Stéréologique Estimation du nombre de neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra de souris à l’aide de l’optique fractionnateur et l’équipement de microscopie Standard

Résumé

Cet ouvrage présente un protocole étape par étape pour l’estimation non biaisée stéréologique des numéros des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra de souris à l’aide d’équipement de microscopie standard (c'est-à-dire, un microscope optique, une table objet motorisé (x, y, z avion) et le logiciel du domaine public pour l’analyse d’image numérique.

Résumé

Dans la recherche de la maladie de Parkinson précliniques, analyse des voies sont, y compris la quantification de la perte de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra, est essentielle. Pour estimer le nombre de neurones dopaminergiques total, stéréologie impartiale à l’aide de la méthode de fractionnement optique est actuellement considéré comme l’étalon-or. Parce que la théorie sous-jacente à la méthode de fractionnement optique est complexe et stéréologie étant difficile à atteindre sans équipement spécialisé, plusieurs systèmes de stéréologie complet disponible dans le commerce qui incluent les logiciels nécessaires existent, purement pour cellule de comptage des raisons. Puisque l’achat d’une configuration de stéréologie spécialisé n’est pas toujours réalisable, pour de nombreuses raisons, le présent rapport décrit une méthode pour l’estimation stéréologique des cellules neuronales dopaminergiques compte à l’aide de matériel de microscopie standard, y compris un microscope optique, une motorisé table objet (x, y, plan z) avec logiciel d’imagerie et d’un ordinateur pour analyse. Une explication détaillée est donnée sur la façon d’exécuter stéréologique quantification à l’aide de la méthode de fractionnement optique et fichiers préprogrammés pour le calcul des numérations estimées sont fournis. Pour évaluer la précision de cette méthode, une comparaison avec les données obtenues à partir d’un appareil de stéréologie disponibles dans le commerce a été réalisée. Nombre de cellules comparables ont été trouvé à l’aide de ce protocole et le dispositif de stéréologie, démontrant ainsi la précision du présent protocole pour stéréologie impartiale.

Introduction

La quantification du nombre de cellules neuronales est essentielle dans la recherche de la maladie de Parkinson précliniques pour déterminer le niveau de la neurodégénérescence dans la substantia nigra (SN)^1,2. L’estimation non biaisée stéréologique du nombre de cellules dans une région d’intérêt est considéré comme l’étalon-or^3,4,5.

Avant l’avènement de stéréologie impartiale, le nombre de neurones dans les sections a été évalué en manipulant les profils de cellules comptées pour corriger ....

Protocole

toutes les directives internationales, nationales et/ou institutionnels pour le soin et l’utilisation d’animaux ont été suivies. Le protocole a été approuvé par les autorités locales à la Regierung von Unterfranken, Würzburg, Allemagne.

1. traitement des tissus et l’immunohistochimie

1. souris euthanasier avec CO ₂ ou toute autre méthode approuvée.
2. Perfuse six transcardially de souris mâles âgés de 12 semaines C56Bl/6N avec 10 mL de 0.1 M saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une aiguille 25 G et une pompe à perfusion, puis 70 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans du PBS de 0,1 M.
   Mise....

Résultats

À l’aide de la méthode présentée, le nombre estimé de TH + neurones dopaminergiques dans le droit SN varie entre cellules 7 363 et 7 987 et, dans la gauche SN, entre cellules 7 446 et 7 904. Ainsi, le nombre moyen des neurones dopaminergiques (± SEM) était 7 647 ± 83 cellules pour le droit de SN et 7 675 ± 66 pour la gauche SN. L’EC calculée pour chaque animal était inférieure à 0,08 (gamme : 0,073-0,079) (Figure 7). Pour établir la comparabilité de cette mét.......

Discussion

Stéréologie commence avec le traitement de tissus. La série Coupe du tissu SN doit être effectuée avec soin afin d’éviter la perte des articles au cours de l’analyse stéréologique. En outre, une étape essentielle consiste à marquer un hémisphère afin de distinguer la droite de la gauche SN lors de l’exécution de stéréologie. Placer un petit trou à la partie supérieure du tronc cérébral généré les meilleurs résultats dans l’étude présentée. En outre, depuis le travail avec les exigences de méthode de fractionnement optiqu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Paxinos mouse atlas			The Mouse Brain George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
matrix slicer mouse	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
paraformaldehyde	Merck	1040051000
saccharose /D(+) Saccharose	Roth	4621.1
isopentane	Roth	3927.1
glycérol	Merck	1040931000
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-1L
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
phosphate salin ingrédients : Chlorure
sodique	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
dihydrogénophosphate de potassium	Merck	1048731000
hydrogénophosphate disodique dihydraté	Merck	1065801000
	Dako	X0907
albumine sérique bovine	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	détergent
3,3-diaminobenzidine-tétrahydrochloride/DAB comprimés 10mg pH 7,0	Kem En Tec	4170
H2O2/ Peroxyde d’hydrogène 30 %	Merck	1072090250
avidine/biotine réactif	Thermo Scientific	32050	Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100
lapin anti souris tyrosine hydroxylase	anticorps abcam	Ab112	1:1000
biotinylé chèvre-anti-lapin IgG H+L	vectoriel laboratories	BA-1000	1:100
StereoInvestigator version 11.07	MBF
BX53 microscope	Olympus
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Logiciel Zeiss
ImageJ	NIH	Version 4.7
Tissue-TEK	OCT Sakura	4583
grille de glace
	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
plugin de compteur	de cellules Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).  ;
disection optique macro	Christopher Ward
C57Bl/6N souris mâles	Charles River, Allemagne
SuperFrost Plus lames d’objets revêtus	Langenbrinck, Allemagne
Aiguille 25G Microlance 3	BD	300400
REGLO Pompe à perfusion analogique	Ismatec	ISM 829
Système StereoInvestigator			StereoInvestigator version 11.07
		BX53	Microscope BX53
		auto-assortie	Visiview
Axiophot2			Axiophot2

brain Chlorure de potassium Sérum de chèvre normal Merck 1049360500 Plugin de superposition de carboniqueMicroscope stéréologie