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Article de méthode

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

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DOI :

10.3791/56110

⸱

6 juillet 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici des gouttelettes adressable microarrays (SMA), une méthode de tableau basé de gouttelettes en mesure de déterminer l’abondance absolue de protéine dans des cellules individuelles. Nous démontrent la capacité des SMA pour caractériser l’hétérogénéité dans l’expression de la tumeur suppresseur protéine p53 dans une lignée de cellules cancéreuses humaines.

Résumé

Comportement souvent cellulaire et les réponses cellulaires sont analysés au niveau des populations où les réponses de nombreuses cellules sont regroupées ensemble comme un résultat moyen masquant le comportement unicellulaire riche au sein d’une population complexe. Technologies de détection et de quantification protéines unicellulaires ont eu un impact remarquable ces dernières années. Nous décrivons ici une plateforme d’analyse unicellulaire pratique et flexible basée sur gouttelette adressable microarrays. Cette étude décrit comment le nombre de copies absolue de protéines cibles peut-être être mesuré avec une résolution de cellule unique. Le suppresseur de tumeur p53 est le gène le plus fréquemment muté dans le cancer humain, avec plus de 50 % des cas de cancer total expose un modèle d’expression de p53 non saines. Le protocole décrit les étapes pour créer 10 gouttes de nL au sein de laquelle les cellules cancéreuses humaines unique sont isolés et le nombre de copies de la protéine p53 est mesuré avec une résolution de la molécule unique afin de déterminer avec précision la variabilité dans l’expression. La méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule dont la matière première pour déterminer le nombre de copies absolue de toutes les protéines cibles d’intérêt.

Introduction

L’objectif de cette méthode consiste à déterminer la variation dans l’abondance d’une protéine cible dans une population de cellules avec une résolution de cellule unique. Cellule analyse fournit un certain nombre d’avantages qui ne sont pas disponibles avec les méthodes biochimiques ensemble traditionnel. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 tout d’abord, travaillant au niveau de la cellule unique peut capturer l’hétérogénéité riche d’une population cellulaire qui serait autrement perdue par la moyenne qui se produit avec des techniques biochimiques ensemble traditionnel. La majorité des méthodes biochimiques de cheval de travail travaillent avec la plus grande partie, exigeant, comme ils le font souvent, des millions de cellules pour produire un résultat. Bien sûr, les conséquences de l’évaluation des populations de cellules entières repose sur un certain nombre de facteurs, par exemple, l’hétérogénéité dans l’expression de la protéine où certaines caractéristiques importantes de la distribution de l’abondance de la protéine peuvent être manquées. D’un point de vue pratique, la sensibilité requise des techniques de la cellule unique rendent capable de fonctionner avec des quantités de matériel biologique qui est insuffisant pour même les plus sensibles techniques en vrac fonctionner. Un exemple de ceci est l’étude des types de cellules rares tels que les cellules tumorales (CTC) où même pour les patients avec une perspective de pronostique pauvre moins que 10 PTC peut être présent dans un unique 7,5 mL sang tracer en circulation. 6 nous présentons ici la méthodologie requise pour effectuer des mesures de protéine monocellulaire en utilisant un test anticorps utilisant des gouttelettes d’huile diablotin imprimé sur un microréseau d’anticorps à volume réduit.

Plateformes de gouttelettes microfluidiques sont haut débit, capable de générer des milliers de gouttelettes par seconde et capable d’isoler et même de la culture, les cellules individuelles en gouttelettes individuels pour effectuer un large éventail de tests biochimiques. Techniques axées sur les gouttelettes sont bien adaptés pour l’analyse de la cellule unique,7,8,9 , avec des exemples récents notables dont DropSeq10 et inDrop11, qui ont été grandement aidés par la puissance de techniques d’amplification. La quantité limitée de matériel et aucune méthode d’amplification pour les protéines font unicellulaire protéomique particulièrement difficile.

Gouttelettes peuvent être analysés par un certain nombre de méthodes et la microscopie de fluorescence a été largement utilisée. Techniques de molécules simples telles que la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion totale interne permet aux molécules fluorescentes à visualiser avec incomparable rapport signal-bruit. 12 en raison de la décroissance exponentielle du champ évanescent, seulement des fluorophores dans la grande proximité de la surface (l’ordre de 100 nm) sont excités faisant FRBR une bonne stratégie dans la détection de petites quantités d’une molécule cible dans un mélange complexe. La force de sectionnement optique inhérente de la FRBR contribue également à éviter les lavages et limites de dosage temps et la complexité. Toutefois, la FRBR nécessite des surfaces planes et exemples du microscope TIRF appliqué à gouttelettes en suspension dans le flux impliquent la formation d’une surface plane qui à l’image. 13 à cette fin, des techniques protéomiques unicellulaire conçoivent souvent puces microfluidiques autour des agents de surface immobilisée capture dans un format de microarray. 4 , 14

Les gouttelettes, eux-mêmes, peuvent se former dans des tableaux sur des surfaces planes, soi-disant gouttelette microarrays. 15 , 16 , 17 organisation dans l’espace des gouttelettes dans les tableaux permet qu’ils soient idéalement indexées, facilement surveillés au fil du temps, individuellement adressée et, le cas échéant, récupérée. Microarrays de gouttelettes peuvent atteindre une forte densité de micro-réacteurs avec des milliers d’éléments par puce qui sont soit encastrées ou pris en charge par une structure de microtitration. 18 , 19 , 20 ils peuvent être formés par le dépôt séquentiel par manipulation de liquides robots, jet d’encre spotters, contacter microarrayeurs21,22,23,24,25, 26 , ou ils peuvent s’auto-assembler sur des surfaces comme superhydrophillic taches modelée sur une surface SUPERHYDROPHOBE. 27 , 28 , 29

Avec ces considérations à l’esprit, adressable Droplet Microarrays (SMA) ont été conçus pour combiner la polyvalence, les adressabilité spatiale et les volumes réduits de gouttelettes microarrays avec la sensibilité du microscope TIRF seule molécule à quantitativement mesurer l’abondance de la protéine. 5 SMA activer l’analyse du unicellulaire formant un microarray de gouttelettes contenant des cellules individuelles sur un microréseau d’anticorps, qui est ensuite coiffée avec de l’huile pour éviter l’évaporation. Les volumes des gouttelettes sont discrètes pour éviter toute perte d’échantillon, qui serait autrement réalisée par sur puce robinetterie en flux continu microfluidique. 30 la quantité absolue de la protéine-cible d’une seule cellule est extrêmement faible ; Toutefois, la diminution du volume des gouttelettes permet de relativement haute concentration locale afin qu’ils soient détectés à l’aide d’un test d’anticorps "sandwich" - anticorps est immobilisé dans une région distincte, ou spot, sur une surface qui capte des protéines qui à son tour se lie à un anticorps de détection fluorescent marqué présent dans le volume de la goutte. Comme une approche sans étiquette (c'est-à-dire des protéines cibles n’ont pas besoin d’être étiquetés directement), SMA est généralement applicables à l’analyse de cellules provenant de sources primaires, tels que le sang transformé, bien besoin de ponction et biopsies tumorales dissociés, ainsi que les cellules de la culture et les lysats.

Mesurant la variation dans l’abondance de la protéine sur une population de cellules est important dans la détermination de l’hétérogénéité en réponse, par exemple, à un médicament et aidera en donnant un aperçu en fonctions cellulaires et voies, évaluation de sous-populations et leur comportement, ainsi que d’identifier des événements rares qui seraient autrement être masquées par des méthodes en vrac. Ce protocole décrit comment produire et utiliser des microarrays gouttelette adressable pour déterminer quantitativement l’abondance de la p53 de facteur de transcription dans des cellules cancéreuses humaines et peut être utilisé pour étudier le rôle de p53 dans la réponse aux médicaments chimiothérapeutiques. La protéine cible est déterminée par le choix de la capture et la détection des anticorps et peut-être être modifiée pour inclure des cibles différentes ou plus. Les instructions sont fournies pour construire un appareil simple incorporant une buse concentrique consommables de laboratoire général d’array manuellement 10 gouttes de nL recouverts d’huile. Le processus complet expérimental est décrit par lequel chaque gouttelette est ensuite chargé avec une seule cellule, qui est ensuite lysée et l’expression de protéine déterminée avec résolution seule molécule TIRF microscopie.

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Protocole

1. préparation

  1. Faire des copeaux et puces à anticorps impression
    1. Fixer un isolant adhésif silicone/acrylique sur un lamelle couvre-objet fonctionnalisé pour prendre en charge un microréseau d’anticorps. Ceci est dénommé la puce.
      NOTE : Différentes chimies de surface ont été testés pour leur adéquation avec les gouttelettes adressables. 5 surfaces chimies doive être optimisé pour les agents de capture alternative. Isolateurs de SMA sont disponibles dans le commerce ou peuvent être produites par acrylique découpe laser (CAD fichier pour isolateur utilisée dans ce travail est fourni en téléchargement ; Voir le Fichier de Code supplémentaires).
    2. Allumer la microarrayer et la valeur de l’humidité à 75 %.
      NOTE : hygrométrie réduit l’évaporation de la solution d’impression de la goupille de microarray et réduit la variation intra - et inter - sondage.
    3. Nettoyer l’axe « microarray » dans la solution pendant 5 min de nettoyage par ultrasons de pin. Rincez la broche avec de l’eau ultra pure à l’aide d’une pissette et sécher à l’aide d’azote.
      NOTE : Suspendre la broche quant à seulement plonger l’extrémité de la broche. Une lame de microscope avec un ensemble convenablement percé de trous aidera si un support de broche ne peut être obtenu.
    4. Faire 5 mL de tampon impression comprenant 3 × tampon de solution saline-sodium citrate (SSC), bétaïne de 1,5 M additionné de 0,01 % dodécylsulfate de sodium (SDS). Conserver à 4 ° C indéfiniment.
    5. Pour préparer une solution d’impression, décongeler les anticorps anti-p53 (p53/Mdm2 ELISA kit ; Voir la Table des matières) aliquotes à-80 ° C. Mélanger 1:1 avec impression tampon à une concentration finale de 0,5 mg/mL. Charge de 5 à 10 µL de solution d’impression dans une plaque de 384 puits à l’aide d’une micropipette et placer dans le microarrayer.
    6. Charger des morceaux assemblés à l’étape 1.1.1 dans le microarrayer. Le programme de la microarrayer pour imprimer des taches au point de coordonnées définies par le centre de chaque puits de l’isolateur.
      Remarque : Microarrayeurs emploient un éventail de, principalement, un logiciel propriétaire et si le lecteur est invité à consulter la documentation pertinente. La biopuce requise pour l’isolateur de SMA en vedette dans le fichier CAD à l’étape 1.1.1 est composé d’éléments rectangulaires ; les distances pertinentes sont fournies.
    7. Stocker les jetons dans des récipients hermétiques et l’envelopper avec du papier. Stocker à 4 ° C jusqu'à 6 semaines.
      Remarque : La feuille est d’empêcher tout dommage-photo. Stockage à 4 ° C limite le taux de dégradation des biomolécules et des réactions nocives qui peuvent agir pour réduire l’activité de microarray. Une boîte hermétique permet de puces s’équilibrer à température ambiante avant de l’utiliser sans condensation sur la surface de la puce. Contacter « microarray » tension superficielle des exploits d’impression et l’adhérence entre la solution impression et impression substrat afin de produire des spots. Pre-printing ou éponger est normalement nécessaire pour retirer l’excédent de solution de la goupille de microarray de céder les taches uniformément tailles. Ne jetez pas la lamelle pré impression sacrificielle puisqu’il peut être utilisé pour évaluer la qualité du lot.
  2. Préparer les seringues, tube et concentrique de buse pour distribuer des gouttelettes adressables
    1. Démonter les 100 µL (pour la goutte de solution aqueuse) et 1 mL (pour l’huile de coupe) Hamilton seringues en verre et rincer les pièces avec distillée H2O.
    2. Alimentation d’une longueur de 100 mm de 150 µm ID/360 µm OD fusionnés avec tube de silice dans une longueur de 40 mm de 1,0 mm ID/1/16 » tube d’OD PFA jusqu'à ce qu’il dépasse de 2 mm. Cela formera la buse concentrique.
    3. Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate à l’extrémité d’une pointe de pipette de 10 µL et insérez la pièce 40 mm 1,0 mm ID/1/16 » tube d’OD PFA. Si nécessaire, repositionner le tube de silice fondue pour maintenir une saillie de 2 mm au niveau du bec avant le coucher adhésif.
    4. Insérez l’autre extrémité de la silice fondue capillaire dans la fin d’une longueur de 200 mm de 0,014" ID/0,062" OD tubing PTFE et raccordez-le à un 100 µL Hamilton seringue remplie de 4 % albumine de sérum bovin (BSA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (LNPP).
      NOTE : Protéines et autres espèces biochimiques pouvant lier non spécifiquement aux surfaces et peut être perdu ou dénaturé. BSA est utilisé pour « bloquer » les surfaces pour minimiser non-spécifiques en sacrifice liant à ces surfaces.
    5. Insérez une longueur de 400 mm de tubes de 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP dans un cône de pipette de 200 µL jusqu'à ce qu’il forme un sceau. Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate à une autre pointe de pipette 200 µL et pousser cela dans la première astuce pour fixer le tuyau en place. Connectez l’extrémité ouverte du tuyau FEP OD 1,0 mm ID/2.0 mm à 1 mL d’une seringue de Hamilton rempli d’huile minérale.
    6. Insérer la pointe de pipette 10 µL de la buse concentrique à l’Assemblée de pointe 200 µL pipette. Placez les seringues dans les pompes à seringue séparée car ils devront fonctionner indépendamment.
    7. Remplir la seringue de 100 µL de solution de saturation LNPP 4 %. Réinstaller et rincer le tube « aqueux » avec la solution de blocage. Répéter deux fois pour un total de 3 bouffées de chaleur.
    8. Remplir la seringue de 100 µL de 0,125 µg mL-1 détection de d’anticorps (anticorps anti-p53 (DO-1) étiqueté avec Alexa 488) dans 4 % LNPP et re-joindre des tubes. Remplacer la solution blocage en tuyau de distribution 25 µL de solution de détection anticorps.
    9. Rincer le tube « pétrole » avec de l’huile minérale, jusqu'à ce que tous les tuyaux et la buse se remplit avec de l’huile. Remplir la seringue de 1 mL d’huile minérale et ré-attacher le tube. Fixez l’ensemble tuyau et la buse d’un manipulateur XYZ.
  3. Préparer microinjector et micromanipulateur
    Remarque : Les étapes ci-dessous font spécifiquement référence aux composants des microinjector et des appareils de micromanipulateur spécifié dans la Table des matières, mais sont généralement applicables à tous les appareils.
    1. Assembler le microinjector en attachant la pression de la tubulure et le titulaire de la capillaire.
    2. Tournez lentement le cadran de piston jusqu'à ce que l’huile minérale remplit complètement la ligne.
    3. Fixer le support capillaire dans la traduction tête de montage.
    4. Fixer le tube capillaire dans le capillaire porte avec la poignée de la tête.
    5. Déposer une solution de 4 % LNPP dans un puits de l’isolateur.
    6. Traduire en utilisant le micromanipulateur et plongez l’extrémité du capillaire dans la solution.
    7. Remplissez lentement le tube capillaire avec 4 % LNPP et laisser bloquer pendant 10 min.
    8. Éjecter le microcapillaire et faites pivoter le module de traduction afin que l’Assemblée est claire de la puce.

2. former des gouttelettes adressables et charge avec cellules individuelles

  1. Former des gouttelettes adressables
    1. Fixer la puce sur la platine du microscope.
      Remarque : Le microscope est une fluorescence inversée microscope automatisé capable de seule molécule FRBR équipé d’un un stade XY codé et un électron multipliant caméra dispositif à couplage de charge (EM-CCD).
    2. Enregistrer les coordonnées de scène de microscope de chaque tache dans le tableau en utilisant le logiciel de contrôle automatisé de microscope.
    3. Définissez le manipulateur XYZ sur la platine du microscope. Placez l’embout sous l’angle de 50-60°. Veiller à ce que le bec a une longueur suffisante et autorisation à atteindre la puce. Set « aqueuse » et « huile » seringue pompes pour distribuer 10 nL de 100 µL/min à 5 µL à 100 µL/min, respectivement.
      Remarque : Lors de la préparation, la solution aqueuse à la tête de la buse peut sécher.
    4. Distribuer la solution aqueuse jusqu'à ce qu’une perle de liquide est visible à la tête de la buse. Tamponnez avec un chiffon de poussière gratuit pour l’enlever.
      Remarque : Selon le nombre d’assignations sous enquête, réserve un certain nombre de puits pour servir de réservoirs pour les cellules. Pour un type de cellule unique/ligne un réservoir unique suffira.
    5. En utilisant le logiciel de contrôle automatisé de microscope, définir les coordonnées de scène de microscope à un endroit d’anticorps dans le tableau et se concentrer sur la surface de la lamelle couvre-objet.
    6. Attention à ne pas perturber la place, en utilisant le manipulateur XYZ, alignez la pointe capillaire de verre de la buse concentrique du côté de la place de l’anticorps et verser 10 ml d’une solution aqueuse. Sans bouger les étapes, déposer 5 µL d’huile pour plafonner la solution aqueuse. Soulevez la buse de la goutte lentement et se déplacer à l’autre bien.
    7. Répétez l’étape 2.1.6 pour toutes les taches d’anticorps dans le tableau.
    8. Après 30 min, l’image toutes les taches dans le tableau en utilisant le logiciel de contrôle automatisé de microscope pour déterminer l’arrière-plan de molécules uniques liés à chaque anticorps spot avant le chargement de cellules.
  2. Charger des gouttelettes adressables avec cellules
    1. Sortir les flacons de culture cellulaire de l’incubateur et détacher les cellules à l’aide de la solution de trypsine/EDTA.
      Remarque : Dans cette étude, la lignée humaine de cellule carcinome BE de colon a été utilisée et cultivées à l’aide modifié Eagles (DMEM de Dulbecco) additionné de 10 % (v/v) sérum bovin fœtal (SVF) dans un incubateur à CO2 .
    2. Si nécessaire, fluorescent tacher les cellules.
      1. Remettre en suspension les cellules dans une solution d’anticorps de détection 0,125 µg/mL (anticorps anti-p53 (DO-1) étiqueté avec Alexa 488) dans 10 % FBS dans les médias L-15. Pour assurer une suspension monocellulaire, filtrer la solution de la cellule à travers un tamis de cellule 40 µm pitch.
    3. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer ou concentrer la solution de cellules à une concentration de 25-400 × 103 cellules/mL. Cela garantit que sédiments de cellules avec un espacement suffisant pour manipuler confortablement le microcapillaire.
    4. Charger des cellules individuelles dans adressables gouttelettes provenant du réservoir de cellules utilisant le micromanipulateur et microcapillaire.
      Remarque : Les cellules Non adhérentes peuvent être chargées en vrac dans une micropipette et distribué un par un en gouttelettes adressables. Malgré le traitement de surface bloquant, lignées de cellules adhérentes tendra à non spécifiquement collent à la paroi intérieure de verre microcapillaire et être perdu.
    5. À l’aide d’un objectif de 10 × pour observer, utiliser le microinjector pour aspirer une cellule unique dans le microcapillaire provenant du réservoir de la cellule.
    6. Stocker les coordonnées de scène micromanipulateur si vous utilisez une platine manipulateur électronique ou noter manuellement la position z.
    7. Rétracter la micropipette en la traduisant vers le haut pour dégager la hauteur de 1 mm de la puce. Exécutez cette fonction manuellement avec un joystick ou automatiquement à l’aide de la fonctionnalité « Eject » d’un stade de manipulateur électronique.
    8. Ensemble, que la scène se coordonne pour que des gouttelettes d’un diamètre adressable l’à l’aide de microscope contrôle logiciel automatisé. « Injecter » la micropipette en le renvoyant à la position z stockée (ou indiquée). Cela effectuer manuellement avec un joystick ou automatiquement si vous utilisez une platine manipulateur électronique.
      Remarque : Le microcapillaire va percer le plafonnement de l’huile et être situé dans la partie aqueuse de la gouttelette adressable.
    9. Distribuer la cellule dans la goutte adressable à l’aide de la microinjector. Le volume d’une goutte d’adressable nL 10 augmentera de moins de 1 %.
    10. Répétez les 2.2.5-2.2.9 pour les gouttelettes adressables restants, laissant certains gratuits pour le contrôle expérimental où les gouttelettes adressables ne contiennent pas une cellule.
      NOTE : Une alternative plus simple aux cellules individuelles de chargement en gouttelettes adressables en utilisant un microcapillaire et micromanipulateur consiste à remplacer la solution à l’étape 1.2.8 avec une solution d’anticorps de détection à 4 % LNPP contenant des cellules à une concentration sur l’ordre de 10 5 cellules/mL, équivalent à 1 cellule/10 nL. Occupation de la cellule unique sera poissonnienne et la concentration cellulaire devront être optimisées.
  3. Lyse des cellules et la matrice image
    1. Cellules d’image au microscope à fond clair, y compris toute imagerie de fluorescence des gouttelettes.
      Remarque : L’imagerie prend environ 3 min à ~ 100 gouttes à l’aide d’un microscope automatisé d’images. Effectuer l’imagerie avec une NA 60 = 1.49 objectif immersion dans l’huile. Aucuns filtres ne sont nécessaires pour fond clair d’imagerie tandis que jeux de filtres standard est utilisés pour l’imagerie de fluorescence.
    2. Tous les spots dans le tableau en utilisant la seule molécule TIRF microscopie de l’image.
      Remarque : Les paramètres sont utilisés comme à l’étape 2.3.1 avec une FRBR spécialisée filtrer l’ensemble. Ces images seront analysées par la suite à l’article 3 pour déterminer l’arrière-plan de molécules uniques liés à chaque spot anticorps avant la lyse. Imagerie de molécule unique à l’aide de la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion interne totale prend environ 5 min pour ~ 100 points d’image.
    3. Mettre l’accent sur une cellule dans une gouttelette adressable. Atteindre la lyse optique complete en se concentrant un célibataire 6 ns laser pulse (longueur d’onde 1064 nm, pouls énergies 14.1 ± 0,3 µJ par impulsion) à proximité de l’emplacement de la cellule.
      Remarque : L’impulsion laser met en place une bulle de cavitation en expansion qui cisaille la cellule et libère des constituants cellulaires dans le volume de la goutte. 4 , 31 les processus mécaniques en raison de la lyse induite par laser ne pas dérangent l’interface huile / eau à énergies pouls faible. Lyse optique prend généralement environ 20-30 min à lyser les 100 cellules. Tel que discuté dans la section Discussion, il y a un certain nombre de méthodes alternatives à la lyse des cellules individuelles si installation de lyse optique n’est pas possible.
    4. Répétez pour tous les gouttelettes contenant des cellules adressables laissant 5 gratuit pour le contrôle expérimental où adressables gouttelettes contiennent une cellule non lysée.
    5. Notez l’heure à laquelle chaque cellule est lysée.
      Remarque : Ces temps servira à corriger les courbes de liaison individuelle pour chaque tache à l’étape 3.1.9. Souvent, il suffit de noter les moments où les cellules des premières et la dernières sont lysées et estiment le reste en supposant une durée suffisamment cohérente entre la lyse.
    6. Acquisition d’images de molécules simples TIRF microscopie de tous les spots toutes les 10 min pendant les premières 30 min puis toutes les 20 min pour un autre 60 min. Si seulement l’intérêt d’un montant de protéine liée à l’équilibre, l’image toutes les taches après incubation la puce pendant 90 min à température ambiante.
      Remarque : Le temps pour atteindre l’équilibre dépendra du volume de la goutte et les affinités des anticorps utilisés dans le test. La microscopie FRBR est effectuée en utilisant une source d’excitation de laser à = 488 nm et 1,5 puissance mW mesurée à l’ouverture arrière à l’aide d’un wattmètre optique. Images de molécules simples sont acquises en définissant les paramètres d’acquisition sur l’EM-CCD caméra à 900 ms temps d’acquisition, la numérisation au taux de lecture de 1 MHz 16-bit et un EM gain facteur de 10. L’isolant peut être réutilisé en enlevant soigneusement la lamelle.

3. analyse des données

  1. Molécule unique comptant (régime non congestionné/numérique)
    1. À l’aide de Fidji (ou Matlab), pour n’importe quel endroit d’anticorps non encombrées, charger l’image acquise avant la lyse (fond, BKD).
      Remarque : Les opérations dans les étapes suivantes sont exécutées carrément à l’aide de logiciels d’analyse image Fidji. On trouvera à la https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html lien suivant un guide de l’utilisateur.
    2. Aux Fidji, sélectionnez l’image BKD. Dans le menu « Image », sélectionnez « Duplicate » à BKD en double. Sélectionnez l’image dupliquée et sous les « processus > filtres », sélectionnez « Flou gaussien » et spécifier un rayon de 50 pixels.
    3. Aplatir l’image BKD afin qu’il y a une distribution efficace d’intensité uniforme de la source lumineuse de l’excitation en divisant l’image BKD par l’image floue de BKD, produisant des BKD_FLAT.
      1. Au titre de « Processus » sélectionnez « Image calculatrice... », spécifie l’opération de « Fossé », les images nécessaires et en sélectionnant les cases « Create new window » et « résultat 32 bits (float). »
    4. Soustraire chaque pixel de l’image de 1 (« processus > Math », sélectionnez « soustraire » et spécifiez une valeur de 1). L’intensité moyenne de pixels doit être 0.
      NOTE : Champ aplatissement et images d’arrière-plan aplatie peuvent être vérifiés facilement puisque la somme de tous les pixels doit être 0 et tout décalage restant peut être compensée plus carrément.
    5. Sélectionnez une zone de pixels × 50 50 pixels dans l’un des 4 coins de l’image BKD_FLAT. Mesurer l’écart d’intensité pixel (σ) en sélectionnant « Analyser » et « Mesure ».
      NOTE : Les statistiques sommaires de la sélection seront présentées dans une fenêtre de résultats. Cela détermine la place hors contexte où il y a probablement pas une forte densité de molécules simples. La zone à mesurer peut être sélectionnée manuellement à l’aide des outils de sélection de menu par défaut ou en exécutant la macro code » makeRectangle (x, y, largeur, hauteur) » ; Cela crée une sélection rectangulaire, où x et y les arguments sont les coordonnées (en pixels) de l’angle supérieur gauche.
    6. Définissez le seuil de l’image à 3σ et créer une image binaire SM_MASK.
      1. Sous « Image > réglage », sélectionnez « seuil » et définissez le niveau de seuil inférieur à 3σ.
        Remarque : Les Pixels dont la valeur est inférieure au seuil sont mises sur zéro et dépassant le seuil de pixels ont la valeur 1. Le seuil détermine la confiance avec laquelle seuillées pixels appartiennent à une seule molécule.
    7. Dans l’image segmenté SM_MASK, valeurs d’intensité de pixel réglée à zéro de tous les objets qui n’ont pas une taille de 4 à 9 pixels2 et une circularité de 0,5 - 1 en sélectionnant « Analyser » puis « Analyser les particules » et en spécifiant la taille et la circularité.
      Remarque : La taille en pixels devrez peut-être être optimisée pour les autre jeu fluorophores et microscope ups. En raison du type de bruit caméra unique pixels peuvent être au-dessus de ce seuil et ne pas rejetées malgré n’étant ne pas de molécules simples. Le critère de taille de pixel rejettera correctement ces pixels. Molécules simples sont généralement de forme circulaire. Circularité la valeur 1 indique un cercle parfait, alors qu’une valeur approchante 0 indique une forme plus allongée. Les objets restants sont des molécules simples et peuvent être comptés. Un masque peut être défini pour délimiter la zone de la place de discriminer sur place et hors place compte par image. C’est plus facile pour les images acquises à des moments plus tard lorsqu’il y a un signal suffisant sur place qui peut être appliqué ensuite aux trames précédentes.
    8. Pour la même place d’anticorps non encombrées, charger et répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.7 pour toutes les trames d’images saisies comme une série temporelle acquis lyse post. Utiliser les temps de lyse notés à l’étape 2.3.5. pour corriger les courbes de liaison.
  2. Molécule unique comptant (régime congestionné/analogique)
    1. Afin de calculer l’intensité moyenne d’une molécule unique, avant de poursuivre, répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.8.
    2. Multipliez les images BKD_FLAT et SM_MASK pour produire une image selon laquelle les valeurs nulles pixel sont associés aux molécules simples.
      1. Pour effectuer ceci, sous le menu « Process », choisissez « Image calculatrice... », spécifier l’opération de « Multiplier » et les images nécessaires et sélectionnez les cases « Create new window » et « résultat 32 bits (float). »
    3. La somme de toutes les valeurs d’intensité de pixel en sélectionnant « Analyser », puis « Mesure » ; les statistiques sommaires de la sélection seront présentées dans une fenêtre de résultats. Diviser par le nombre de molécules simples comptés comme par l’Etape 3.1.8 pour calculer l’intensité moyenne par molécule.
    4. Pour n’importe quel anticorps congestionnées spot, charger la lyse post image acquise et l’aplatir avec une image d’arrière-plan flou comme par les Etapes 3.1.2 et 3.1.3.
    5. Soustraire de chaque pixel dans l’image pixellisée en 1 ("processus > Math », sélectionnez « soustraire » et spécifiez une valeur de 1)
    6. Sélectionnez une zone de pixels × 50 50 pixels dans l’un des 4 coins de l’image et de mesurer l’écart d’intensité pixel (σ). Voir l’étape 3.1.5 pour plus de détails.
    7. Créer un masque d’image binaire en définissant le seuil de l’image à 3σ et valeurs d’intensités de pixels la valeur zéro de tous les objets d’une taille inférieure à 4 pixels2. Pour effectuer ceci, sous le menu « Analyser », sélectionnez « Analyser les particules » et spécifiez la taille et la circularité.
    8. Multiplier l’image spot aplatie anticorps congestionnées par le masque de l’image binaire.
      1. Pour effectuer ceci, sous le menu « Process », choisissez « Image calculatrice... », spécifier l’opération de « Multiplier » et les images nécessaires et sélectionnez les cases « Create new window » et « résultat 32 bits (float). »
    9. Somme des intensités pixels restants en sélectionnant « Analyze » suivi de « Mesure » ; les statistiques sommaires de la sélection seront présentées dans une fenêtre de résultats.
    10. Diviser la somme des intensités des pixels par l’intensité de la molécule unique moyen pour calculer le nombre de molécules uniques liés à l’endroit encombrés.
  3. Courbe d’étalonnage pour quantification absolue
    1. Répétez les points 1 et 2 pour former 10 nL adressable des gouttelettes avec l’anticorps de détection en solution à 4 % LNPP additionnée d’une protéine recombinante de concentration connue.
    2. Effectuer une série de concentrations de 102- 107 protéines recombinantes par goutte en faisant varier la concentration de la protéine recombinante, ajoutée à la solution. Il est recommandé de travailler en termes de nombre de protéines par goutte pour rendre les données de cellule unique étalonnage simple.
    3. Utiliser la série de concentration compte de données à l’étape 3.3.2 pour calibrer toute seule molécule par la tache à l’abondance de la protéine par goutte, ainsi que par l’abondance de protéine extension par une cellule unique.

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Résultats

Le nombre de copies de protéine basal absolu de p53 a été déterminé avec une résolution de cellule unique dans une lignée de cellules de cancer du côlon humain, cellules BE. Nous démontrons comment expression de p53 peut varier au fil de plusieurs ordres de grandeur et montrent une corrélation faiblement positive entre taille et protéine nombre de copie cellule au sein de la population de cellules BE au repos.

Adressable Microar...

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Discussion

Adressable Droplet Microarrays sont une méthode sensible et extensible pour déterminer quantitativement le nombre de copies absolue de protéine dans une seule cellule.

Limiter le degré de liaison non spécifique (NSB) est critique au sein du protocole à la réalisation plus bas une limite de détection que possible. Protéines et autres espèces biochimiques pouvant lier non spécifique à un certain nombre d’interfaces présentes dans les gouttelettes — la surface de la lamelle couvre-objet, l’antico...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

ASR conçu des expériences, mis au point des protocoles et analysé les données. SC et PS effectué des expériences de taille de cellule. ASR et OC a écrit le manuscrit. Les auteurs tiennent à remercier sincèrement le soutien du professeur David R. Klug pour donner accès au matériel. Les auteurs tiennent à remercier l’Imperial College Advanced Hackspace pour l’accès aux installations de prototypage et de fabrication.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Culture cellulaire
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Life Technologies10010015
DMEM High GlucoseSigmaD6429
Foetal Bovine Serum (FBS)BiochromS0115
flacons de culture cellulaireCorningSIAL0639
Trypsine/EDTABiochromL2153
NomEntreprise>Numéro de catalogueComments
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, Royaume-UniOmniGrid Micro
Micro pinArrayIt, USA946MP2
Coverslips (Nexterion)Schott, Europe1098523Taille (mm) : 65,0 x 25,0 ; Épaisseur (mm) 0,17
anticorps de capture p53EnzoADI-960-070
anticorps de détection p53, Alexa Fluor 488 étiquetéSanta Cruzsc-126concentration de stock 200&mu ; g/mL
Tampon de citrate salin-sodiqueGibco15557-044
BétaïneSigma61962
Dodécylsulfate de sodiumSigmaL3771
384 plaque de puits (faible volume)SigmaCLS4511
Bouteille de gaz azotéBOCQualité industrielle, sans
NomCompanyNuméro de catalogue>Comments
Droplets
MicromanipulateurEppendorfPatchman NP2
Microinjecteur manuelEppendorfCellTram Vario
MicropipetteOrigio, DanemarkMBB-FP-L-0
Pousse-seringuesKD ScientificKDS-210
100 &mu ; Seringue LHamilton81020Étanche aux gaz, PTFE Luer lock
Seringue de 1 mLHamilton81327Étanche aux gaz, PTFE Luer
lock Isolateur en siliconeGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.5Isolateur en silicone 6x4 puits avec adhésif
Découpeuse laserVersaLASEVLS2.30 Laser CO2 3Wpour la découpe laser d’isolateurs personnalisés
Feuilleacrylique de 1 mm d’épaisseurFeuille deprécision Clarex 001pour la découpe laser d’isolateurs personnalisés
Feuille adhésive3Mutilisée pour coller des isolateurs personnalisés sur des lamelles de recouvrement microarrayed
colleLoctiteLOCPFG3T
150 &mu ; m ID/360 &mu ; Tube en silice fondue m ODIDEXFS-115
1,0 mm ID/1/16" Tube OD PFAIDEX1503
0.014" Réf./0.062" OD Tube PTFEKinesis008T16-100
1,0 mm ID/2,0 mm OD Tube FEPIDEX1673
Albumen sérique bovin (BSA)Fisher ScientificBP9700100
Huile minéraleSigmaM5904
Eau ultra-pureMillipore, AllemagneMilliQ
Nom Entreprise Numéro de catalogueComments
Microscopy & Microscope optique
TIRF avec platine XY codéeNikon, JaponNikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies, IrlandeIXON DU-897E
Source d’excitation laserVortran, États-UnisStradus 488-50
Source laser à lyse optiqueContinuum, États-UnisMicroscope Surelite SLI-10
cube de filtre pour TIRFChroma, USAz488bp
Cube de filtre pour laser à lyse optique2000, UKLPD01-532R-25
NomEntreprise>Numéro de catalogueComments
>Software
Logiciel d’analyse d’imagesOpen Sourcedes Fidji
MatlabMathworksversion 7.14 ou supérieureLogiciel d’analyse d’images
oxygène Super

Références

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