Mesurer les variations In Vivo des neurotransmetteurs extracellulaires pendant naturellement récompenser les comportements chez les femelles Hamsters syriens

Résumé

Ce livre présente en détail l’utilisation d’enregistrements ampérométrie potentiel fixe à l’aide d’électrodes de fibre de carbone et de la technologie de biocapteurs enzymatiques pour mesurer la libération de dopamine et du glutamate avec haute résolution temporelle lors de comportement gratifiant naturel dans le hamster femelle.

Résumé

La capacité de mesurer la libération des neurotransmetteurs sur une échelle de temps rapide permet aux patrons de la neurotransmission liés à des comportements spécifiques ou des manipulations ; un outil puissant dans l’élucidation des mécanismes sous-jacents et le circuit. Alors que la technique de la microdialyse a été utilisée pendant des décennies pour mesurer presque n’importe quelle analyte d’intérêt dans le cerveau, cette technique est limitée en résolution temporelle. Alternativement, une numérisation rapide voltampérométrie cyclique est aussi bien dans le temps précis et extrêmement sensible ; Toutefois, comme cette méthode techniquement difficile repose sur l’électroactivité de l’analyte d’intérêt, la possibilité de détecter les substances nonelectroactive (p. ex., le neurotransmetteur glutamate) est éliminée. Ce livre présente en détail l’utilisation d’un système clé en main qui combine l’ampérométrie potentiel fixe et biocapteurs enzymatiques pour mesurer les neurotransmetteurs des polymères électroactifs et nonelectroactive avec la précision temporelle. Le jumelage de ces deux puissantes techniques permettant la mesure de neurotransmission phasique et tonique avec une relative facilité et permet l’enregistrement de plusieurs neurotransmetteurs simultanément. Le but de ce manuscrit est de démontrer le processus de mesure de la dopamine et du glutamate neurotransmission in vivo à l’aide d’un comportement naturellement enrichissant (c.-à-d., comportement sexuel) chez les hamsters femelles, dans le but d’afficher la faisabilité technique de ce test pour l’examen des autres comportements et paradigmes expérimentaux.

Introduction

La capacité de mesurer la libération des neurotransmetteurs chez les animaux de se comporter éveillé permet aux chercheurs de comportements spécifiques avec des modèles spatiaux et temporels de la neurotransmission, un outil puissant pour étudier les mécanismes et circuits qui sous-tend tous les deux un lien naturel et les comportements opérant en temps réel. Historiquement, microdialyse a été utilisée pour mesurer les substances électriquement réactifs et non réactifs dans le milieu extracellulaire du cerveau¹. Cette technique utilise un flux continu d’une solution aqueuse de composition ionique semblable au liquide extracellulaire, au moyen d’une sonde de microdialyse composée d’un petit arbre avec une pointe de membrane semi-perméable fibre creuse². Après l’insertion de la sonde, les neurotransmetteurs ou autres analytes d’intérêt peuvent traverser la membrane semi-perméable par diffusion passive avant sont recueillis à des intervalles pour une analyse ultérieure par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), un chimie analytique technique communément utilisée pour séparer, identifier et quantifier les composants d’un mélange hétérogène de³.

Bien que la microdialyse est une technique sensible qui peut être utilisée pour mesurer pratiquement n’importe quelle analyte d’intérêt, la résolution temporelle est faible, avec des fréquences d’échantillonnage maximale de l’ordre de minutes à quelques dizaines de minutes^1,2. L’invention de la voltampérométrie cyclique de balayage rapide (FSCV), une technique qui s’appuie sur le potentiel d’oxydo-réduction des espèces électroactives, peut élucider près de concentrations instantanées de l’analyte d’intérêt dans le liquide extracellulaire. En bref (voir Robinson et al. ⁴ pour un examen approfondi), une électrode est appliquée pour soulever et abaisser la tension d’une manière vague triangulaire sur une échelle de temps rapide⁴. Lorsque la tension est dans la plage correcte, le composé d’intérêt est à plusieurs reprises oxydé et réduit. Cette oxydation et réduction se traduit par un mouvement d’électrons qui crée un petit courant alternatif. Analyse des taux aura lieu sur l’échelle de seconde avec l’oxydation et de réduction des composés qui se produisent en microsecondes. En soustrayant l’arrière-plan actuel créé par la sonde de courant qui en résulte, on peut générer une tension vs actuelle parcelle unique pour chaque composé. Étant donné que l’échelle de temps des oscillations tension est connue, ces données peuvent servir à calculer une parcelle du courant en fonction du temps. Ainsi, les concentrations relatives de ce composé peuvent être déterminées tant que le nombre d’électrons transférés dans chaque oxydation et la réaction de réduction est connue⁴.

Cette spécificité chimique et une haute résolution temporelle faire FSCV une technique puissante pour la détection de modification chimique concentration in vivo. Cependant, malgré ces multiples avantages, cette technique requiert une grande expertise technique et des équipements coûteux et le programme d’installation. En outre, nonelectroactive neurotransmetteurs (p. ex., glutamate) ne peuvent être mesurées à l’aide de cette technique. Heureusement, les progrès technologiques dans le domaine de l’électrochimie⁵, ainsi que la commercialisation de ces inventions, a introduit une approche relativement simple de mesurer non-polymères électroactifs neurotransmetteurs chez les animaux éveillés de comportement anormal sans compromettre la technique temporelle de précision-a connu comme la technologie des biocapteurs enzymatiques. Cette technique utilise la conversion enzymatique du neurotransmetteur nonelectroactive d’intérêt dans les deux substrats, dont une est électroactifs de peroxyde d’hydrogène qui est détecté comme un courant d’oxydation ampérométrique généré par un potentiel appliqué⁵ . Sondes de biocapteur disponible dans le commerce (voir Figure 1) mesurent sélectivement analytes d’intérêt en competitivement réduisant la contribution des interférences endogènes. Dans le cas de glutamate, la contribution de la commune interferent l’acide ascorbique (AA) est compétitif réduite au courant mesuré en localisant co oxydase AA sur la surface active enzymatique du capteur, conversion AA non-polymères électroactifs déhydroascorbate et l’eau. En outre, une couche de polymère chargée négativement Nafion présente sous la couche de l’enzyme exclut les composés anioniques endogènes.

Ce même montage expérimental de biocapteur peut mesurer électroactifs neurotransmetteurs comme FSCV, mais au lieu de cela, il emploie un enregistrement potentiel fixe⁶. Contrairement à la tension oscillante appliquée dans FSCV, dans un enregistrement potentiel fixe la tension est maintenue à l’oxydo-réduction potentielle pour l’analyte d’intérêt. Bien qu’il soit moins chimiquement sélectif que FSCV car plusieurs neurotransmetteurs peuvent avoir le même potentiel, de redox dans les zones cérébrales qui majoritairement incliner vers un neurotransmetteur, la nature de la clé de cette approche l’emporte sur l’absence de produit chimique spécificité.

La possibilité de mesurer des polymères électroactifs et nonelectroactive libération des neurotransmetteurs en temps quasi réel et liez-le à certains événements comportements fournit l’occasion d’examiner la libération des neurotransmetteurs convergentes. Ce manuscrit détaille l’utilisation de ce système d’interroger la neurotransmission de la dopamine et du glutamate en réponse à la récompense naturelle chez les hamsters se comporter éveillés. Le but du présent document est de détailler le processus de mesure de cette libération des neurotransmetteurs durant le comportement sexuel chez les hamsters femelles, dans le but de démontrer la faisabilité à l’examen des autres comportements et paradigmes expérimentaux.

Les hamsters sont un modèle idéal pour une utilisation dans les enregistrements électrochimiques
Historiquement, modèles de rat et de souris ont été utilisés dans l’étude du comportement sexuel. Ces espèces de rongeurs se livrer à une séquence de copulation dynamique, impliquant de nombreux comportements féminin invitation qui incluent hopping, s’élançant et oreille remuant pour attirer le mâle pour chasser et finalement monter la femelle⁷. Le montage par le mâle (avec ou sans pénétration vaginale) dure seulement quelques secondes, pendant laquelle la femelle s’engage dans sa posture de comportement sexuel (appelée lordose) également seulement pendant quelques secondes avant de reprendre les comportements de sollicitation active. Ce modèle de comportement, composé de niveaux élevés d’activité entrecoupées de courtes périodes d’immobilité, est problématique pour la mesure de la neurotransmission dans le comportement des animaux. Tout d’abord, on peut artefacts de mouvement dans les enregistrements ampérométrique non liés à l’activité neurale. Deuxièmement, la locomotion est associée à la libération de neurotransmetteurs particuliers dans certaines régions du cerveau. Par exemple, la libération de dopamine a été couplée à l’activité locomotrice dans le striatum dorsal et ventral^8,9, une constatation qui ont formé la base pour les mesures de la microdialyse de dopamine après psychostimulant administration,¹⁰. Parce que les comportements de sollicitation femelle typique MOSt rongeurs impliquent des niveaux élevés de l’activité locomotrice et sont représentés par la majeure partie d’un test de comportement sexuel de 10 minutes, ce qui rend difficile d’attribuer les changements dans la neurotransmission aux composantes du comportement sexuel explicites qui collectivement durent seulement minutes.

Pour analyser le profil neurochimique du comportement sexuel féminin, ce laboratoire chercha une espèce dans laquelle il y a une activité locomotrice minimale accompagnant le comportement sexuel. La séquence de copulation chez le hamster syrien (Mesocricetus auratus) est idéale pour les enregistrements neurochimiques en raison de l’absence de comportements de sollicitation généralement vu chez les rats et les souris¹¹. En conséquence, hamsters femelles vont entrer et pour gérer la posture de la lordose pour plus de 9 minutes sur 10 minutes essais session¹². Avec l’absence de mouvements locomoteurs étrangères par la femelle, en vivo électrochimiques enregistrements qui peuvent être associés aux éléments d’interactions sexuelles avec le mâle peuvent être obtenus.

Combats de copulation chez les hamsters
Après l’introduction d’un animal mâle stimulus dans la chambre d’essai, le mâle engagera au départ dans l’enquête d’ano-génitales (IA) de la femelle avant de monter le son (Figure 2A). Afin que le mâle à la monter, la femelle doit assumer une posture sexuelle réceptive appelée lordose, dans laquelle elle arches son dos et dévie vers sa queue, afin que le mâle de montage peut accéder du pénis dans son vagin. Le mâle va monter la femelle, étreignant son arrière-train avec deux pattes (Figure 2B) et commencer à chevauchement pour tenter de gagner l’intromission du pénis (Figure 2C). Le mâle va monter la femelle (sans insertion) ainsi qu’intromit un certain nombre de fois avant d’atteindre finalement l’éjaculation. Cette séquence de montures et intromissions conduisant à l’éjaculation est appelée un « bout de copulation ». Les hommes auront plusieurs épisodes copulateurs dans une seule session.

Protocole

toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Minnesota et sont en conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ¹³ .

1. animaux et chirurgie de canulation

hamsters

1. syrienne d’obtenir auprès d’un fournisseur d’animaux commun environ 55 jours après la naissance.
   Remarque : Bien que l’âge des animaux varient en raison de contraintes de différents paradigmes expérimentaux, pour comportement sexuel il est important d’obtenir des animaux sexuellement matures qui ont tous environ le même âge.
2. Animaux de la maison dans un contrôle de température (22 ° C) et de l’environnement d’éclairage (14 h de lumière suivie de 10 h d’obscurité avec lights out à 13:00 h), avec la nourriture et l’eau disponible ad libitum sauf pendant les périodes d’essai expérimental.
   Remarque : Étant donné que les hamsters reproduisent selon les saisons, ce 14:10 cycle lumière/obscurité imite leurs conditions de reproduction naturel.
3. Après une acclimatation de 1 semaine au laboratoire, effectuer des ovariectomies bilatéraux aseptiques et des canules stéréotaxiques intracrâniennes sous anesthésie générale (p. ex., pentobarbital) et administrer appropriées sur le plan institutionnel-approuvé un traitement analgésique et antibiotique postopératoire décrite précédemment ^{14 , 15}.
   Remarque : Pour l’étude du comportement sexuel, ovariectomies sont nécessaires pour supprimer la principale source endogène des hormones sexuelles, afin que les animaux peuvent être uniformément induites à la réceptivité sexuelle avec hormone exogène, conformément à la chronologie expérimentale.
   1. Pour l’implantation de sonde fois dopaminergique et glutamatergiques, stereotaxically implant guide canules (0,7 mm de diamètre ; la figure 3) dans la zone d’intérêt (par exemple, ce laboratoire ciblé le bon noyau accumbens (NAc)) tel que décrit en détail par ailleurs ¹⁵.
      Remarque : Bien que les données présentées proviennent des enregistrements d’un capteur unique d’une sonde de glutamate ou de la dopamine par animal, ce système permet l’enregistrement simultané de jusqu'à 4 capteurs dans un seul animal ; ainsi, 1-4 canules pourraient être implantées selon résultats et plan expérimental désiré.
      1. Déterminer les coordonnées d’implant de la région d’intérêt à l’aide d’un atlas stéréotaxique (par exemple, Le cerveau le Hamster doré par Morin & bois), gardant présente à l’esprit que le capteur s’étend de 1 mm en dessous de la canule dans les tissus cérébraux.
   2. Après stereotaxically, une canule est abaissée vers l’emplacement souhaité de la dorsale-ventral, il appose sur le crâne à l’aide d’un bouchon construit à partir d’acrylique dentaire, fixé avec des vis en acier inoxydable et une tête en plastique monter ( Figure 3 ; Voir ¹⁵ pour plus de détails).
   3. Pour les tests de fibre de carbone, insérer une électrode de référence (350 μm de diamètre, longueur totale 7,5 mm) dans l’hémisphère controlatéral.
      Nota : Un emplacement spécifique ou la distance de la canule n’est pas exigé ; électrodes de référence peuvent être placés n’importe où dans l’hémisphère controlatéral qui convient.

2. Biocapteur et tests de fibre de carbone

1. après 1 semaine de récupération de la chirurgie, administrer le régime d’amorçage hormone pour induire la réceptivité sexuelle.
   1. Injecter 10 µg de benzoate d’estradiol dans 0,1 mL d’huile de coton par voie sous-cutanée (s.c.), environ 48 h et 24h avant le comportement sexuel des tests, pour induire la réceptivité sexuelle vers le mâle ¹¹.
   2. Injecter 500 µg de progestérone dans 0,1 mL d’huile de coton, s.c., 4 h avant l’introduction du mâle pour induire la réceptivité sexuelle ¹¹.
2. Tester tous les animaux au début de la phase nocturne de leur cycle de tous les jours, comme les comportements sociaux des rongeurs sont sous réserve de modifications en vertu de la lumière blanche et rouge test conditions ^{16 , 17 , 18}.
3. pour tester les biocapteurs enzymatiques glutamate, étalonner les capteurs in vitro ( Figure 4) avant de l’utiliser comme décrit plus haut ^{15 , 19}.
   1. faire le calibrage des solutions fraîches sur la journée d’essais en verre 20 mL centrifuger les tubes. Pour la solution d’analyte, dissoudre 7,4 mg d’acide L-glutamique dans 10 mL d’ultra purs H ₂ O en retournant doucement le tube. Faire la solution interferent en dissolvant 176,1 mg AA dans 10 mL d’ultra purs H ₂ O.
   2. Mis en place pour l’étalonnage en plaçant un agitateur magnétique sur la base d’un stand d’anneau de laboratoire de base. Placer un bécher chemisé de 20 mL sur le dessus de l’agitateur magnétique et la bloquer à l’aide d’une pince de 2 broches moyenne.
      1. Ajouter une agitation magnétique bar et 20 mL de 100 mM de phosphate solution saline tamponnée (PBS) dans le bécher chemisé. Connectez le bécher chemisé à un bain d’eau circulant à chauffer la solution tampon à 37 ° C.
         NOTE : Les étalonnages de biocapteurs enzymatiques doivent être effectuées à la température corporelle, étant donné que l’activité enzymatique est influencée par la température.
   3. Placer le support de calibrage capteur sur le becher chemisé et définissez un préampli 4 canaux d’étalonnage sur le dessus, en fixant à l’aide d’une pince à angle droit. Connecter l’appareil à un appareil de climatisation et d’acquisition de données pour les données d’étalonnage record.
   4. Tester la sensibilité de chaque biocapteurs enzymatiques au glutamate (ou autres analytes d’intérêt pour les autres disponibles dans le commerce de biocapteur sondes par exemple, glucose) avant l’enregistrement expérimental en plaçant la sonde dans le support de calibrage au sommet d’une bécher chemisé, submergeant la cavité de télédétection et d’une partie de la référence de chlorure d’argent (AgCl) câblage dans la solution tampon.
      1. Avant de connecter chaque capteur (jusqu'à 4) mis à l’essai à un port sur un préampli 4 canaux d’étalonnage, initier un nouvel enregistrement sur l’interface de l’ordinateur utilisant le logiciel d’acquisition téléchargeables gratuitement. Laisser les capteurs atteindre un niveau de référence stable.
   5. Commencer à ajouter les injections d’analyte lorsque les capteurs ont atteint un niveau de référence stable. Utilisez le trou dans le support de calibrage pour introduire un embout de la pipette dans la solution tampon. Utilisez l’outil d’annotation clé rapide dans le logiciel d’enregistrement pour annoter quand une injection est faite.
      1. Ajouts µM 10 faire du glutamate par pipetage 40 μL de la solution d’analyte dans la solution tampon. Attendez que le capteur se stabiliser entre les ajouts. Ajouter 3 injections de solution d’analyte avant d’ajouter une seule injection de la solution de AA interferent (volume d’injection μL 50 250 μM changement de concentration).
         Remarque : L’étalonnage permet la conversion des modifications du signal ampérométrique (vu lors de l’enregistrement expérimental enzymatique à l’étape 2.12) aux variations de concentration de glutamate, si vous le souhaitez. Voir référence ¹⁵ pour les instructions par étapes. Les sondes dopaminergique utilisés par ce laboratoire sont étalonnés au cours du processus de fabrication par le fournisseur commercial. Glutamate sondes doivent être étalonnés au moment de l’utilisation que leur sensibilité peut diminuer au fil du temps, car les composants enzymatiques dégradent ¹⁹. Parce que la fibre de carbone électrodes ne subissent pas de dégradation, le calibrage effectué par la société avant expédition est suffisant le long comme tVoici une probabilité accrue d’endommager la fibre de carbone léger (350 μm de diamètre) grâce à une gestion supplémentaire.
4. La ligne de la chambre d’essai avec literie provenant de l’animal ' cage maison de s.
   Remarque : Ceci augmente la femelle ' chambre de familiarité de s dans les essais, ainsi que l’expose le mâle pour stimuler sexuellement les signaux olfactifs de l’accouplements qui ont été distribués par la femelle dans la réponse au traitement estradiol.
5. Légèrement anesthésier les animaux avant l’insertion de la sonde par isoflurane ou un autre anesthésique volatil dans une chambre à induction.
6. Supprimer l’obdurator occlusive de la canule guide et insérez la fibre de carbone électrode ou sonde enzymatique par l’intermédiaire de la tige guide.
7. Après l’insertion de la sonde, placer l’animal dans la chambre d’essai.
   Remarque : Ce laboratoire utilise un aquarium en verre 10-gal (24,5 x 48,9 x 29,4 cm), mais chambres rondes de superficie égale peuvent également être employées.
8. Commencer à enregistrer le signal vidéo et verrouillé en temps ampérométrique dans un logiciel disponible dans le commerce, décrit en détail ailleurs ¹⁵.
9. Connecter le capteur pour le système d’enregistrement : le potentiostat via un câble électrique blindé et un pivotement électrique. Stabiliser le raccordement des capteurs en vissant un accessoire de broche sur la tête de montage. Renforcer la connexion à l’aide de film de laboratoire si nécessaire.
   Remarque : Un connecteur personnalisé est nécessaire pour fixer la fibre de carbone électrode et électrode de référence pour le potentiostat, tandis que les capteurs enzymatiques glutamate peuvent être connectés directement à la potentiostat.
10. Permettre au capteur s’équilibrer dans le cerveau avant l’essai expérimental.
    NOTE : Temps d’établissement diffèrent selon le capteur de l’enregistrement (par exemple, capteurs enzymatiques nécessitent l’équilibration du 2-4 h, tandis que les électrodes de carbone-fibre exigent seulement environ 30 min). Si les deux types de capteurs sont implantées, équilibrer pendant la longue période de capteur enzymatique.
11. Après équilibration de capteur, introduire un mâle de stimulation dans la chambre d’essai.
12. Après le premier montage avec insertion du pénis (appelée intromission) par le mâle de la relance, continuer l’enregistrement pour un 10-30 min supplémentaire, selon les objectifs expérimentaux.
13. Suite à des tests comportementaux, débranchez la femelle ' capteur s.
14. Supprimer les deux hamsters de la chambre d’essai. Enlever la litière et nettoyer la chambre à l’aide d’éthanol à 70 %.
    Remarque : En raison de l’équilibration bref requise pour les enregistrements de la fibre de carbone, étapes 2.3-2.14 peuvent être répétées pour tester plusieurs animaux dans la même journée. En revanche, comme les capteurs enzymatiques nécessitent environ 4 h de l’équilibration, ne tester qu’un seul animal par jour afin de limiter la variation inter-sujet possible en raison des différences chez les animaux ' circadienne temps lors des tests.

3. Sacrifice et la Perfusion

1. l’issue de la période d’essai, profondément anesthésier le cobaye femelle avec un agent euthanizing (par exemple, ce laboratoire utilise une injection intrapéritonéale de 0,2 mL de solution de phénytoïne et pentobarbital) .
2. Transcardially perfuse l’animal avec 25 mM PBS, pH 7,6, pour enlever tout le sang circulant, suivi d’une fixation de 20 min à l’aide de 4 % paraformaldéhyde-PBS.
3. Enlever le cerveau et postfix en ~ 30 mL de la solution de paraformaldéhyde à 4 % dans un tube conique de 50 mL du jour au lendemain. Solution de saccharose-PBS
   1. magasin du cerveau dans un 10 % jusqu’au moment de la section série.
      NOTE : Cerveaux peut-être être conservés jusqu'à 2 semaines, avec des changements de solution de saccharose hebdomadaire pour éviter la croissance potentielle de contaminants.
4. Série section du cerveau à 40 µm fend la région implantée soit avec un microtome à congélation ou cryostat décrite précédemment ¹⁹.
5. Monter en série des tranches sur des lames de revêtement adhésif disponibles dans le commerce (ou voir ²⁰ à faire). Laisser pour sécher, au moins du jour au lendemain.
6. Tacher les diapositives avec un colorant violet de crésyle, clair, et lamelle comme décrit plus haut ²⁰.
7. Les diapositives à l’aide au microscope à fond clair pour confirmer le placement anatomique du capteur d’image.

4. Codage comportemental

1. vue et annoter les vidéos logiciel gratuit téléchargeable sur le marché (voir Table des matières) dans le mouvement lent à précisément les comportements de code verrouillage de temps au signal ampérométrique.
   Remarque : Pour utiliser le code MATLAB dans l’analyse (voir ci-dessous ), annoter le début et à la fin de chacun de la femelle ' s et mâle ' comportements s.
   1. Annoter startLordosis dans le cadre quand la femelle initie une dorsiflexion de son dos et sa queue vers le haut les défauts. Annoter des endLordosis lorsque la femelle met fin à cette posture, qui se produit souvent lorsque la femelle réajuste vers un autre emplacement dans la chambre d’essai.
   2. Annoter startAI quand la femelle est dans la posture de la lordose et le mâle déplace son museau vers la femelle ' la région anogénitale s, où les renifler, lécher ou fouinais de sa région périnéale peut se produire. Annoter des endAI lorsque le mâle supprime son museau de la proximité immédiate de la femelle ' la région anogénitale s.
   3. Annoter startMount quand le mâle s’approche et met ses pattes de devant sur la femelle dans une posture de montage, indépendamment de l’orientation de la tentative de montage (p. ex., côté, rumsteck).
   4. Annoter startIntromission lorsque le chevauchement réussie gagne l’accès du pénis masculin monté à la femelle ' vagin s.
      Remarque : Une intromission est sur le plan comportemental distingue le charriage monté qui se produit avant l’intromission, comme le mâle visiblement tire ses membres supérieurs vers son corps, son bassin vers l’avant les coups et enroule sa queue vers le haut, indiquant la pénétration (voir < classe forte = « xfig » > Figure 4 C).
      1. Le cas échéant, annoter éjaculation.
         Remarque : À la fin d’un combat d’accouplement et en conjonction avec une intromission réussie, le mâle va éjaculer. Bien qu’on ne peut pas visualiser les émissions réelles, des hamsters mâles ont une caractéristique foulant le mouvement avec leur patte pendant une intromission ²¹, ainsi annoter l’éjaculation à l’apparition du mouvement pied.
   5. Annoter endIntromission et endMount en même temps dans le cadre lorsque le mâle a supprimé ses deux pattes avant et donc, n’a aucun contact avec la femelle. En raison de l’incapacité fréquente de visualiser son retrait, simultané code ces deux comportements pour permettre à la cohérence et la fiabilité entre périodes d’accouplement.
      Remarque : Un combat accouplement suit une éjaculation avec succès ou lorsque la femelle rompt la posture de lordose suite au moins un monter.

5. Analyse de données d’exemple

Remarque : l’utilisation de la fibre de carbone fixe-potentiel et enregistrements enzymatiques pour dopamine uneglutamate de ND, respectivement, permet la possibilité de mesurer les toniques et phasiques motifs de libération électrochimique. Ce laboratoire utilise un système d’acquisition libre, commercial et logiciel pour enregistrer et convertir enregistré les signaux de l’analogique au numérique (biaiser 0.600 V, fréquence d’échantillonnage = 1 Hz).

1. Description du protocole de l’analyse de données exemple
   1. bien que d’autres programmes peuvent être utilisés, quantifier les toniques et phasiques (transitoires) modifications du signal électrochimique enregistré à l’aide de MATLAB.
      1. Pour les données présentées, calculer le signal de la tonique à l’aide d’un filtre de moyens mobile 50 points. Une représentation normalisée uniquement transitoire du signal a été calculée en soustrayant le signal tonique de données brutes. Lors de l’identification des pics phasiques, il existe diverses options algorithmiques (p. ex., étiquetage des pics comme des modifications du signal plus que 1 SD au-dessus de la moyenne).
      2. Identifier les emplacements de ces pics, c.-à-d., maxima locaux, du signal normalisé à l’aide de la fonction MATLAB peakfinder avec l’amplitude de crête minimale mis à la racine carrée du signal. L’emplacement des pics détectés à partir du signal normalisé a été utilisé pour extraire l’amplitude de chaque pic. La capacité de détecter des pics permet l’identification de tous les comportements de verrouillage de temps pouvant être coïncidant avec, ou conduire le relatives des pics dans le neurochimiques incriminés.
   2. Segment les données traitées selon les annotations comportementales (voir étape 3), un étudiant ' s t-test a été utilisé pour évaluer les différences dans le niveau de neurotransmetteur tonique, l’apparition de phénomènes transitoires et l’amplitude des transitoires pendant la lordose de combat avant accouplement contre lordose pendant l’accouplement des combats. Pour mesurer les changements à des schémas de tonique de libération électrochimique, les points de données qui se produisent au cours de la position de lordose directement avant un combat d’accouplement (c.-à-d., avant accouplement lordose de combat) ont été comparés à des points de données pendant un combat accouplement session à l’aide d’un t-test
2. Préparation de données brutes pour protocole d’analyse de données décrit
   Remarque : comme indiqué, bien que d’autres programmes ou analyses peuvent être également des options viables, afin d’utiliser le code MATLAB décrit ci-dessus, les données brutes doivent être prêts à la manière suivante :
   1. Exporter les fichiers d’annotation et de tension. Pour ce faire, sous le ' fichier ' onglet, sélectionnez le ' exportation ' fonction et sélectionnez la ' Annotations ' tab pour enregistrer les annotations. Sous le ' fichier ' onglet, sélectionnez le ' exportation ' fonctionner et choisir le " TSV ' tab pour enregistrer les mesures de tension comme un fichier d’extension TSV.
   2. Ouvrir chaque fichier avec un programme de tableur et enregistrez sous ' xls/xlsx ' de rendre les fichiers compatibles avec MATLAB.
      Remarque : Pour le ' Annotation ' fichier, il existe d’autres annotations qui doivent manuellement ajouté postérieur à l’exportation dans un tableur de dicter le début et la fin des deux la lordose bout avant accouplement (annotée comme PreMBlordorsis ) et le combat d’accouplement pour que ces moments peuvent être directement comparés comme mentionné dans l’étape 5.1.2.
   3. Annotez le début de la lordose avant accouplement de combat (startPreMBlordosis) dans le même temps, comme un comportement de lordose commence (startLordosis) qui a également inclut un comportement de monter et aussi, au début d’un nouvel accouplement combat si la femelle reste dans la posture de lordose.
   4. Annoter la fin de la lordose avant accouplement de combat (endPreMBlordosis) lorsque le premier Mont commence.
   5. Annoter le début d’un combat d’accouplement (startMB) au moment même de l’endPreMBlordosis, cela signifie le début d’un combat d’accouplement.
   6. Annoter la fin d’un combat d’accouplement (endMB) aux extrémités de la d’un montage comprenant une éjaculation (voir étape 4.1.4.1), ou à la suite de la femelle ' cessation de s de la posture de la lordose (endLordosis).

Résultats

En utilisant l’électrochimique et comportementale codage méthode décrite ci-dessus, ce laboratoire a commencé à caractériser tant toniques et phasiques fluctuations de dopamine et de glutamate pendant in vivo des enregistrements du comportement sexuel. En raison de la manière dans le temps précis de cette méthodologie, nous pouvons mieux caractériser la neurotransmission lors de comportement sexuel ; en plus d’attribuer des changements dans les modes de libération changements cor...

Discussion

Bien que relativement simple, certains problèmes peuvent survenir lorsque vous utilisez cette technique. Tout d’abord, le placement stéréotaxique des sondes doit être précis : contrairement à la microdialyse qui échantillonne un rayon plus large du milieu extracellulaire qui entoure la sonde, cette technique ne permet la mesure d’un neurotransmetteur qui entre en contact direct avec la sonde. Deuxièmement, dans le cas de l’enregistrement de la fibre de carbone, en raison de la faible largeur de fibre, rupture peut se pro...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodique injectable, USP. Ce laboratoire utilise 8,5 mg/100 g de poids corporel, injecté par voie intrapérotive.
Analgésique Loxicom  ;	Norbrook Laboratories  ;	6451603670	anti-inflammatoire et analgésique AINS utilisé pour le contrôle de la douleur postopératoire. Générique : méloxicam.
Antibiotique Enroflox  ;	Norbrook Laboratories  ;	5552915411	Antibiotique fluoroquinolone pour la prévention des infections postopératoires. Générique : Enrofloxacine.
Beuthanasie-D  ;	Merck Santé animale	00061047305	Pentobarbital sodique, Phénytoïne sodique Agent d’euthanasie.
Vis à os	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	Vis à os de 1/8 po (paquet de 16) utilisée pour fixer la calotte crânienne au crâne.
Acrylique dentaire (Bosworth Duz-All)	Bosworth  ;	166261C  ;	L’acrylique dentaire autopolymérisable est utilisé dans la construction d’une calotte crânienne pour fixer une canule et un support de tête au crâne.
Configuration matérielle du biocapteur  ;	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle propose des kits de matériel complets pour les nouveaux utilisateurs de notre système de biocapteurs captifs captifs pour rats. Les kits comprennent un commutateur, un préamplificateur et un système de conditionnement et d’acquisition de données
Ensemble d’ordinateur vidéo de base	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	L’ensemble de l’ordinateur de base comprend un ordinateur préconfiguré avec un grand espace de stockage sur disque dur, un moniteur haute définition, un clavier et une souris, une alimentation sans coupure et tous les câbles nécessaires.
Caméra vidéo EQ700 EverFocus Package	Pinnacle Technologies, Inc.	; 9000-K10  ;	La caméra boîtier EQ700 capable de vision nocturne avec source IR indépendante a été obtenue dans le cadre du package d’ordinateur vidéo Pinnacle. Des options de caméra dôme (9000-K9) et de caméra HD (9000-K11) sont également disponibles.
Logiciel d’acquisition de Sirenia	Pinnacle Technologies, Inc.	Gratuit--disponible en téléchargement sur pinnaclet.com	Sirenia. Acquisition fournit une plate-forme unique pour l’enregistrement de données à partir de n’importe quel système matériel Pinnacle. Le logiciel propose la synchronisation de tous les flux de données, des paramètres configurables par l’utilisateur, la consolidation des données et de multiples options d’exportation. En outre, le logiciel comprend des modules d’examen et d’analyse de base pour les enregistrements de biocapteurs. Sirenia  ; Fournit un logiciel LL-in-One gratuit, idéal pour l’acquisition et l’examen des données.
Rat attaché  ; in vitro  ; kit d’étalonnage	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS  ;	Afin de relier les changements de courant mesurés par un biocapteur aux changements réels de la concentration de l’analyte, il est nécessaire d’étalonner le biocapteur avant de l’implanter dans l’animal. Le processus confirme également l’intégrité et la sélectivité des capteurs. Le kit d’étalonnage comprend un bécher à chemise de 20 ml (#7058), une barre d’agitation magnétique de 1/2 » par 1/8 » (#7059), une pince à angle droit (#7056), une pince à réglage unique à 2 broches (#7055), un préampli d’étalonnage à 4 canaux (#7053) et un support d’étalonnage (#7051).  ;
Plaque d’agitation  ;	Corning	6795-410D	Agitateur numérique Corning, 5 » x 7 », 120 VAC utilisé pour faire tourner l’agitateur magnétique dans un bécher chemisé lors de l’étalonnage in vitro des biocapteurs de glutamate.
Bain-marie capable de circuler en boucle fermée	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Bain de circulation numérique chauffé standard, bain-marie 120VAC a été utilisé avec un tube en plastique pour chauffer le bécher à chemise à température physiologique.  ;
Capteur en fibre de carbone avec canules de rat BASi	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Électrode en fibre de carbone utilisée pour l’enregistrement de la neurotransmission de la dopamine.
Électrode de référence Ag/AgCl	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Nécessaire pour les enregistrements en fibre de carbone.
Biocapteurs de glutamate  ;	Pinnacle Technology, Inc.	7001  ;	Sonde biocapteur enzymatique utilisée pour l’enregistrement de la neurotransmission glutamatergique.
Canules de guidage BASi	Pinnacle Technologies, Inc.	7030  ;	Canules de guidage implantées dans la région cérébrale d’intérêt pour guider la sonde.
Canule BASi tête en plastique pour rats  ;	Pinnacle Technologies, Inc.	7011  ;	Le support de tête stabilise la sonde et se fixe au potentiostat.