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In Situ MHC-tétramère de coloration et d’analyse Quantitative pour déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les tissus

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DOI :

10.3791/56130

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22 septembre 2017

 ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une méthode qui combine in situ MHC-tétramère de coloration avec l’immunohistochimie pour déterminer la localisation, phénotype et la quantité de lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les tissus. Ce protocole est utilisé pour déterminer les caractéristiques spatiales et phénotypiques des cellules CD8 T antigène-spécifiques par rapport à d’autre type de cellule et de structures dans les tissus.

Résumé

Les lymphocytes T sont essentiels pour beaucoup de processus immunologiques, y compris la détection et élimination des cellules infectées par le virus, empêchant l’auto-immunité, aidant à la production de B-cellule et cellule-plasma des anticorps et détecter et éliminer les cellules cancéreuses. Le développement de MHC-tétramère de coloration des cellules de T antigène-spécifiques analysés par cytométrie en flux a révolutionné notre capacité à étudier et comprendre l’immunobiologie des cellules T. Bien qu’extrêmement utiles pour déterminer la quantité et le phénotype des cellules T spécifiques de l’antigène, cytométrie de flux ne peut pas déterminer la localisation spatiale des lymphocytes T spécifiques de l’antigène à d’autres cellules et structures dans les tissus et les techniques actuelles de désagrégation pour extraire le T cellules nécessaires à la cytométrie ont une efficacité limitée dans les tissus non lymphoïdes. In situ MHC-tétramère coloration (IST) est une technique permettant de visualiser les cellules T spécifiques d’antigènes d’intérêt dans les tissus. En combinaison avec l’immunohistochimie (IHC), IST peut déterminer l’abondance, localisation et phénotype des cellules CD8 et CD4 T antigène-spécifiques des tissus. Nous décrivons ici un protocole pour la tache et énumérer les cellules CD8 T antigène-spécifiques, avec des phénotypes spécifiques situés à l’intérieur des compartiments de tissus spécifiques. Ces procédures sont les mêmes que nous avons utilisé dans notre publication récente par Li et al., intitulé « cellules productrices des Virus de l’immunodéficience simienne de follicules sont partiellement supprimée par CD8 cellules+ In Vivo." Les méthodes décrites sont largement applicables parce qu’ils peuvent servir à localiser, phénotype et quantifier essentiellement n’importe quelle cellule CD8 T antigène-spécifiques pour lesquels les tétramères MHC sont disponibles, dans n’importe quel tissu.

Introduction

Les lymphocytes T sont essentiels pour beaucoup de processus immunologiques, y compris la détection et élimination des cellules infectées par le virus, empêchant l’auto-immunité, aidant à la production de B-cellule et cellule-plasma des anticorps et détecter et éliminer les cellules cancéreuses. Le développement de peptide/MHC classe I tétramère coloration spécifique de l’antigène des cellules T CD81 et le récent développement de MHC classe II tétramère dégorgement des lymphocytes T CD4 des cellules2 par cytométrie en flux a révolutionné notre capacité à étudier et comprendre le immunobiologie des cellules T. Bien qu’extrêmement utiles pour déterminer la quantité et le phénotype des cellules T spécifiques de l’antigène, cytométrie de flux ne permet pas la détection de la localisation spatiale des lymphocytes T spécifiques de l’antigène à d’autres cellules et structures dans les tissus et actuel techniques de ventilation pour extraire les cellules T nécessaires pour la cytométrie en flux ont une efficacité limitée dans les tissus non lymphoïdes3.

Nous et autres avons mis au point des méthodes à l’aide de chargement peptide MHC classe I et classe tétramère II ou multimères réactifs pour colorer les cellules CD8 et CD4 T antigène-spécifiques en tissus4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST ces méthodes permettent la détermination de l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules CD8 et CD4 T antigène-spécifiques des tissus et fournir un moyen de détecter ces cellules par rapport à d’autres structures dans les tissus et cellules. Notre groupe a largement utilisé MHC-j’ai tétramère coloration afin d’étudier le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) - et le virus de l’immunodéficience simienne (vis) - des cellules T CD8 spécifiques dans les tissus lymphoïdes, génitales et rectales à acquérir une compréhension de l’immunopathogenèse du VIH et SIV et de définir les corrélats des stratégies de vaccination réussie14,15,16,17. En outre, nous avons également développé une technique qui combine IST avec hybridation in situ (ISH) pour localiser et quantifier les cellules T CD8 spécifiques du virus et les cellules infectées par le virus dans les tissus et pour déterminer les niveaux d’effecteur-cible en vivo 18 , 19.

Nous décrivons ici un protocole utilisant chargés en peptide MHC-j’ai tétramères pour colorer les cellules CD8 T antigène-spécifiques dans les sections de tissu frais, de contre-colorant tissus par IHC et de quantifier les cellules avec des phénotypes spécifiques dans des compartiments de tissus spécifiques. Ces procédures sont les mêmes comme étaient utilisés dans notre publication récente par Li et al., dans lequel nous avons déterminé l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T spécifiques SIV dans les tissus lymphoïdes au cours de l’infection chronique par le SIV dans macaques20.

Pour cette procédure, tissus frais sont sectionnés et incubés durant une nuit avec chargement peptide MHC-j’ai tétramères conjugués à des molécules de thiocyanate de fluorescéine (FITC). Elles sont ensuite fixées à la paraformaldéhyde. Après avoir résolu le tissu, le signal provenant des tétramères de MHC est amplifié à l’aide d’anticorps de lapin anti-FITC et incubées avec les anticorps d’IgG anti-lapin fluorescent étiquetés, qui encore amplifient le signal des tétramères liés. IHC est utilisé en conjonction avec IST pour caractériser les cellules T spécifiques de l’antigène et les cellules environnantes. Anticorps qui reconnaissent des épitopes sur la surface des cellules ou dans l’espace extracellulaire sont inclus lors de l’incubation primaire avec les tétramères. Anticorps qui reconnaissent des épitopes intracellulaires exigent la perméabilité de la paroi cellulaire avant la coloration. Les coupes de tissus colorés sont imagés à l’aide d’un microscope confocal et analysées à l’aide de logiciels confocale. Cellules marquées sont quantifiés à l’aide de logiciels de microscopie confocale ou ImageJ. Le protocole décrit peut être utilisé pour colorer essentiellement n’importe quelle cellule CD8 T antigène-spécifiques dans n’importe quel tissu pour laquelle MHC-j’ai tétramères sont disponibles.

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Protocole

1. jour 1 : primaire d’Incubation et de coupes de tissus frais

  1. utiliser un scalpel pour découper les tissus frais petit (environ 0,5 cm de largeur de 0,5 cm de hauteur). Séparément chaque tissu à un plongeur de la colle et les intégrer avec 3 à 5 mL de 4 % bas point de fusion d’agarose dans du PBS. Étiqueter le piston avec les informations de tissu à l’aide d’un autocollant. Mettez-le dans un support réfrigéré dans un bac à glaçons pour solidifier.
  2. Allumez le microtome et l’épaisseur des sections à 200 µm. installer une lame de rasoir sur le microtome et insérez le piston monté avec le tissu dans le bain microtome.
  3. Préparer tampon phosphate salin avec de l’héparine (PBS-H) en ajoutant 100 µg/mL ou 18,7 héparine U/mL de PBS pour préserver l’ARN et de permettre des applications potentielles de l’ISH en aval. Remplir la baignoire microtome, couvrant le tissu incorporé, avec 100 à 120 mL de PBS-h réfrigérée, stérile. Ajouter les cubes de glace de PBS-H au bain pour maintenir la température à 0 - 2 ° C. démarrer le microtome et couper le tissu en 200 µm sections.
    Remarque : Il est important de garder les tissus réfrigérés sur la glace pour réduire au minimum l’activité cellulaire au sein des tissus et parce que les tissus frais sont plus facile de la section lorsqu’elle est refroidie. PBS seul peut être utilisé s’il n’y a pas de plans pour aval ISH.
  4. Alternativement, pour des tissus qui ne coupent pas bien avec un microtome (p. ex. intestin et poumon), utiliser un bistouri ou une lame de rasoir pour couper le tissu en fines lanières comme proche que possible à 200 µm.
  5. Label le couvercle des plaques 24 puits vitroplants avec les informations de l’échantillon expérimental et placer les chambres des tissus dans les puits correspondants. Utiliser un pinceau pour transférer les sections à une chambre de tissu situé dans le puits d’une plaque de culture de tissus de 24 puits contenant 1 mL de réfrigérés PBS-H.
    NOTE : Chambres de tissu réutilisable convient avant l’ouverture de la coloration. Chambres de tissus peuvent être faites en utilisant un tube à bouchon-pression 14 mL en polypropylène fond rond et treillis métallique. Utilisez une lame de rasoir tranchante pour couper le fond d’un tube à bouchon-pression 14 mL en polypropylène fond rond. Couper le treillis métallique dans un cercle pour ajuster le trou au fond du tube. Chaleur du cercle de maille de fil à l’aide d’un bec Bunsen que lorsqu’il est chauffé au rouge. Définir le cercle de maille de fil très rapidement et poussez le tube sur le maillage. Vérifiez que le treillis métallique est fixé solidement à la partie inférieure du tube et puis découpez soigneusement le haut du tube à la marque de 3 mL à l’aide d’une lame de rasoir tranchante. Mettre jusqu'à 3 sections de tissu dans chaque chambre de tissu, ou jusqu'à 1 cm 2 de tissu / puits. Garder au moins un puits vide entre les loges avec combinaisons de différents anticorps pour éviter la contamination croisée.
  6. Procéder au primaire tétramère et anticorps coloration immédiatement après le transfert de toutes les sections coupées dans les alvéoles de tissus de finition. Conserver les sections immergées et réfrigéré dans 1 mL de PBS-H en tout temps.
  7. Incuber les coupes de tissus du jour au lendemain avec 0,5 µg/mL conjugué FITC, chargés en peptide MHC-j’ai tétramères dilués dans PBS-H avec 2 % de sérum de chèvre normal (NGS). Inclure les souris ou les autres anticorps de lapin non epítopes extracellulaire d’intérêt dans cette incubation (p. ex., les anticorps anti-CD8 rat dilué à 1/500 en PBS-H avec 2 % NGS). Placer 1 mL d’anticorps dilués dans chaque puits.
    Remarque : Il faut lors de la sélection des anticorps CD8, comme certains peuvent renforcer et certains peuvent inhiber les tétramères MHC liant aux récepteurs de lymphocytes T 4 , 21. L’anticorps de CD8 anti-humain rat décrite ici est instable et se traduit parfois par une coloration un peu faible. Il est utilisé ici pour l’étiquetage triple car c’est le seul non-lapin et non-CD8 anticorps testé cela cellules de T CD8 macaque rhésus tachées.
  8. Utiliser 1 mL de solution / puits pour l’anticorps primaire et tous les incubations et effectuer ceci et tous les incubations subséquentes à 4 ° C, avec les plaques sur une plate-forme bascule.
    Remarque : Les tissus devraient flotter librement dans la chambre de.

2. Jour 2 : Fixation et Incubation secondaire

  1. après l’incubation primaire, laver les sections deux fois avec 1 mL de PBS-H réfrigérée pendant 20 min à chaque lavage. Cela en transférant les chambres de tissus sur une plaque de culture de tissus différents 24 puits contenant 1 mL de PBS-H réfrigéré dans les puits correspondants.
    Remarque : Veillez à ne pas égoutter contenu dans un échantillon expérimental dans un autre lors d’un déplacement entre chambres de tissus. Pour tous les incubations subséquentes et lavages, virement de la même façon la chambre tissu une assiette propre contenant la solution appropriée. N’oubliez pas de surveiller les sections dans les chambres des tissus au cours de la procédure pour s’assurer que les sections ne pas coincées sur les côtés des chambres de tissus. Si elles font, les repousser dans la solution.
  2. Fixer les sections avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % du tampon PBS frais pendant 2 h à température ambiante (trop ne fixent pas). Laver à froid PBS-H deux fois pendant 5 min.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter un équipement de protection individuelle approprié.
    Remarque : Si la recherche d’antigène et perméabilisation sont nécessaires pour détecter des épitopes intracellulaires, antigènes peuvent être récupérées en faisant bouillir les sections dans d’urée 0,01 mol après la fixation de paraformaldéhyde.
  3. Transférer les sections dans les plaques de culture de 24 puits contenant 0,01 mol d’urée et de placer ces plaques dans un four à micro-ondes. Faire bouillir les sections trois fois pour environ 10 s chacun, pour un total de 30 s.
    Remarque : Soyez prudent, en faisant bouillir la solution peut forcer les sections hors des puits. Dans ce cas, utilisez un pinceau à repousser les sections sur les côtés de la chambre de tissu ou du couvercle de la plaque dans le fond de la chambre de tissus appropriés.
  4. Préalable à l’incubation de l’anticorps secondaire, permeabilize et bloquer les coupes de tissus en les incubant en bloquante solution contenant 2 %, 0,3 % de détergent (PBS-H-T) et PBS-H NGS sur un balancier pendant 1 h à 4 ° C. Perform anticorps subséquente des incubations avec NGS PBS-H-T/2%.
  5. Pour l’incubation secondaire, transférer les sections dans les chambres de tissus aux puits contenant de lapin anti-FITC anticorps dilué 1/10 000 en PBS-H-T/2% NGS. Incuber pendant la nuit.
    6. Anticorps anti-CD20 de
  6. Perform contre-coloration à l’aide de la souris dilué 1 : 200 dans PBS-H-T/2% end. Pour cette option, récupérer les épitopes, si nécessaire, imprègnent les cellules et bloquer avant l’incubation, tel que décrit ci-dessus.

3. Jour 3 : Incubation tertiaire

  1. après la seconde incubation, laver les sections trois fois au PBS-H à 4 ° C pendant au moins 20 min.
  2. Réaliser une incubation finale avec le cas échéant fluorescent étiquetée anticorps (par exemple, anti-lapin chèvre conjugués jaune verdâtre, colorant rouge sombre conjugués de chèvre anti-rat et chèvre anti-souris conjugués colorant vert anticorps dilué 1:5, 000, 1:5, 000 et 1:2, 000, respectivement, dans PBS-H-T/2% end). Incuber pendant la nuit.
    Remarque : À ce stade, l’incubation peut être prolongée jusqu'à trois jours si nécessaire. Conserver les sections à l’abri de la lumière en encapsulant les plaques en papier d’aluminium pendant cette incuétape de Ben Ali et par la suite, comme lumière étanche fluorophores.

4. Jour 4 : Montage des Sections

  1. laver les sections trois fois au PBS-H pendant au moins 20 min.
    Remarque : Si planification aval ISH 19, difficulté les sections de paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 h pour sécuriser les tétramères et les anticorps en place et puis laver les sections deux fois avec du PBS-H pour chaque 5 min.
    ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique ; porter un équipement de protection individuelle approprié.
  2. Utiliser un pinceau pour transférer les sections à une lame de microscope. Veillez à ne pas pousser le tissu en trop. Enrober chaque section avec glycérol/gélatine contenant 4 mg/mL de gallate de propyle ou un autre milieu de montage contenant un fluorophore conservateur. Recouvrir d’un lamelle couvre-objet.
  3. Stocker les lames dans un récipient protégé par lumière diapositive à -20 ° C. Rincer les plaques de culture de tissus et enlever les étiquettes sur les couvercles à l’aide de l’alcool.
    Remarque : Les plaques peuvent être réutilisés.

5. Acquisition d’Images de Microscope Confocal

  1. Capture des images à haute résolution avec un microscope confocal, utilisant les lasers appropriés et les filtres pour chaque fluorophore ( Figure 1 a et B).
    Remarque : Dans cet exemple, un microscope confocal (voir la Table des matières) a été utilisé. Des images ont été recueillies à l’aide de 561 nm laser à 20 % de puissance pour les cellules de T antigène-spécifiques verdâtres jaune marquée, le laser de 488 nm à 10 % de puissance pour les cellules B CD20 exprimant marqués au vert et le laser de 640 nm à 15 % de puissance pour bien marqué au rouge des cellules T CD8. 20 X objectif et une ouverture numérique de 0,8 servaient.
  2. Recueillir séquentiellement des intervalles de série z à 3 µm (ou autre) dans les trois canaux dans plusieurs champs de 800 x 800 pixels. Construire un montage des champs collectés ( Figure 1 -E). Nommez chaque image montage basé sur les informations de la diapositive correspondante, puis enregistrer pour analyse.
  3. Effectuer une analyse quantitative d’image utilisant le logiciel d’analyse et quantification de microscope confocal respectifs ou ImageJ.

6. Analyse quantitative d’images

Remarque : analyse Quantitative d’image peut être accompli en utilisant le logiciel d’analyse et de quantification microscope confocal ou en utilisant des logiciels ImageJ. Ici, ImageJ a été utilisé à titre d’exemple.

  1. Open a confocal montage en le faisant glisser vers la fenêtre ImageJ ( Figure 2 a).
    NOTE : ImageJ peut ouvrir directement les montages recueillies par plusieurs différents microscopes confocaux. Si le montage ne peut être ouvert directement par ImageJ, exporter le z-scan sélectionné au format TIFF pour ouvrir it.
  2. Dupliquer le z-scan sélectionné pour analyse (" Image "-> " double ") ( Figure 2 b).
  3. Séparer les différents canaux (" Image "-> " couleur "-> " canaux Split ") ( Figure 2).
  4. Dessiner le ROI pour l’analyse quantitative dans le canal correspondant à être objectif et ajoutez-le au gestionnaire du ROI en appuyant sur " T " sur le clavier. Mesurer l’aire.
    Remarque : Le gestionnaire de ROI d’ImageJ montre la zone en µm 2 ( Figure 2D).
  5. Régler la fluorescence luminosité et le contraste de la chaîne à analyser (" Image "-> " réglage "-> " luminosité/contraste ") ( Figure 2E).
  6. Aplatir le retour sur investissement sur l’image (" Gestionnaire de ROI "-> " Flatten ") ( Figure 2F).
  7. Quantifier les cellules positives dans l’image en utilisant la " multipoint " outil ( Figure 2).

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Résultats

Figure 1 montre comment recueillir les images confocales à l’aide d’un microscope confocal. La figure 2 illustre analyse quantitative d’image à l’aide de ImageJ. Figures 3 et 4 montrent représentant des images de ganglion lymphatique tissus provenant d’un SIV infectés macaque rhésus tachée de tétramères MHC et CD8 anticorps anticorps CD20 et servent à démontrer la spécificité de la coloration de ...

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Discussion

IST combiné avec IHC fournit un outil essentiel pour détecter, caractériser et quantifier les cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les environnements natifs avec le contexte d’autres cellules et les structures tissulaires. Ici, nous avons décrit des procédures détaillées pour IST combiné avec l’IHC, suivie de l’analyse quantitative d’image, afin de déterminer l’emplacement, l’abondance et le phénotype des cellules T CD8 spécifiques de l’antigène dans les ganglions lymphatiques des macaques rhésus. Une coloration...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Service de santé publique accorde de la National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Monomère CMH-Ide tétramère NIHMatériaux pour la préparation du tétramère CMH
ExtrAvidin-FITCSigma-AldrichE2716Matériaux pour la préparation du tétramère CMH
Sérum de chèvre normalJackson Immunoresearch005-000-121
Agarose à bas point de fusionPromegaV3121
HéparineSigma-Aldrich
Triton X-100Sigma-AldrichT-6878
UreaJ.T.Baker4204-05
Gélatine de glycérolSigma-AldrichSLBH2672V
gallate de n-propyleSigma-AldrichP3130
rat-a-h-CD8 (1:500)Acris0714Anticorps instable, utiliser de l’aliquote
m-a-h-CD20 (1:500)NOVOCASTRA6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)Vecteur6022201
goat-a-m-A488 (1:2 000)Jackson Immunoresearch124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5 000)Jackson Immunoresearch106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5 000)Jackson Immunoresearch118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5 000)Jackson Immunoresearch86579
Compresstome : VF-300 MicrotomePrecisionary Instruments, LLC1079
Quick Set Instant AdhesiveLoctite46551
Plaques de culture de tissus à fond plat 24 puitsFalcon353226
Lame de microscopeGlobe scienfitic Inc.#1321
Lame de rasoirTed Pella, Inc121-6
Scalpel jetable en plumesFEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.N° 21
Pinceau rond #2PRINCETON ART & BROSSE CO.4350RPeut tailler selon les besoins avec un rasoir
Microscope confocalOlympusFV1000
FV10-ASW_Viewer4.0Olympus
Plate-forme SLBL6391Vcongelée à usage unique

Références

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Mots-clés

Coloration in situimmunohistochimiemicroscopie confocalecytom trie en fluxsectionnement de tissusfixation au paraformald hydeanticorps conjugu s la fluorescenceimagerie en s rie Z

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