Synthèse des bactériophages infectieuses dans un e. coli -basé système d’Expression acellulaire

Résumé

Une nouvelle génération de plates-formes de transcription-traduction acellulaire a été conçue pour construire des systèmes biochimiques in vitro par le biais de l’exécution des circuits de gène. Dans cet article, nous décrivons comment bactériophages MS2, ΦΧ174 et T7, sont synthétisés à partir de leur génome en utilisant un système tous les e. coli acellulaire TXTL.

Résumé

Une nouvelle génération de systèmes de transcription-traduction acellulaire (TXTL), machinées pour avoir une plus grande polyvalence et modularité, fournir de nouvelles capacités pour effectuer des sciences fondamentales et appliquées dans les réactions de l’éprouvette. Ces dix dernières années, TXTL acellulaire est devenu une technique puissante pour un large éventail de biologie liés à quantitative et synthétiques de zones nouvelles recherches multidisciplinaires. Les nouvelles plateformes TXTL sont particulièrement utiles à construire et à interroger les systèmes biochimiques grâce à l’exécution des circuits d’un gène synthétique ou naturelle. In vitro TXTL s’avère pratique pour rapidement les éléments de régulation prototype et réseaux biologiques aussi bien quant à rappel moléculaire auto-assemblage mécanismes trouvent dans les systèmes vivants. Dans cet article, nous décrivons comment infectieuses bactériophages, tels que MS2 (ARN), ΦΧ174 (ssDNA) et T7 (dsDNA), sont entièrement synthétisée à partir de leur génome dans les réactions d’un pot en utilisant un toutes les Escherichia coli, système TXTL acellulaire. Synthèse des trois coliphages est quantifiée à l’aide de l’essai de plaque. Nous montrons comment le rendement du phage synthétisée dépend des paramètres biochimiques des réactions. Encombrement moléculaire, imité par une concentration contrôlée de PEG 8000, détermine la quantité de phages synthétisées par ordres de grandeur. On décrit aussi comment amplifier les phages et purifier leurs génomes. L’ensemble des protocoles et des résultats présentés dans ce travail devrait être d’intérêt pour les chercheurs multidisciplinaires en bio-ingénierie et biologie synthétique acellulaire.

Introduction

Ces dix dernières années, la technologie d’expression acellulaire a été conçue pour les nouvelles applications en biologie liés à synthétique et quantitative de recherche multidisciplinaire emergent zones d’adresse. Initialement utilisé pour exprimer les protéines indépendants d’un organisme vivant, TXTL acellulaire-nouveaux systèmes ont été développés pour les deux sciences fondamentales et appliquées^1,2, d’élargir considérablement la portée de cette technologie. La nouvelle génération de plates-formes TXTL a été conçue pour être facile à utiliser, plus efficace (atteignant 2 mg/mL de la synthèse protéique en....

Protocole

Remarque : les étapes suivantes de l’amplification et la méthode d’extraction sont largement généralisables pour nombreux phage ADN double-brin, par exemple, le bactériophage T7, phage entérobactéries T4 ou enterobacteria phage λ (L). Ils sont utilisés principalement pour un phage dont le génome n’est pas facilement disponible à l’achat de sources commerciales.

1. Amplification du phage

Remarque : la technique de production de phage (SPMC) single-plaque, plusieurs cycle est bien décrite pour le phage T4 Chen, et al. ¹⁴ la suivante amplification de phage et ADN méthode d....

Résultats

Nous montrons quatre résultats représentatifs. Dans la Figure 1, nous présentons un ensemble de contrôles négatifs pour s’assurer que le système TXTL acellulaire et les stocks de l’ADN du phage ne soient pas contaminées avec la vie cellules d’Escherichia coli . Nous vérifions que le système TXTL acellulaire est libre d’intact e. coli cellule contamination en ensemençant les deux une solution non incubés et couvés réaction nulle de l’ADN géno.......

Discussion

Selon la technique de Chen, et al. ¹⁴ pour SPMC, une étape essentielle est atteinte lorsqu’il détermine les conditions appropriées pour la surinfection. Le paramètre qui contrôle plus étroitement les capacité de souche hôte de résister à une surinfection est fréquemment la concentration initiale du phage infectant. Les cellules de l’hôte doivent être en phase de croissance logarithmique avant l’infection initiale avec une très petite quantité du phage. Finalement, le phage atteindra égale.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes d’ultracentrifugation	Beckman Coulter	344057
Tubes coniques	Falcon	352070
Gradient maker	BioComp Gradient Master	voir Anal Biochem. 1985 Jul ; 148(1) :254-9.
Seringue et canule émoussée	Monoject	8881513918 et 888202017
Pointes de pipette à large calibre	Fischerbrand	02-707-134
Compteur de plaques	New Brunswik	Scientific Colony Counter Modèle C-110
Tubes de culture	Fischerbrand	14-961-33
Système acellulaire	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp Gradient Master	BioComp Instruments	Modèle 105ME
Recette			25 g/L de milieu Luria-Bertani (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents, numéro de produit BP1426) et 15 g/L de Bacto-Agar solide (Brenton, Dickenson and Company - numéro de produit 214010).

de plaque de gélose LB