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Article de méthode

Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

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DOI :

10.3791/56092

⸱

10 janvier 2018

 , 
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

Dans cet article

Résumé

Le protocole AWESAM décrit ici est optimal pour la culture des astrocytes murines isolément des autres cellules du cerveau une manière rapide, simple et peu coûteux. AWESAM astrocytes présentent spontanée Ca2 + signalisation, la morphologie et génétique des profils d’expression semblables aux astrocytes in vivo.

Résumé

Le AWESAM (un low- easy stellate unestrocyte modes de coûts) protocole implique un moyen rapide, simple et peu coûteux de produire de grandes quantités de in vivo-comme la souris et le rat des monocultures astrocyte : Cerveau cellules peuvent être isolées de différentes régions du cerveau, et après une semaine de culture cellulaire, les cellules non-astrocytaires sont secoués en plaçant les récipients de culture sur un agitateur pendant 6 h dans l’incubateur. Les astrocytes restants sont ensuite repiquées dans les nouvelles plaques avec un milieu astrocyte spécifiques (appelé NB + H). NB + H contient des concentrations faibles heparin-binding EGF-like du facteur de croissance (HBEGF), qui est utilisé à la place de sérum dans le milieu. Après une croissance en NB + H, astrocytes AWESAM ont une morphologie stellaire et les longs processus fine. En outre, ces astrocytes ont plus en vivo-comme l’expression des gènes que les astrocytes générées par les méthodes publiées antérieurement. Ca2 + imagerie, la dynamique de la vésicule et autres événements à proximité de la membrane peuvent ainsi être étudiés dans le processus astrocytaires fine in vitro, par exemple, à l’aide de cellules vivantes confocale ou microscope TIRF. Notamment, AWESAM astrocytes présentent aussi spontanée Ca2 + signalisation similaires aux astrocytes in vivo.

Introduction

Astrocytes influencent le fonctionnement du cerveau par le biais de soutien trophique, débit sanguin, signalisation synaptique et plasticité et la communication intercellulaire - qui sont tous des mécanismes qui centré autour des processus astrocytaires minces. Le protocole AWESAM décrit ici permet l’étude de ces processus sans interférence des neurones et autres cellules gliales, qui est utile par exemple, car l’expression de nombreuses protéines et même Ca2 + signalisation se chevauchent dans la cellule du cerveau différentes types. En outre, cette méthode surmonte les limites des techniques déjà disponibles. En particulier, notre protocole prévoit en vivo-comme la morphologie (astrocytes stellaires avec les processus minces) et l’expression des gènes dans un rapide, facile et la manière bon marché.

La morphologie cellulaire, l’expression des gènes et nombreux autres processus réglementaires sont directement influencées par l’environnement. Dans une boîte de Petri, il s’agit des facteurs libérés par les cellules environnantes, mais aussi le milieu dans lequel les cellules sont cultivées. Pour les astrocytes, HBEGF a été signalé auparavant pour induire une morphologie stellaire1 mais s’est avéré également pour différencier des astrocytes2. Cependant, des concentrations plus faibles de HBEGF ont été plus tard utilisées à produire plus en vivo-comme les astrocytes identifiés par séquençage de RNA dans deux protocoles différents3,4. En outre, la morphologie astrocytaire change avec la composition du milieu, quel que soit le protocole n°4: Neurobasal moyen avec une faible concentration de HBEGF est optimale pour la culture des astrocytes stellaires, tandis que d’autres compositions moyennes (par exemple, sérum contenant DMEM) produisent des cellules polygonales (même dans les astrocytes fraîchement isolées par immunopanning).

Le protocole AWESAM surmonte les inconvénients techniques précédentes pour astrocyte monocultures4de plus en plus. Les techniques précédentes pour la culture de monocultures astrocyte ont les inconvénients suivants : morphologie polygonale, qui est inhabituelle des astrocytes stellaire en vivo (méthode de MD)5; la longueur et le coût du protocole (préparation des astrocytes de prend des cellules souches pluripotentes induites trois mois et nécessite de nombreux réactifs, y compris les facteurs de croissance coûteuses)6; les faibles quantités de matière (méthode immunopanning)3; la dédifférenciation des astrocytes et exigence d’une matrice 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. en revanche, le protocole AWESAM offre : en vivo-comme la morphologie (astrocytes stellaires avec les processus minces) ; un rapide, facile et la méthode bon marché ; grandes quantités de matériel ; et le plus en vivo-comme l’expression des gènes par rapport à immunopanned et astrocytes MD. De plus, la culture 2D permet l’étude de signalisation Ca2 + et de recyclage dans les processus de minces et dans les événements à proximité de la membrane de vésicules (p. ex., microscope TIRF n’est pas possible dans les cultures 3D).

La méthode de MD a été largement utilisée depuis sa publication en 19805, propose une technique simple et rapide pour les monocultures astrocyte polygonale. En bref, la méthode de MD entraîne les cellules du cerveau mixtes croissant dans le sérum de veau foetal (FCS)-contenant DMEM, suivi en secouant les étapes qui enrichissent des astrocytes (comme toutes les autres cellules du cerveau types se détachent de la capsule) et la culture plus loin dans le même milieu. DMEM supplémenté avec FCS est utilisé pour de nombreux autres types de cellules, allant des fibroblastes et des adipocytes aux lignées cellulaires de cancer différents, qui partagent tous la morphologie polygonale exposée par les astrocytes MD dans la culture. Jusqu’au début des années 20007, peu d’attention a été accordée aux médias adaptés aux astrocytes, plus précisément à favoriser leur morphologie stellaire typique trouvé in vivo. Un seul protocole publié en 2011 réaliser cette morphologie stellaire : appelle la méthode immunopanning, elle emploie un milieu sans sérum optimisé pour la culture des astrocytes3. En utilisant cette méthode, les cellules du cerveau fraîchement isolées sont exposés à une série de plats recouverts d’anticorps qui ciblent les protéines de surface cellulaire spécifique de type cellulaire, d’enrichir pour les astrocytes. Malgré le plus en vivo-comme profil de morphologie et d’expression des astrocytes d’immunopanned, la majorité des études in vitro dépendre encore de la méthode d’astrocyte MD. La méthode de MD est simple et rapide, tandis que la méthode d’immunopanning compte les plus complexes et fastidieuses étapes sur la première journée de la culture (telles que de plus longues périodes de digestion enzymatique, prudente superposition de solutions de densité différente, immunopanning lui-même, et plusieurs centrifugation pas - tout avant l’ensemencement). Cependant, en utilisant le médium plus spécialisé, la méthode AWESAM offre fois la rapidité de la méthode de MD et de l' in vivo-comme la morphologie du protocole immunopanning.

Dans l’ensemble, le protocole AWESAM est utile pour étudier plus en vivo-comme les astrocytes en monocultures 2D isolées de neurones et autres cellules gliales (comme déjà4 par séquençage de RNA immunostainings et immuno-Blot). Il permet l’étude des processus astrocytaires minces et fournit la grande accessibilité de visualisation spontanée de Ca2 + de signalisation et des événements à proximité de la membrane (p. ex., photographié par microscopie FRBR).

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Protocole

Toutes les expériences animales décrites ici ont été effectuées conformément aux lignes directrices pour le bien-être animal allemand.

NOTE : La chronologie et les étapes principales du protocole sont illustrées à la Figure 1.

1. les préparatifs

  1. Préparer les solutions suivantes.
    1. Préparer le DMEM + pour la culture des astrocytes polygonales de MD : DMEM avec 10 % FCS, pénicilline de U 100 et 100 µg/mL de streptomycine.
    2. Préparer la mise en culture des astrocytes stellaires NB + H : neurobasal moyenne avec 5 ng/mL HBEGF, 1 Supplément de B-27, 1 Supplément de glutamine x, pénicilline de U 100 et 100 µg/mL de streptomycine.
      Remarque : Aliquotes de plus fortes concentrations de HBEGF peuvent être préparés et conservés à-20 ° C à être ajoutés au milieu de chaque fois que nécessaire.
    3. Préparer le milieu de la dissection (HEPES dans HBSS de 10 mM).
    4. Préparer des aliquots de 6-7 mL de 0.05 % trypsine-EDTA et 6 à 7 mL 0.25 % trypsine-EDTA en tubes de 15 mL. Ceux-ci peuvent être conservés à-20 ° C et décongelés dans un bain-marie à 37 ° C.
  2. Le jour avant de commencer le protocole, manteau plats imprégnées de culture de tissu de 10 cm avec 5 mL de 0,04 % polyéthylènimine (PEI).
  3. Le lendemain, retirez le PEI et laver la vaisselle avec de l’eau déionisée, distillée deux fois. Ajouter 12 mL de DMEM + dans chaque assiette et pré équilibrer dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant au moins 30 min avant l’ensemencement de cellules.
  4. Préparer la zone de dissection : sous une hotte à flux laminaire à dissection, placer deux plats de Pétri 10 cm rempli de moyen de la dissection sur la glace. Pour chaque zone du cerveau à être isolé (par exemple, cortex, hippocampe), préparer un 15-tube rempli de 14 mL de milieu de dissection et de garder sur la glace. Pulvériser les outils de dissection (des ciseaux fins, Dumont #3 et #5 pinces) éthanol à 70 % et les placer à côté de microscope de dissection dans le capot.

2. rat ou Dissection de cerveau de souris

Remarque : Les deux souris et rats peuvent être utilisés. Animaux âgés de plus de P8 peut également être utilisé (nous avons testé jusqu'à P12), mais supprimant les méninges deviendra de plus en plus difficile. En outre, le rendement des cellules et la santé vont diminuer, étant donné que les cellules du cerveau des animaux plus âgés ont formera des processus complexes et les liens qui peuvent se briser au cours de la dissociation des tissus, entraînant la mort cellulaire accrue. Corticale préparations sont décrits ici, mais d’autres régions du cerveau peuvent également être utilisées.

  1. Placez 0.05 % trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 ° C.
  2. Euthanasier les animaux (rates gravides pour chiots E19 ou animaux P0-P8) en augmentant progressivement la teneur en CO2 et isoler le cerveau. Les étapes suivantes nécessitent une technique stérile.
  3. Si vous travaillez avec des tissus embryonnaires, retirez d’abord l’embryon de l’utérus et ouvrir les sacs embryonnaires, puis immédiatement couper les têtes avec des ciseaux. Lorsque toutes les têtes sont coupées, les transférer dans un milieu dissection refroidis.
    1. Une fois les têtes sont submergées dans le milieu, ouvrir la peau et le crâne (les deux sont très douces chez les jeunes animaux) avec forceps et pincée hors du cervelet. Levier avec précaution le reste du cerveau et se détache du crâne.
      Remarque : Deux à quatre E19 embryons donnent suffisamment de tissu au moins huit plats de 10 cm des astrocytes corticaux plaqués à 500 000 cellules / plat du jour de la dissection.
  4. Pour les nouveaux-nés ou plus petits, couper les têtes avec des ciseaux et isoler le cerveau par médialement couper la peau en ligne droite à l’arrière de la tête à la pointe du nez. Tirez la peau côté et soigneusement coupée la skull gauche et droite, puis soulevez le crâne d’OS vers le haut. Couper le cervelet, et le reste du cerveau et se détache du crâne du levier.
    Remarque : Deux ou trois P0-P8 chiots donnent suffisamment de tissu au moins huit plats de 10 cm des astrocytes corticaux plaqués à 500 000 cellules / plat du jour de la dissection.
  5. Séparer le cortex de la structure sous-jacente du mésencéphale. Placer la pince dans la fissure longitudinale entre les hémisphères, puis déplacer la pince entre les cortex et le mésencéphale des structures d’un hémisphère (perpendiculaire à la fissure longitudinale) Pincer chaque hémisphère libre.
  6. À l’aide de la pince, retirez tous les méninges de chaque hémisphère (et son hippocampe), puis séparer l’hippocampe. Si les astrocytes hippocampe sont nécessaires, déplacez chaque hippocampe dans un tube de 15 mL rempli de 14 mL de milieu de dissection sur glace.
  7. Enlever plus régions du cortex de chaque hémisphère si des régions spécifiques sont requises (p. ex., cortex frontal). Couper n’importe quel tissu cortical à utiliser pour générer des astrocytes en morceaux ne dépassant pas 1 mm3. Collecter toutes les pièces de tissu cortical dans une éprouvette de 15 mL rempli de la moyen de la dissection sur glace.

3. dissociation et Digestion tissu

  1. Une fois tous les morceaux de tissus sont collectés, attendre qu’elles se déposer au fond du tube, puis aspirer le plus moyen possible.
  2. Ajoutez 2 à 3 mL de 0.05 % trypsine-EDTA à l’aide d’une pipette sérologique et incuber les tubes dans un bain-marie à 37 ° C pendant 20 min.
    NOTE : Libérer tous les trypsine-EDTA de la pipette à mélanger les morceaux de tissu et laisser pour reposer à nouveau rapidement.
  3. Soigneusement aspirer la trypsine-EDTA, laissant des morceaux de tissu en comme peu de liquide que possible, au fond du tube.
  4. Ajouter 5 mL de milieu de dissection refroidis préalablement laver la trypsine-EDTA restant. Pipette à côté de la partie supérieure du tube pour parvenir à mélanger les morceaux de tissu.
  5. Aspirer le moyen de la dissection et laisser les morceaux de tissus en tant que peu de liquide que possible. Répétez cette étape de lavage avec deux fois plus de milieu de refroidissement préalable de dissection.
  6. Après le lavage final, ajouter 1 mL de DMEM + (chauffé à la température ambiante) en utilisant une pointe de pipette 1 000 µL et triturer les tissus en pipettant également, haut et bas sans introduire des bulles.
    Remarque : Il est important d’éviter les bulles, car cela pourrait modifier le pH de la solution, à laquelle les astrocytes sont très sensibles.
  7. Placez une passoire de cellule de 100 µm dans l’ouverture d’un tube de 50 mL et pré mouillage le filtre 4,5 ml d’un refroidissement préalable DMEM +.
  8. Pipeter le 1 mL de suspension dissocié le tissu sur la crépine de la cellule et ajouter un autre 4,5 mL préalablement refroidi DMEM + pour laver les cellules par l’intermédiaire de la crépine de la cellule.

4. cellule électrodéposition pour enrichissement Astrocyte par passage

  1. Compter les cellules, par exemple, par dilution 10 µL de la suspension cellulaire avec 10 µL de bleu de trypan et pipetage le mélange sur un hémocytomètre.
  2. Plaque de 500 000 cellules dans 12 mL DMEM + par plat de 10 cm.
    NOTE : DMEM + est utile pour la croissance astrocytaires, plus encore que pour les neurones ou cellules microgliales. Au cours de l’agitation, les forces physiques agissant sur des lamelles de verre dans les puits sont beaucoup plus forts que ceux qui agissent sur les plats de 10 cm (sans couvre-objet). Si les cellules sont ébranlés sur plaques 24 puits, ils deviennent insalubres ou mourir. Seulement la plaque astrocytes sur plaques 24 puits après agitation.
  3. Garder les cultures de cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant sept jours.
  4. Jour 6, la veille de la secousse et passage de cellules, préparer les plaques de culture de PEI-enduit tel que décrit à l’étape 5.

5. passage de cellules

  1. Le jour avant le passage, enduire les plaques de culture cellulaire avec PEI de 0,04 %.
    1. Immunocytochimie, transduction virale ou transfection plasmidique, utiliser des plaques 24 puits ou 6 puits (contenant chacune un stérilisé 12 mm ou 25 mm verre couvre-objet, respectivement).
    2. Stériliser les lamelles de verre par une incubation dans l’éthanol à 70 % pendant au moins 1 h, puis laver trois fois dans l’eau déionisée, distillée avant de placer les lamelles dans les puits.
    3. Ajouter au moins 70 µL PEI de 0,04 % par lamelle de 12 mm en plaques 24 puits et 600 µL 0,04 % PEI par lamelle 25 mm en plaques 6 puits.
    4. Pour Western blot ou l’analyse de la RNA-Seq, les plats de 10 cm contenant déjà les cellules après la dissection peuvent continuer à être utilisé. Plats a seulement besoin d’être secoué, puis les cellules sont lavées avec du PBS 1 x et traités avec NB + H (ne cèdent pas aux nouveaux plats).
  2. Le jour in vitro (DIV) 7 après la dissection, placez les plats de 10 cm avec des cellules en DMEM + sur un agitateur de laboratoire dans l’incubateur et secouer les plats à 110 tr/min pendant 6 h.
  3. Laver le PEI de lamelles enduit avec de l’eau déionisée, distillée deux fois. Ajouter milieu NB + H aux plaques (500 µL / puits pour plaques 24 puits et 2 mL par puits pour plaques 6 puits). Avant Equilibrer les plaques dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % CO2 tandis que les plats de 10 cm sont en secouant, ou pendant au moins 30 min.
  4. 20-30 min avant la fin de la secousse de 6 h, réchauffez 1 x PBS, DMEM +, NB + H et 0,25 % trypsine-EDTA à 37 ° C dans un bain-marie.
  5. Après 6 h de secouer, décoller les récipients de culture de l’agitateur et immédiatement remplacer le média (qui contient la microglie, oligodendrocytes et secoué d’envoi neurones) 10 ml préchauffée 1 x PBS par plat.
    Remarque : Il est important d’aspirer immédiatement le vieux milieu contenant des cellules individuelles afin d’éviter les cellules non-astrocytaires rattacher.
  6. Retirer le PBS et ajouter 3 mL préchauffé trypsine-EDTA par plat. Incuber à chaque plat pendant 4 min dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
    Remarque : Si la préparation des échantillons pour la tache occidentale ou RNA-Seq, n’ajoutez pas la trypsine-EDTA. Au contraire, remplacer les PBS avec 12 mL préchauffée NB + H, après quoi les cultures peuvent être placés dans l’incubateur.
  7. Ajouter 5 mL DMEM + pré chauffé à la trypsine-EDTA 3 mL dans chaque plat, Pipetter les cellules hors le plat à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL et recueillir la suspension de cellules dans un tube de 50 mL.
    NOTE : Pipette directement depuis le fond du plat - la parole du plat devrait devenir plus claire, car les cellules se détachement. Utilisez uniquement le milieu contenant du sérum (au lieu de DMEM +), comme sérum inactive la trypsine.
  8. Centrifuger la suspension cellulaire à 3 220 x g à 20 ° C pendant 4 min.
  9. Retirez le surnageant et remettre le culot dans 1 mL préchauffée NB + H.

6. cellule placage Final Astrocyte cultures

  1. Compter les cellules non vides.
  2. Plaque de 20 000 cellules par puits dans les plaques 6 puits (en moyenne NB + H de 2 mL par puits) ou 5 000 cellules par puits dans les plaques 24 puits (en milieu NB + H 500 µL / puits).
  3. Conserver les cultures cellulaires dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu'à un traitement ou d’analyse.
  4. Échange de la moitié du milieu une fois par semaine.
    Remarque : Dans un environnement faible en nutriments, astrocytes arrêter la prolifération mais des microglies restants seront prolifèrent (bien que dans notre expérience, aucun microglie est apparu dans les cultures AWESAM). Échange de la moitié du milieu une fois par semaine empêche l’enrichissement de tout potentiellement restantes de la microglie8, et les monocultures demeurent saines pendant au moins trois semaines.

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Résultats

Astrocytes qui sont cultivées dans un milieu NB + et cultivées conjointement avec les neurones apparaissent stellaires après 2 semaines de culture (Figure 2). En plus NB + support, les astrocytes cultivés co sont également exposés à des facteurs inconnus dérivé de neurone qui contribuent probablement à leur survie et leur morphologie. En revanche, les astrocytes MD cultivés en DMEM + comme monocultures (après secouer d’autres types de cellules avant passage) ...

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Discussion

Quatre étapes dans le protocole sont critiques : 1) préparer la concentration HBEGF à exactement 5 ng/mL, car de petites augmentations de la concentration peuvent conduire à des cultures immatures, par exemple, 10 ng/mL HBEGF différenciera des astrocytes4; 2) en évitant de bulles dans les solutions qui contiennent des tissus ou des cellules, qui peuvent changer le pH et diminuer la santé de l’astrocyte ; 3) équilibration des médias pour atteindre le pH optimal et la température pour la cu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous reconnaissons le financement de l’European Research Council (FP7/260916), l’Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 et SFB889).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,05 % trypsine-EDTAGibco25300054chaud en 37 º ; C bain-marie avant utilisation
0,25 % trypsine-EDTAGibco25200-056chaud en 37 º ; C bain-marie avant utilisation
B-27 supplémentGibco17504-04450X stock
GlutamaxGibco35050-061100X stock
Pénicilline / streptomycineGibco15070-06350 stock ; pénicilline : 5000 U/ml ; streptomycine : 5000 µ ; g/ml
Milieu neurobasalGibco21103049sans L-glutamine
DMEMGibco41966029
HBEGFSigma4643
HEPESGibco15630080
HBSSGibco14170112
FCSGibco10437028
PBSGibco100100491X
100 &mu ; m crépine à cellules en nylonBD352360
Trypan BlueSigmaT8154  ;
Incubateur de culture cellulaireThermo Fisher ScientificHera Cell 240i Incubateur
Agitateur de laboratoireHeidolphRotamax 120  ;Utilisation à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire
CentrifugeuseEppendorf5810 R  ;
de culture cellulaire

Références

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Réimpressions et autorisations

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