussi spontanée Ca^{2 +} signalisation similaires aux astrocytes in vivo.

Introduction

Astrocytes influencent le fonctionnement du cerveau par le biais de soutien trophique, débit sanguin, signalisation synaptique et plasticité et la communication intercellulaire - qui sont tous des mécanismes qui centré autour des processus astrocytaires minces. Le protocole AWESAM décrit ici permet l’étude de ces processus sans interférence des neurones et autres cellules gliales, qui est utile par exemple, car l’expression de nombreuses protéines et même Ca^{2 +} signalisation se chevauchent dans la cellule du cerveau différentes types. En outre, cette méthode surmonte les limites des techniques déjà disponibles. En particulier, notre protocole prévo....

Protocole

Toutes les expériences animales décrites ici ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour le bien-être animal allemand.

NOTE : La chronologie et les étapes principales du protocole sont illustrées à la Figure 1.

1. les préparatifs

1. Préparer les solutions suivantes.
   1. Préparer le DMEM + pour la culture des astrocytes polygonales de MD : DMEM avec 10 % FCS, pénicilline de U 100 et 100 µg/mL de streptomycine.
   2. Préparer la mise en culture des astrocytes stellaires NB + H : neurobasal moyenne avec 5 ng/mL HBEGF, 1 Supplément de B....

Résultats

Astrocytes qui sont cultivées dans un milieu NB + et cultivées conjointement avec les neurones apparaissent stellaires après 2 semaines de culture (Figure 2). En plus NB + support, les astrocytes cultivés co sont également exposés à des facteurs inconnus dérivé de neurone qui contribuent probablement à leur survie et leur morphologie. En revanche, les astrocytes MD cultivés en DMEM + comme monocultures (après secouer d’autres types de cellules avant passage) .......

Discussion

Quatre étapes dans le protocole sont critiques : 1) préparer la concentration HBEGF à exactement 5 ng/mL, car de petites augmentations de la concentration peuvent conduire à des cultures immatures, par exemple, 10 ng/mL HBEGF différenciera des astrocytes⁴; 2) en évitant de bulles dans les solutions qui contiennent des tissus ou des cellules, qui peuvent changer le pH et diminuer la santé de l’astrocyte ; 3) équilibration des médias pour atteindre le pH optimal et la température pour la cu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,05 % trypsine-EDTA	Gibco	25300054	chaud en 37 º ; C bain-marie avant utilisation
0,25 % trypsine-EDTA	Gibco	25200-056	chaud en 37 º ; C bain-marie avant utilisation
B-27 supplément	Gibco	17504-044	50X stock
Glutamax	Gibco	35050-061	100X stock
Pénicilline / streptomycine	Gibco	15070-063	50 stock ; pénicilline : 5000 U/ml ; streptomycine : 5000 µ ; g/ml
Milieu neurobasal	Gibco	21103049	sans L-glutamine
DMEM	Gibco	41966029
HBEGF	Sigma	4643
HEPES	Gibco	15630080
HBSS	Gibco	14170112
FCS	Gibco	10437028
PBS	Gibco	10010049	1X
100 &mu ; m crépine à cellules en nylon	BD	352360
Trypan Blue	Sigma	T8154  ;
Incubateur de culture cellulaire	Thermo Fisher Scientific	Hera Cell 240i Incubateur
Agitateur de laboratoire	Heidolph	Rotamax 120  ;	Utilisation à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire
Centrifugeuse	Eppendorf	5810 R  ;

de culture cellulaire