Cryoconservation des spermatogonies de poisson-zèbre de toute aiguille testicules immergé refroidissement ultra rapide

Résumé

L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. En outre, la répétabilité de la méthode dans cinq souches différentes de poisson-zèbre a été testée.

Résumé

Tendances actuelles de la science et de la biotechnologie menant à la création de milliers de nouvelles lignes dans les organismes modèles, ce qui conduirait à la nécessité de nouvelles méthodes pour le stockage sûr des ressources génétiques au-delà des pratiques courantes de garder les colonies reproductrices. L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure vitrification (NIV) pour cryoconservé testicules tout poisson-zèbre. Cryoconservation des cellules germinales précoce par les testicules tout NIV offre des possibilités pour le stockage du poisson-zèbre des ressources génétiques, autant après la transplantation, ils peuvent mûrir en gamètes mâles et femelles. Testicules ont été excisées, a effectué le tombé sur une aiguille d’acupuncture, équilibrée dans deux milieux cryoprotecteurs (équilibration solution contenant du méthanol de 1,5 M et 1,5 M propylène glycol ; et solution de vitrification contenant 3 M le diméthylsulfoxyde et 3M propylène glycol) et plongés dans l’azote liquide. Des échantillons ont été réchauffés dans une série de trois solutions de réchauffement de la planète qui en découle. Les principaux avantages de cette technique sont : (1) l’absence de spermatozoïdes après digestion des testicules réchauffés, ce qui facilite les manipulations en aval ; (2) ultra rapide refroidissement permettant l’exposition optimale des tissus à l’azote liquide donc maximiser le refroidissement et la réduction de la concentration requise des cryoprotecteurs, réduisant ainsi leur toxicité ; (3) synchrone exposition des testicules plusieurs cryoprotecteurs et azote liquide ; et répétabilité (4) a démontré en obtenant la viabilité de plus de 50 % dans cinq souches différentes de poisson-zèbre.

Introduction

Nouvelles tendances en sciences et en biotechnologie ont conduit à la création de milliers de nouvelles lignées mutantes de souris, drosophile, poisson-zèbre et autres espèces utilisées comme organismes modèles dans la recherche biomédicale et d’autres sciences¹. En outre, comme les nouvelles technologies sont développées et deviennent disponibles, le nombre de lignées mutantes augmente régulièrement². Cela conduit à la nécessité d’un stockage sûr des ressources génétiques au-delà des pratiques courantes de garder les colonies reproductrices. Comme une méthode qui permet le stockage en toute sécurité des ressour....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par la loi hongroise du bien-être Animal.

1. préparation du réactif

1. Solutions courantes
   1. Préparer 1 M tréhalose en ajoutant 0,378 g de dihydrate de tréhalose dans 1 mL de dH₂O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.
   2. Préparer 1 M saccharose en ajoutant 0,342 g de saccharose dans 1 mL de dH₂O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.
   3. Préparer 1 M HEPES en ajoutant 0,238 g de HEPES à 1 mL de dH₂O. Mix bien jusqu'à ce qu’il se dissout complètement.
   4. Préparer, collagénase de 20 mg/mL (290 U/mg....

Résultats

En moyenne, le nombre de cellules germinales de stade précoce isolé d’un testicule unique de poisson-zèbre fraîche variait entre 40 000 et 200 000 cellules selon la taille du poisson. Lorsque digérer les testicules zebrafish frais dans toutes les 5 souches, les cellules germinales début n’étaient pas les seules cellules présentes dans les suspensions cellulaires (Figure 2). À côté du stade précoce des cellules germinales, nombreux spermatozoïdes ont été trouv.......

Discussion

L’objectif principal de cette étude était d’adapter l’aiguille plongé procédure refroidissement ultra rapide mis au point pour les espèces aviaires et mammifères^10,11,12 pour la cryoconservation des testicules de poisson (poisson zèbre comme un modèle de organisme). La plupart des études antérieures au sujet de la cryoconservation des ressources génétiques zebrafish portaient principalement sur la cryoconservation du sperme de p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu Leibovitz (L-15)	Sigma-Aldrich	L1518	Supplémenté en L-glutamine
Sérum de veau fœtal (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Méthanesulfonate de tricaïne (MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Saccharose	Acros Organics	57-50-1
Tréhalose	Acros Organics	99-20-7	Méthanol dihydraté
	Reanal	20740-0-08-65
Propylène glycol	Reanal	08860-1-08-65
Diméthylsulfoxyde	Reanal	00190-1-01-65
Colagénase	Gibco	9001-12-1
Trypsine	Sigma-Aldrich	T8003
DNase I	Panreac AppliChem	A3778
Bleu trypan	Sigma-Aldrich	T6146
Solution saline tamponnée au phospate (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417	Comprimés pour la préparation de 200 ml de solution de PBS