Article de méthode

Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

DOI :

10.3791/56121

⸱

6 octobre 2017

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1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

Dans cet article

Résumé

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Nous rapportons en utilisant une artificiel intronic petit RNA expression stratégie à élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Une procédure détaillée pour la construction, emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV aussi bien en ce qui concerne l’infection larvaire est décrite.

Résumé

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In vivo microinjection est la technique de transfert de gène plus couramment utilisés pour analyser la fonction des gènes chez les moustiques individuels. Toutefois, cette méthode requiert une plus techniquement difficile opération et implique des procédures compliquées, surtout lorsqu’il est utilisé chez les larves en raison de leur petite taille, cuticule relativement mince et fragile et une mortalité élevée, qui limite son application. En revanche, les vecteurs viraux pour la livraison de gène ont été développés afin de surmonter les obstacles extracellulaires et intracellulaires. Ces systèmes présentent les avantages de manipulation facile, efficacité de transduction génétique élevée, maintien à long terme de l’expression génique et la capacité de produire des effets persistants en vivo. Mosquito densoviruses (FDM) sont spécifiques à moustique, petits virus à ADN simple brin qui peuvent efficacement des étrangers d’acides nucléiques dans des cellules de moustique ; Toutefois, le remplacement ou l’insertion de gènes étrangers à créer des virus recombinants en général entraîne une perte des capacités de conditionnement et/ou de la réplication, qui est un obstacle au développement de ces virus comme vecteurs de livraison.

Nous rapportons ici, en utilisant une stratégie artificielle intronic petits ARN expression d’élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Procédures détaillées pour la construction, l’emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV et d’infection larvaire sont décrites.

Cette étude démontre, pour la première fois, la faisabilité de mettre au point un non défectueux recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression système, fournissant un outil puissant pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les moustiques et établir une base pour la demande de paratransgenesis virale pour contrôler les maladies transmises par les moustiques. Nous avons démontré Aedes albopictus 1st larvaire pourrait s’infecter facilement et efficacement en introduisant le virus dans le plan d’eau des larves site de reproduction et que les rAaeDVs développés pourraient servir à surexpriment ou abattre le expression d’un gène cible spécifique chez les larves, fournissant un outil pour l’analyse fonctionnelle des moustiques de gènes.

Introduction

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Maladies transmises par les moustiques comme le paludisme, dengue, fièvre zika et la fièvre jaune, sont des problèmes de santé publique international majeur qui continuent de représenter une fraction significative de la charge mondiale des maladies infectieuses1,2. Les insecticides classiques, qui ont été utilisés en réponse à des vecteurs, sont une composante majeure de la stratégie de contrôle des moustiques intégrée durable pour la prévention des maladies transmises par les moustiques. Toutefois, ces stratégies sont révélés relativement inefficaces ou indésirable en raison des impacts environnementaux négatifs associés ainsi que l’évolution des résistances dans les populations de moustiques3,4. Pour ces raisons, il y a un besoin urgent pour des méthodes alternatives de moustique control et l’utilisation de méthodes transgéniques pour produire des moustiques mâles stériles et la libération de moustiques résistant aux agents pathogènes sont apparus comme prometteuses nouvelles stratégies de contrôle. Pour développer apparente nouveau contrôler méthodes, tels que des approches sécuritaires et efficaces pour in vivo la livraison de gène, l’analyse globale de la fonction du gène moustique est nécessaire.

Microinjection directe du plasmide ADN, double stranded RNA (dsRNA) ou petits ARN interférents (siARN) est la plus couramment utilisé en vivo gène méthode de livraison chez les moustiques. En fait, la production de souches transgéniques de moustiques dépendent encore un processus d’embryon microinjection5,6,7. Toutefois, la microinjection présente plusieurs limites. Tout d’abord, cette technique est techniquement difficile et implique des procédures compliquées. Deuxièmement, l’injection provoque une agression physique à l’embryon, larves, nymphes et adultes, qui affecte directement la viabilité de l’organisme cible. En troisième lieu, il est difficile immobiliser les larves de moustiques pour microinjection parce que la plupart vivent dans un habitat aquatique et possède une caractéristique se tortillant de mouvement. Quatrièmement, la taille de 1m-2ème stade larvaire est 10 - 20 fois plus petit que celui de la 4ème stade larvaire et larves plus âgées et les cuticules du premier sont plus délicats. Ces caractéristiques, il est difficile de manipuler 1st-2ème stade larvaire par rapport à ceux des stades plus âgés. Combinés, ces facteurs contribuent à un taux de réduction de la survie après l’injection de larves (environ 5 %) par rapport aux adultes8. Base virale livraison systèmes ont été développés afin de surmonter les obstacles extracellulaires et intracellulaires associés. Ces systèmes présentent les avantages de manipulation facile, efficacité élevée de transduction, solides et à long terme des niveaux d’expression et la capacité de produire des effets persistants en vivo. Par conséquent, gène vecteurs utilisant des rétrovirus, lentivirus et adénovirus ont été largement utilisé les lignées inmammalian et espèces modèles. Le système d’expression virus de Sindbis avait été précédemment utilisé pour analyser la fonction du gène dans le moustique adulte ; Outre les préoccupations de sécurité biologique, cependant, l’injection est toujours un processus nécessaire pour infection virale9. Même si, à l’administration orale en trempant des larves dans la solution de dsRNA a été signalée auparavant comme un mode de livraison possible, il ne convient pas pour petits RNA fonction analyse10. Ainsi, méthodes de livraison viral efficace encore il faut développer pour les moustiques.

Mosquito densoviruses (FDM) font partie de la sous-famille des Densovirinae des Parvoviridaeet tous sauf un automne au sein du genre Brevidensovirus11. MDV virions sont non enveloppés et se composent d’un génome d’ADN (ADN simple brin) simple brin et une capside icosaédrique (20 nm de diamètre). Le génome viral est d’environ 4 Ko de taille et est répliqué dans les noyaux des cellules de l’hôte. FDM est relativement stables dans l’environnement et présentent une gamme d’hôtes étroite spécificité élevée pour les moustiques. Ces virus sont susceptibles de se propager et persister naturellement dans les populations de moustiques et peuvent envahir la quasi-totalité des organes et des tissus de ces insectes, y compris l’intestin moyen, Malpighi tubules, corps gras, musculature, neurones et glandes salivaires12.

Les génomes MDV intacts peuvent être subcloned dans des vecteurs de plasmide pour produire des clones infectieux axée sur le plasmide ; Lorsque ces clones sont livrés dans des cellules de moustique, le génome viral est extraite du vecteur plasmidique, et des particules virales infectieuses sont produites. MDV ayant un génome d’ADN simple brin petite, clones infectieux sont facilement construits et le génome viral peut être facilement manipulables11,13. Ces caractéristiques rendent MDV un agent précieux pour l’examen de biologie de moustique. Cependant, parce que la quasi-totalité de la séquence du génome viral est essentielle à la prolifération virale, la création de virus recombinants par le remplacement ou l’insertion de gènes étrangers entraîne une perte dans les capacités de conditionnement et/ou de la réplication virales, qui crée une barrière pour le développement de FDM comme vecteurs de livraison de gène. Ici, nous rapportons en utilisant une stratégie artificielle intronic expression de petits ARN pour développer un rAaeDV non défectueux en vivo RNA livraison système qui possède les avantages de la construction plasmidique facile et l’entretien d’un virus fonctionnel qui peut produire expression stable et à long terme dans les cellules de l’hôte sans la nécessité pour le virus de type sauvage. De plus, cette méthode permet la transduction facile des larves.

Les protocoles pour les étapes suivantes sont décrites dans la présente étude : line 1) conception de rAaeDVs codant une cassette d’expression de petits ARN intronic, 2) la production de particules de virus recombinant à emballage de la cellule C6/36, 3) l’analyse quantitative d’acellulaire rAaeDV génome copier numéros et 4) infection des larves Ae. albopictus par incorporation directe du virus dans le plan d’eau de l’habitat larvaire. Dans l’ensemble, ces travaux ont démontré que des petits ARN ou des gènes de cible peuvent être surexprimés ou renversées dans les larves de moustiques en utilisant le système de livraison MDV développé.

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Protocole

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tous les protocoles ont été approuvées par le Comité éthique du Southern University Medical.

1. concevoir un Intron artificiel

Remarque : l’intron artificiel utilisée dans ce travail est de 65 ans bp dans la longueur et la séquence est 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

  1. Placer l' Hpa j’ai restriction du site sur les deux extrémités de l’intron artificiel ainsi que Hpa j’ai digestion peut libérer l’intron de plasmides (voir Figure 1 A).
  2. Placer les deux Xba j’ai restriction sites dans l’intron alors que Xba j’ai digestion peut être utilisée pour insérer des séquences d’ARN-petite expression.
  3. Commander la synthèse chimique des séquences d’ADN pleine longueur de l’intron artificielle d’un fabricant d’ADN. La synthèse ADN créé est du clonage dans un plasmide pUC19 standard.
    Remarque : Les éléments essentiels de l’intron artificiel comprennent plusieurs éléments de nucléotides un consensus, y compris un 5 ' site donneur d’épissage (DS) avec la séquence GUAAGAGU, une séquence conservée branch-point (BPS) avec la séquence UACUAAC, une poly-pyrimidine tract (PPT) avec la séquence UCUUC(U) 10 et un 3 '-site accepteur d’épissage (AS) avec la séquence GAUAUCCUGCAG ( Figure 1 A). Deux Xba I sites de restriction ont été introduits entre le DS et le BPS qui permet d’insérer des séquences d’ARN-petite expression. La possibilité pour l’épissure efficacement cet intron artificiel de cellules de mammifères et de moustiques a été précédemment confirmés 14.

2. Conception d’une artificielle Intronic petits ARN Cassette d’Expression

Remarque : surexpression ou knockdown de miRNA endogène, séquences codant miRNA précurseur ou une éponge de miRNA ont été insérés entre le DS et le BPS. Pour servir à titre d’exemple, un miRNA précurseurs endogènes de Ae. albopictus aal-let-7 a été sélectionné pour construire les vecteurs viraux recombinants pour miRNA surexpression et précipitation. Une éponge anti-let-7 a été conçue selon les méthodes décrites précédemment 15. Pour abattre les gènes cibles chez les larves, nous avons conçu spécifique miRNA artificiel (amiRNA) ou séquences d’ARN (shARN) court en épingle à cheveux à l’aide d’un logiciel en ligne 16 , 17 ; pour servir à titre d’exemple, la sous-unité de la V-ATPase un ARNm (n° d’adhésion. AY864912) a été choisi comme un gène cible dans cette étude. L’amiRNA sera être dénommé amiVTP ci-après. Tous les détails des séquences de pré-miARN, éponge, amiRNA et shARN sont décrits dans la Table 1.

  1. Commander la synthèse chimique des séquences d’ADNc pleine longueur des miARN précurseur, miRNA éponges et shARN avec Xba j’ai des sites de restriction sur les deux extrémités d’un fabricant d’ADN.
  2. Après avoir reçu l’ADN ordonné, spin les tubes contenant les blocs d’ADN à 10 000-14 000 x g pendant 1 min pour s’assurer que tous séché ADN est au fond du tube.
  3. Remettre en suspension l’ADN séché dans une eau exempte de DNase pour obtenir une concentration finale de 10 ng/µL.
  4. Digérer le squelette plasmidique et DNA sequences avec Xba I à 37 ° C pendant 1 h et puis déphosphorylent le 5 ' extrémités de l’épine dorsale du plasmide linéarisé avec phosphatase alcaline intestinale veau (CIAP) selon le fabricant ' protocole s .
  5. CIAP inactiver par chauffage pendant 60 min à 65 ° C.
  6. Exécuter un gel d’agarose de 1,0 % et coupé l’épine dorsale linéarisé. Puis extraire l’ADN de la tranche de gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel suivant le fabricant ' instructions de s.
  7. Ligate le fragment d’ADN dans la backboneby T4 DNA ligase (5 U/µL) à 22 ° C pendant 1 h.
  8. Transformer les produits de la réaction de ligature des cellules de l’étape 2.7 dans compétentes d' Escherichia coli (e. coli) et la plaque sur une gélose lysogénie bouillon (LB), contenant l’ampicilline (à une concentration de 100 µg/mL).
    1. Effectuer la transformation grâce à une chaleur choc méthode 18 et utiliser le approprié e. coli de souche. Par exemple, utilisez la souche e. coli DH5α pour la transformation de choc thermique.
  9. Choisir une seule colonie d’étape 2.8 et incuber dans une culture de 3 mL enrichi moyen contenant ampicilline (à une concentration de 100 µg/mL).
  10. Extrait l’ADN de plasmide de la culture bactérienne à l’aide d’un kit de préparation mini suivant le fabricant ' instructions de s. Envoyer l’échantillon à une compagnie de séquençage ADN.
    NOTE : Pour la surexpression ou knockdown de miRNA endogène, les séquences codant les miRNA précurseur ou une éponge de miARN ont été insérés entre les deux Xba I sites. Toutes les constructions de miRNA expression ou éponge doivent être inférieurs à 400 bp (10 % de la longueur du génome viral), en raison de la limite de l’emballage du virus 19.

3. Générant une rAeaDV construction en clonant un miRNA ou shARN Cassette d’Expression dans un squelette plasmidique

Remarque : pUCA, un clone infectieux consistant en un plasmide de pUCA contenant le génome de AaeDV (3 981 nt) 19, a été aimablement fourni par le professeur Jonathan Carlson et a été précédemment décrit dans le détail, 11. p7NS1-DsRed exprime une protéine non structurale 1 (NS1)-protéine de fusion de protéine fluorescente rouge (DsRed) du promoteur p7 et a été décrit en détail ailleurs 14. Un précurseur de l’homme spécifiques miR-941-1 20 et son éponge, un shARN brouillé (CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG), ont été également subcloned dans AaeDV comme témoin négatif.

  1. Ligaturer le pré-miARN, éponge, shRNA ou une cassette d’expression amiVTP dans l' Hpa, j’ai du site de la région codant pour AaeDV NS1 dans le squelette plasmidique de pUCA tel que décrit à l’étape du protocole 2.4 à 2.7.
  2. Transformer l’ADN Stbl3 compétentes d' e. coli cellules et sélectionnez un clone positif tel que décrit à l’étape 2,8 à 2.10.
  3. Suite, extrait les cellules bactériennes à l’aide d’un kit de préparation maxi suivant le fabricant le plasmide rAaeDV ' instructions de s.
    Remarque : Stbl3 ou Stbl4, e. coli cellules soient utilisés pour rAaeDV la transformation d’ADN afin de minimiser la recombinaison de RIR non désirée. Une préparation Maxie devrait être utilisée pour extraire le plasmide rAaeDV afin d’obtenir une grande quantité d’ADN (> 100 µg). Avant de générer le virus, l’intégrité de la séquence du plasmide rAaeDV doit toujours être analysée par séquençage de l’ADN 21.

4. Transfection des cellules C6/36 avec plasmides de rAaeDV

  1. Culture C6/36 cellules dans Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 milieu contenant 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine dans un incubateur à 28 ° C.
  2. Au jour J0, plaque les cellules en dix flacons de culture de 2 cm 25 18-20 h avant la transfection en fractionnant confluentes à 90-95 % à une dilution de 1:2.
    Remarque : Le jour 1, les cellules devraient atteindre confluence de 90 à 95 %.
  3. Le jour 1, transfecter les cellules avec la série de rAaeDV plasmides 22.
    1. Diluer 10 µg ADN dans 600 µL de milieu RPMI 1640 dans un tube de microcentrifuge et mélanger doucement. Pendant ce temps, préparer les 600 µL de milieu RPMI-1640 et 25 µL de réactif de transfection par transfection.
    2. Incuber pendant 5-10 min à température ambiante (RT). Puis, ajouter 625 µL du mélange réactif de transfection-1640 pour le mélange de l’ADN de plasmide-1640.
    3. Incuber ce mélange pendant 20-30 min à température ambiante. Avant la transfection, laver les cellules deux fois avec 2 mL de milieu RPMI-1640.
    4. Incubation après la RT (étape 4.3.3), ajouter the1640-transfection réactif ADN plasmidique mélange le flacon de culture de 25 cm 2 et incuber pendant 6 heures à 28 ° C.
    5. à environ la transfection après 6 h, supprimer les médias de transfection, laver les cellules deux fois avec 5 mL de milieu RPMI-1640 et ensuite ajouter le milieu RPMI 1640 avec 10 % BF.
      Remarque : rAaeDV montre des taux élevés d’infection (95 %) chez les larves de Ae. albopictus ; Toutefois, selon notre expérience, chez près de 50 % des larves infectées, l’infection a été restreinte aux sites d’infection primaire (p. ex., papille anale et cellules de soies) sans 23 de diffusion. Donc, si on a besoin d’infecter des larves dans de nombreux tissus, un virus recombinant défectif exprimant la protéine fluorescente devrait être co-infecté pour permettre la visualisation des sites d’infection. Par exemple, pour produire défectueux virus recombinant exprimant DsRed, p7NS1-DsRed devrait être conjointement transfectée avec un plasmide d’assistance dans les cellules C6/36 selon la procédure décrite ci-dessus (le ratio de concentration cotransfection devrait être 2:1).

5. Récolte des Virions rAaeDV de Transfected des cellules C6/36

  1. récolter les cellules 5 jours après la transfection. Déloger et suspendre les cellules dans les plats par un compte-gouttes en verre 5 mL, pipette de haut en bas au milieu de culture. Transférer tous les suspensions cellulaires dans des tubes de 15 mL stériles.
  2. Geler à-80 ° C ou dans un bain de glace carbonique/éthanol pendant 30 min et ensuite décongeler à 37 ° C. Vortex pendant 1 min. Répétez la procédure de gel-dégel 3fois.
  3. Centrifuger l’échantillon à 4 800 x g pendant 20 min à 4 °C.Collect le surnageant et jeter le culot. Ensuite, passez le liquide surnageant à travers un filtre de seringue jetable 0,22 µm. Aliquote et magasin le virion purifié final stocks à -80 ° C.
    Remarque : Éviter les cycles de gel-dégel répétés.

6. Quantification des rAaeDV

  1. préparer l’ADN de normes. Linéariser les plasmides rAaeDV avec Hpa et purifier les produits digérés avec un gel extraction kit 24.
  2. Construire la courbe d’étalonnage quantitative absolue et mesurer le titre du virus selon les méthodes décrites précédemment 25.

7. Transduction de moustique

  1. lavage 100 1 st Ae. albopictus stade larvaire trois fois à l’aide de désionisée de l’eau et ensuite, transférer les larves dans un bécher contenant 95 mL d’eau désionisée. Ajouter 5 mL des stocks (concentration finale de 1,00 x 10 10 copies/mL) rAaeDV.
  2. Incuber pendant 24 h à 28 ° C, laver les larves trois fois avec l’eau désionisée et ensuite transférer les larves vers les plaques et se nourrissent régulièrement.
  3. De surveiller le niveau d’expression du gène cible chez les larves avec qPCR ou Western blot (représentant résultats sont illustrés dans les Figures 3 et 4).
    NOTE : La méthode de détection de signal de fluorescence peut être utilisée pour isoler les larves infectées plus précisément. Par exemple, pour détecter les signaux fluorescents de larves infectées par des virus recombinant exprimant DsRed, les larves peuvent être placés sur une lame de concavité et observés sous un microscope à fluorescence inversé toutes les 8 h, jusqu'à 2 jours après l’infection. Une fois que les larves fluorescents sont détectés, ils doivent être séparés dans un test individuel en plastique tasses afin de permettre une observation continue ultérieure. Larves avec plusieurs tissus infectés peuvent être identifiés à l’aide de cette méthode.

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Résultats

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Stratégies pour la construction de rAaeDV
Un vecteur rAaeDV défectueux a été généré pour exprimer le gène DsRed chez les larves de moustiques. Le plasmide résultant contenait une cassette de protéine NS1-DsRed fusion avec la protéine VP supprimée (Figure 1A). rAaeDV plasmides contenant l’expression des constructions pour miRNA, amiRNA, shRNA et miRNA éponge ont été conçus (comme illustré dans la Figure...

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Discussion

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Il est important de surmonter deux des principaux obstacles qui limitent la construction rAaeDV. La première est la production de virus recombinant défectueux. Il a été rapporté que MDV peut être utilisé comme un vecteur d’exprimer convenablement taille des gènes étrangers, tels que scorpion insecte spécifique neurotoxins20 et la protéine GFP ; Cependant, quelle que soit la stratégie de construction, une fois que l’ORF de MDV sont insérés ou remplacé par un gène exogène, virions ne peuvent pas former indépendamment à moi...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs reconnaissent l’appui financier du National Key Research and Development Programme of China (2016YFC1200500 à Chen Xiao-Guang), la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (81672054 et 81371846), le Programme de l’équipe de recherche du naturel Fondation des sciences de Guangdong (2014A030312016) et le Programme scientifique et technologique de Guangzhou (201508020263). Nous remercions sincèrement professeur Jonathan Carlson (Colorado State University) pour aimablement les plasmides pUCA et p7NS1-GFP et pour la lecture critique de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CentrifugeuseThermo Scientific75004260
Système de centrifugationBeckman Coulter363118
GeneJET Gel Extraction KitThermo ScientificK0691
E.Z.N.A. Plasmide Midi KitOmega BiotechD6904
Agar purifiéOXOIDLP0028A
Phosphatase alcaline thermosensible FastAP (1 U/µ ; L)Thermo ScientificEF0651
FastDigest HpaIThermo ScientificFD1034
FastDigest XbaIThermoScientificFD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µ ; L)Thermo ScientificEL0011
TransStbl3 Cellule chimiquement compétenteBeijing Transgen BiotechCD521-01
Ampicilline  ;Pékin Tiangen BiotechRT501
Protéinase KPromegaMC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)Pékin Tiangen BiotechFP205

Références

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Mots-clés

Virus recombinantVecteur viralAnalyse de la fonction g niqueConstruction de plasmideTransfection cellulairePCR quantitativeWestern blot

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