Article de méthode

Reconstruction tridimensionnelle de l’Architecture vasculaire de l’ovaire de souris de clarté affranchis Passive

DOI :

10.3791/56141

⸱

10 décembre 2017

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici une adaptation de la clarté passive et la méthode de reconstruction 3D pour la visualisation de la vascularisation ovarienne et les capillaires folliculaires dans les ovaires de souris intactes.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ovaire est le principal organe de l’appareil reproducteur féminin et est essentiel pour la production de gamètes femelles et pour contrôler le système endocrinien, mais les complexes relations structurelles et les architectures de système en trois dimensions (3D) vasculaire de la ovaire ne sont pas bien décrite. Afin de visualiser les connexions 3D et l’architecture des vaisseaux sanguins dans l’ovaire intacte, la première étape importante doit faire l’ovaire optiquement transparent. Pour éviter le rétrécissement des tissus, nous avons utilisé l’hydrogel clarté passive axée sur la fixation (lipides clair-échangé hybridé Acrylamide rigide imagerie / immunohistochimie/In situ hybridation-compatible avec les tissus Hydrogel) méthode pour effacer un ovaire intact du protocole . Immunomarquage, avancé la microscopie multiphoton confocale et image-reconstructions 3D servaient ensuite pour la visualisation des vaisseaux ovariens et follicules capillaires. En utilisant cette approche, nous avons montré une corrélation positive significative (P < 0,01) entre la longueur des follicules capillaires et volume de la paroi folliculaire.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le follicule est l’unité fondamentale structurelle et fonctionnelle de l’ovaire, et son développement est très lié à la vascularisation au sein de l’ovaire. Vaisseaux sanguins d’alimentation nutrition et hormones vers les follicules et donc jouent un rôle important dans la croissance et la maturation des follicules1.

Une combinaison de technologies, y compris les marqueurs sélective des vaisseaux sanguins, des modèles de souris transgéniques et développement pharmaceutique, ont augmenté de nos connaissances sur les réseaux vasculaires ovariennes, l’angiogenèse et la fonction des vaisseaux sanguins dans folliculogenèse. L’ovaire est connu comme un organe actif car il remodèle divers tissus et réseaux vasculaires au cours de la folliculogenèse et l’ovulation. Ce remodelage actif dans la taille et la structure des navires est requis pour la fonction biologique du développement et de recrutement des follicules.

Méthodes histologiques et histomorphométrie traditionnelles en utilisant des sections ovariennes et immunomarquage des vaisseaux sanguins se limitent à des images bidimensionnelles (2D)2. Avec le développement des technologies de la reconstruction en trois dimensions (3D), des images 2D de tranches de tissus peuvent se chevaucher pour fabriquer une structure 3D, mais cette méthode a encore quelques limitations — découpe du tissu peut détruire des microstructures, certaines parties de la manquent souvent de tissu et important travail est impliqué dans la fabrication des reconstructions 3D des images obtenues par les tranches. Imagerie 3D tissus ensemble avec la microscopie confocale peut surmonter bon nombre de ces limitations, mais ces méthodes sont limitées à l’évaluation de l’angiogenèse dans les ovaires embryonnaires3. À l’aide de tissus toute compensation des méthodes telles que clarté4 peut augmenter le volume visualisé afin de résoudre ces problèmes dans les ovaires postnatals et adultes, et ces méthodes fournissent optique clairance de l’ovaire sans aucune déformations structurelles. Imagerie de l’architecture 3D de l’ovaire intact fournit une base de données de l’image exacte pour logiciel analyse d’image, tels que le progiciel Imaris utilisé dans ce travail.

Remodelage de l’ovaire tout au long de l’âge adulte fait partie d’un système physiologique dynamique, et ce qui rend l’ovaire un excellent modèle pour les enquêtes sur la régulation de l’angiogenèse. En outre, l’évaluation du rôle des ovaires des vaisseaux sanguins dans des conditions pathologiques de l’appareil reproducteur féminin tels que le syndrome des ovaires polykystiques ou des cancers de l’ovaire peut être étudié grâce à l’imagerie des tissus ovariens ensemble. Le développement de la méthode passive de la clarté et l’utilisation du logiciel d’analyse avancées d’image ont fourni des informations spatiales détaillées sur les relations entre les vaisseaux sanguins et ovaires structures telles que les follicules.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures impliquant des animaux sujets conformé aux directives du Comité d’éthique animale à Shanghai Medical College, Université de Fudan (numéro d’agrément 20160225-013).

1. préparation de l’ovaire de souris Transparent

  1. Préparation des solutions
    1. Préparer la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1 M, pH 7,6) avec 0,1 % X-100 Triton (PBST). Pour faire 1 L de solution 10 x de la mère de PBS, mélangez 87 g de NaCl, 3,1 g de NaH2PO4 · 2H2O et 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. ajouter des dH2O à 1 L et brassez ~ 2 h. régler à pH 7,4 avec NaOH N 1 et conserver à température ambiante. Diluer cette solution-mère 10 x en 1/10 à l’aide de dH2O et ensuite faire 0,1 % Triton X-100 dans du PBS.
    2. Préparer la solution d’hydrogel (pH 7.5) par mixages 4 % (wt/vol) solution de paraformaldéhyde (PFA), 4 % (wt/vol) d’acrylamide, 0,05 % (wt/vol) de bisacrylamide et initiateur VA-044 0,25 % (wt/vol) dans l’eau bidistillée sur la glace.
    3. Préparer la solution de compensation (pH 8,5) en mélangeant un tampon borate de sodium 200 mM contenant 4 % (wt/vol) dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l’eau bidistillée.
  2. Préparation de la perfusion et de l’ovaire Transcardial
    1. Garder toutes les solutions sur la glace pendant toutes les procédures.
    2. Anesthésier les souris C57BL/6 adulte femelle sauvage avec une injection intrapéritonéale de solution de pentobarbital (0,35 mg/kg). Une fois qu’il ne montre aucune réponse d’orteil-pincée, la souris est correctement anesthésiée.
    3. Utilisation de ruban adhésif pour fixer la souris avec des membres tendu sur une planche de mousse plate.
    4. Exposer le cœur par une incision sur le processus xiphoïde à travers de la poitrine, peau et OS avec des ciseaux.
    5. Faire une incision dans l’oreillette droite de l’animal et puis perfuse le ventricule gauche avec 20 mL de PBS glacée 1 x à 10 mL/min.
    6. Perfuse l’animal au moins 20 mL de solution d’hydrogel à 10 mL/min.
    7. Inciser la peau sur l’abdomen le long de la ligne de medioventral avec des ciseaux, qui expose l’enterocoelia entière, et enlever les intestins. Recueillir les ovaires et l’utérus pour maintenir l’intégrité de la morphologie ovarienne.
    8. Retirez les tissus adipeux autour de l’ovaire au microscope.
  3. Dégazage
    1. Placer les ovaires dans 10 mL de solution d’hydrogel à 4 ° C, de fixation pour 3 jours.
    2. Transférer l’ovaire dans un tube de 5 mL et remplir le tube de la solution d’hydrogel. S’étendent de parafilm sur la partie supérieure du tube et puis enveloppez parafilm autour du cou du tube.
      ATTENTION : S’assurer qu’il n’y a pas de bulles entre le parafilm et la solution de l’hydrogel.
    3. Placer le tube sur un agitateur dans l’incubateur à 37 ° C pendant un maximum de 3 h pour permettre l’hydrogel à polymériser.
    4. Enlever l’ovaire du gel à l’aide d’une spatule et enlever soigneusement le gel excès autour de l’ovaire en papier de soie. Laver l’ovaire quatre fois avec du PBS 1 x.
  4. Compensation passive
    1. Immergez l’ovaire dans 10 mL de la solution de compensation. Secouer doucement à 80 tr/min à 37 ° C, pour démarrer le processus de compensation.
    2. Dans la première semaine, changez la solution tous les 3 jours. Après une semaine, actualiser la solution de compensation une fois par semaine jusqu'à l’ovaire devient claire. Ce processus prend habituellement environ 2-3 semaines.
      Remarque : L’ovaire peut être directement immunostained ou peut être stocké dans l’azide de sodium (0,02 %) dans du PBS à 4 ° C pendant plusieurs semaines avant l’immunomarquage.

2. Immunostaining

  1. Laver l’ovaire deux fois dans le PBST le jour 1 à 37 ° C dans un agitateur.
  2. Incuber l’ovaire sur un agitateur dans la solution d’anticorps primaires/PBST (tableau 1) les 2-3 jours à 37 ° C. Dans le travail présenté ici, les anticorps primaires ont été la molécule d’adhésion cellulaire endothéliale-plaquettes 1 (CD31) et de la tyrosine hydroxylase dilué à 01:10 et 01:50 dans du PBST, respectivement.
    ATTENTION : Si deux ou plusieurs sortes d’anticorps primaire sont utilisées, assurez-vous il existe différentes sources animales.
  3. Laver les anticorps primaires avec un tampon PBST à 37 ° C le jour 4 sur un agitateur.
  4. Incuber l’ovaire avec les anticorps secondaires souhaitées dans le PBST le jour 5-6 à 37 ° C dans un agitateur. Dans le travail présenté ici, les anticorps secondaires étaient Alexa 488 de farine pour la tyrosine hydroxylase et Alexa farine 594 pour CD31 dilué à 01:50 dans du PBST.
  5. Laver les anticorps secondaires avec un tampon PBST à 37 ° C le jour 7 sur un agitateur.
  6. Transvaser le tissu dans l’indice de réfraction solution correspondant pour l’homogénéisation de l’indice de réfraction le jour 8. Mettre le tissu sur un papier par un quadrillage pour vérifier sa clarté visuelle en vérifiant si le quadrillage peut être vu. Une fois que le tissu a été totalement clarifié, il peut être photographiée.
  7. Faire un cylindre de mastic qui pourrait juste entoure le tissu, puis façonner en forme de fer à cheval et appuyez sur l’arête extérieure étroitement sur une lame de verre afin de rendre un espace fermé. La hauteur de la pâte doit être un peu plus grande que l’ovaire.
  8. Placez l’ovaire clarifié délicatement dans le centre de la pâte et ajouter l’indice de réfraction correspondant solution. Placez un plat de fond en verre sur le mastic étroitement et utiliser du mastic pour fixer la parabole.

3. confocal Microscopy

  1. Pour l’imagerie avec un microscope confocal, dans le panneau « Ni-E » choisir la lentille (dans ce cas l’immersion en eau 25 X porte-objectif, 1,1-NA, 2 mm-WD) avec la distance de travail appropriée (dans ce cas 2,0 mm).
  2. Dans le panneau « Acquisition », sélectionnez le nombre de canaux. Ici, utiliser trois canaux.
    1. Tout d’abord, utilisez l’onglet « port de l’oeil » et le joystick du contrôleur XY pour déplacer le tissu jusqu’au centre du champ en vérifiant dans les oculaires de microscope.
    2. Après avoir éteint la lumière de l’obturateur, cliquez sur l’onglet « en direct » pour régler la « puissance de laser », « HV (Gain) », et « offset "pour chaque canal séparément. La cheftaine laser et HV peut conduire à des signaux plus élevés, et décalage supérieur peut réduire le bruit de fond.
    3. Sélectionnez la taille appropriée « Scan » et « Count ». Utilisez une taille de numérisation de 1024 x 1024 µm2 et comte de 4 à 8.
  3. Après avoir défini la qualité de l’image pour définir la profondeur du tissu dans le panneau « Correction d’intensité Z » et après la localisation de la lentille sur la première couche de l’ovaire (au centre du tissu) et en ajustant l’acquisition pour la couche supérieure, cliquez sur « plus » bouton pour définir la couche supérieure.
    1. Déplacer la lentille vers le bas et régler l’HV appropriée et la puissance du laser pour le bas du tissu et ajouter les informations de calque le plus bas dans le tableau de correction de Z-intensité. Cliquez sur « À ND » pour synchroniser le réglage avec le panneau « Acquisition de ND ».
  4. Dans le « acquisition de la ND » panneau, première série, le nombre de balayage les étapes. Ensuite, cochez les onglets « Z » et « Agrandir ».
    1. Ouvrez la fenêtre « Image grand Scan » pour définir la taille du champ selon la bordure du tissu à l’aide de la visualisation des tissus dans les oculaires. Retour au panneau « Acquisition de ND » pour saisir la taille de la zone de numérisation (« champs ») et choisissez le chevauchement entre 10 % et 15 %.
    2. Cliquez sur « Run Z correction », pas « exécuter maintenant », pour automatiquement mis de l’HV, puissance du laser et décalage approprié pour chaque couche et attendez que l’image à traiter.

4. 3D Reconstruction des follicules individuels et leurs Vasculatures

  1. Tout d’abord, utilisez ImageJ5 pour ouvrir le fichier original de NIS. Cliquez sur le bouton « Image » et choisir la « couleur » et les « chaînes de Split ». Ensuite, cliquez sur « File » et enregistrer séparément les canaux série de fichiers tiff en utilisant l’option de « Séquences d’images » dans « Enregistrer sous ».
  2. Imaris permet d’ouvrir une des séries de fichiers tiff. Cliquez sur le bouton « Modifier » et choisissez « Ajouter les canaux » pour ajouter le reste des canaux. Le nom et la couleur du canal peuvent être modifiés dans les onglets « Réglage de l’affichage ». L’épaisseur du tissu peut doivent être corrigées dans le panneau « Propriétés d’Image » dans le menu déroulant sous « Modifier ».
  3. Pour le recadrage 3D des images finales et enlèvement de pièces excédentaires, cliquez sur le bouton « Modifier » et choisissez « Crop 3D ». La taille du champ peut être ajustée en faisant glisser la bordure.
  4. Pour reconstruire les signaux de navire avec l’algorithme de Filaments dans le panneau de Surpass, cliquez sur le bouton « Filaments » pour créer un nouveau Filament et cliquez sur suivant.
    1. Afin de définir le plus grand et le plus mince diamètre, allez dans le panneau « Tranche » et trouver le bateau de traçage. La distance s’affichera automatiquement sur le panneau de « Mesure » en choisissant deux points à la largeur maximale du bateau.
    2. Retourner au panneau « Surpass » et entrez la largeur mesurée et cliquez sur suivant.
  5. Régler le seuil de point de départ et semences. Dans le panneau « Caméra », choisissez « Sélectionner ». Si certains des sphères automatiquement produites doivent être supprimées, appuyez sur Maj et cliquez sur le point. En choisissant « Naviguer » et en déplaçant la souris, la structure peut être tournée pour s’assurer que tous les points corrects ont été retenus et puis cliquez sur suivant.
  6. Choisir le seuil plus élevé pour le contraste local et cliquez sur suivant. Ne pas sélectionner « Détecter les épines » et continuer à achever la reconstruction de la bouteille de vaisseaux sanguins. La couleur peut être modifiée en cliquant sur l’onglet « Couleur ». Les données statistiques peuvent être extraites dans le panneau « Statistique » du Filament reconstitué. Des pièces excédentaires peuvent être retirés dans le panneau « Edit ».
    Remarque : Les autres algorithmes peuvent être utilisés pour mesurer le volume des follicules totales ou parois folliculaires. Dans le travail présenté ici, les ovocytes sont marquées par l’autofluorescence des deux anticorps secondaires. En raison de la grande quantité de données, un serveur de station de travail a été utilisé pour l’analyse des données.

5. analyse statistique

NOTE : Les données de l’analyse d’Image sont présentées comme moyen ± erreurs-types.

  1. Effectuer des comparaisons entre les follicules à l’aide de t-test d’échantillons indépendants et test de corrélation de Pearson permet de comparer les coefficients de corrélation de la paroi folliculaire et longueur capillaire. Définissez une valeur de P < 0,05 comme la limite pour une signification statistique.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons adapté la méthode passive de la clarté dans une méthode simple et rapide pour l’ovaire passive de compensation tout en préservant l’architecture folliculaire et vasculaire et obtenir le plus haut signal fluorescent de marqueurs marquées des vaisseaux et des follicules. L’architecture 3D du système vasculaire folliculaire a été déterminé par immunomarquage CD31, un marqueur des cellules endothéliales6. CD31 coloration dans les ovaires de souris adultes a ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans la présente étude, nous présentons afin d’évaluer les relations entre les capillaires et les follicules en croissance individuelles d’imagerie 3D. Dans nos travaux précédents, en utilisant le même protocole n° 9, nous avons étudié les rôles des gros vaisseaux, les interactions entre les follicules et l’emplacement des follicules dans les ovaires de souris intactes. L’approche passive de clarté nous a permis d’étudier les interrelations entre les corps jaunes et les follicules ainsi quant à re...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée par des subventions du Fonds spécial pour les chinois pour les post-doctorants (no 2014T70392 pour la fièvre jaune), la Fondation nationale de sciences naturelles de Chine (n ° 81673766 à la fièvre jaune), le nouveau fonds d’amorçage d’enseignant, la Fondation Zuoxue de l’Université de Fudan et le développement Projet de Shanghai Peak Disciplines-Integrative Medicine (20150407).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcrylamideVetecv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Flour 488 (dilution 1:50)  ;Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Flour 594 (dilution 1:50)Life TechnologiesA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
BisacrylamideAmresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
Plat à fond en verre à paroi noire (Willco-Dish)Ted Pella14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
Acide boriqueSinopharm Réactif10004818 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
Hydrogénophosphate disodique dodécahydraté (Na2HPO4 12H2O)Sinopharm Réactif10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
ParaformaldéhydeSinopharm Chemical Réactif80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31, molécule d’adhésion des cellules plaquettaires-endothéliales 1 (dilution 1:10)Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiateur VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
Azoture de sodiumSigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US
Chlorure de sodium (NaCl)Réactif chimique Sinopharm10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté (NaH2PO4 2H2O)Réactif chimique Sinopharm20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
Sodium dodecyl sulfateSinopharm Réactif chimique30166428 http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
Hydroxyde de sodium (NaOH)Réactif chimique Sinopharm10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
Triton X-100Sinopharm Réactifchimique 30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
Tyrosine hydroxylase (TH, dilution 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html
chimique chimique

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Reconstruction 3Dmicroscopie confocale multiphotoniquemarquage immunologique CD31capillaires folliculairesfixation par hydrogelclaircissement tissulaireanalyse d image

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