Enregistrement électrophysiologique de<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensilla Trichoid en Réponse aux Odorants de Faible Volatilité

Résumé

L'objectif global de ce protocole est de démontrer comment présenter des odorants de faible volatilité pour l'enregistrement à sens unique des neurones récepteurs olfactifs de Drosophila qui répondent aux phéromones cuticulaires à longue chaîne.

Résumé

Les insectes dépendent de leur odorat pour guider un large éventail de comportements essentiels à leur survie, tels que la recherche d'aliments, l'évitement des prédateurs, l'oviposition et l'accouplement. Une myriade de produits chimiques de volatilité variable ont été identifiés comme des odeurs naturelles qui activent les neurones des récepteurs olfactifs d'insectes (ORN). Cependant, l'étude des réponses olfactives aux odorants à faible volatilité a été entravée par une incapacité à présenter efficacement ces stimuli en utilisant des méthodes classiques d'administration d'odeurs. Ici, nous décrivons une procédure qui permet de présenter efficacement des odorants à faible volatilité pour l'enregistrement in vivo solo-sensillum (SSR). En minimisant la distance entre la source d'odeurs et le tissu cible, cette méthode permet l'application d'odorants biologiquement salants mais inaccessibles jusqu'à présent, y compris l'acide palmitoléique, une phéromone stimulante ayant un effet démontré sur les ORN impliqués dans la parade et le comportement d'accouplement ¹ .Notre procédure offre ainsi une nouvelle voie pour tester une foule d'odorants à faible volatilité pour l'étude de l'olfaction des insectes et de la communication de la phéromone.

Introduction

Les ORN de Drosophila répondent à un grand nombre d'odorants, avec des longueurs de chaîne de carbone très variées et une variété de groupes fonctionnels, y compris les esters, les alcools, les cétones, les lactones, les aldéhydes, les terpènes, les acides organiques, les amines, les composés soufrés, les hétérocycliques et les aromatiques ^{2 , 3} . Les odeurs variées dans leurs caractéristiques physicochimiques peuvent avoir des volatilités nettement différentes, indiquées par la pression de vapeur du composé. Notamment, les odeurs biologiquement pertinentes pour Drosophila melanogaster diffèrent énormément de leur volatilité. Par exemple, les ORN Ir92a répondent à l'ammoniac ⁴ , très volatil, avec une pression de vapeur de 6,432 mmHg à 20 ° C. En revanche, les ORN Or67d répondent à une phéromone masculine, l'acétate de cis -acétate de vaccin ( c VA) ^{5 , 6} , dont la pression de vapeur est de 43 mmHg à 20 ° C.

Ove_content "> L'étude de la réponse olfactive aux odorants de faible volatilité est particulièrement difficile avec les méthodes classiques d'administration d'odeurs, dans lesquelles des odorants sont délivrés par un flux d'air porteur sur une distance relativement longue ( c.-à-d. Plusieurs centimètres). En tant que tel, les réponses olfactives rapportées À un odorant donné à faible volatilité peut varier considérablement selon la conception du système de distribution d'odeurs. Par exemple, la réponse signalée des ORN Or67d à une dose élevée de c VA varie de ~ 40 ⁷ -> 200 pointes / s ⁶ . de plus, la fourniture inefficace des c VA avec les méthodes classiques d'administration est probablement attribuable à des résultats faussement négatifs, ce qui conduit à l'interprétation que c VA par elle - même pas suffisante pour activer Or67d Orns ^8. Cette interprétation a été contestée plus tard par une autre étude utilisant un Méthode de livraison de l'odeur proche de la gamme ^9. Il est donc imperaAfin de développer un système robuste d'administration d'odeurs pour la présentation efficace d'odorants de faible volatilité.

Récemment, nous avons identifié plusieurs acides gras cuticulaires à longue chaîne comme ligands pour Or47b ORN. Ils sont logés dans le Sensillum Trichoid Antenal de type 4 (at4). Parmi les odorants d'acides gras à longue chaîne, nous avons constaté que l'acide palmitoleique fonctionne comme une phéromone aphrodisiaque qui favorise la parade masculine en activant Or47b ORN ¹ . Cependant, dans une autre étude utilisant une méthode classique d'administration d'odeur, le laurate de méthyle a montré des réponses des ORN Or47b, alors que l'acide palmitoleique n'a suscité aucune réponse lorsqu'on a été présenté à la même distance ¹⁰ . Par rapport à c VA, les acides gras à longue chaîne sont encore moins volatils, avec des pressions de vapeur inférieures à 0,001 mmHg à 25 ° C ¹¹ . La faible volatilité inhérente aux odeurs d'acides gras à longue chaîne, qui empêche une présentation efficace à l'antenne viaLes systèmes conventionnels d'odeur-livraison, ont probablement représenté les résultats faussement négatifs ¹⁰ . Cette incohérence souligne l'insuffisance des systèmes classiques d'administration d'odeurs dans la présentation d'odorants à faible volatilité. On a précédemment montré que la livraison efficace des odeurs cuticulaires à la mouche nécessite une étroite proximité entre la source d'odeurs et le tissu cible ⁶ . Ainsi, pour caractériser pleinement les effets des phéromones biologiquement actives tout en imitant la distance dont elles sont probablement rencontrées par les mouches des fruits dans la nature ^{12 , 13} , nous avons convenu que la distance minimale doit être hautement prioritaire dans notre procédure.

Notre méthode présente d'autres avantages, y compris la compatibilité avec les plates-formes et les techniques d'électrophysiologie standard. Les configurations de plates-formes préexistantes nécessitent une modification minimale pour tenir compte de ce protocole, et la plupart des étapes de SSR ne nécessitent que des ajustements mineurs. CeRend notre technique facilement accessible aux chercheurs expérimentés en SSR. En outre, notre technique permet la présentation d'odorants à faible volatilité avec un déclenchement et un décalage brusques, en corrélant la délivrance de stimulus avec la réponse neuronale. Enfin, la disposition du matériel facilite les échanges rapides entre les cartouches odorantes, accélère la collecte des données sur une gamme de dosage souhaitée.

Nous commençons par examiner la préparation des électrodes de référence et d'enregistrement, la solution de l'hémolymphe pour adultes (AHL), les cartouches d'administration d'odorant et l'olfactomètre correspondant. Nous discutons ensuite de la préparation des solutions d'odorant d'acide palmitoleique, suivies de la préparation de la mouche pour l'enregistrement. Nous examinons les critères de sélection d'un sensillum trichoïde pour enregistrer et examinons de plus près le positionnement de la cartouche odorante avant de présenter les données représentatives obtenues selon cette méthode. Enfin, nous concluons en explorant des applications utiles de cette techniqueCertains problèmes rencontrés et leurs solutions.

Protocole

1. Préparation du matériel pour l'enregistrement at4

1. Utilisez un appareil extracteur à pipette pour préparer des électrodes avec des capillaires en verre aluminosilicaté (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Enlevez légèrement la pointe de l'électrode de référence avec une paire de pinces fines pour faciliter l'insertion dans le clypeus de la mouche ( c'est -à- dire une plaque arrondie à l'avant de la tête de mouche, au-dessus des embouchures).
   NOTE: Les hommes WT de 7 jours (Berlin) ont été utilisés dans cette étude. Utiliser la solution saline AHL ¹⁴ comme électrolyte pour les deux électrodes.
2. Préparer 1 litre de AHL en mélangeant 900 mL d'eau distillée avec 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO _3, 0,1120 g de NaH ₂ PO _4, 1,892 g de trehalose ּ 2 H ₂ O, 3,423 g de saccharose, 1,192 g de HEPES et 8,2 ml de MgCl _{2 1 M.} En utilisant de l'eau distillée, amener le volume total jusqu'à 1 L. Apportez le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 1 N et stérilisez la solution avec unSystème de filtre à vide. Pour un stockage à long terme, conservez les aliquotes AHL à 4 ° C.
   NOTE: Les livraisons cohérentes d'acide palmitoleique dépendent de l'uniformité entre les cartouches. Il est essentiel que chaque cartouche soit assemblée de manière reproductible.
3. À l'aide d'une lame de rasoir, retirez 0,9 cm de la pointe d'une pointe de pipette de 200 μL pour créer la première section de cartouche, mesurant 4,1 cm; Se référer aux dimensions détaillées dans la figure 1A . Utilisez une autre pointe de pipette de 200 μL et retirez 1,7 cm et 1,5 cm de la pointe et de la base, respectivement, pour créer la deuxième section de la cartouche, mesurant 1,8 cm ( figure 1A ). Utilisez une règle pour assurer la reproductibilité.
4. Utilisez un perforateur ⅛ "pour couper les disques du papier filtre.
5. Utilisez une pince pour placer un disque de papier filtre à l'extrémité de la seconde section de la cartouche. Confirmez visuellement qu'il y a une ouverture dans la pointe de la cartouche à travers laquelle l'air peut passer.
6. Fixez les première et seconde sections de cartouche ensemble, comme le montre la figure 1A . Angle de la deuxième section de la cartouche vers le bas pour faciliter le pointage carré en vue de la préparation ( Figure 1B ).
7. Connectez la cartouche avec le tube d'injection d'odeur, qui est monté sur un micromanipulateur.
   REMARQUE: cette conception permet de faire pivoter la cartouche vers l'extérieur pour faciliter l'échange ( figure 1C ).
8. Réglez le flux d'air humidifié constant à 2 L / min dans un contrôleur de masse et le flux d'odorant à 500 mL / min dans un autre contrôleur de masse.
9. En utilisant le logiciel (voir la table des matières ), programmez la procédure pour administrer une bouffée d'odeur de 500 ms.

2. Préparation des solutions d'odeur d'acide palmitoleique pour la livraison

NOTE: Or47b ORN répondent à l'acide cis -et trans- palmititoleique. Comme l'acide palmitoleique est instable à RT, les stocks sont stockés à -20 ° C et utilisés dans un mois à l'ouverture. L'éthanol est le solvant choisi pour l'acide palmitoléique.

1. Utilisez un mélangeur à vortex pour mélanger soigneusement 10 μL de stocks d'acide cis- ou trans- palmitoléique ou des dilutions avec 90 μL d'éthanol à 100% pour des dilutions en série à dix fois dans des microtubes de 1,7 ml. Préparer des dilutions d'acide palmitoleique fraîches quotidiennement avant les expériences et utiliser dans une journée.
   REMARQUE: pour les odeurs qui ne sont pas solubles dans l'éthanol, un flacon en verre est recommandé pour la préparation des dilutions d'odeurs avec d'autres types de solvants organiques.
2. En utilisant une micropipette P10, appliquer 5 μL de solutions d'acide cis- palmititoïques des dilutions souhaitées sur le papier filtre dans chaque cartouche correspondante.
   NOTE: Le dosage le plus élevé (10 ^-1 ) contient 450 μg du composé. Pour les solutions d'acide trans- palmititoleique, appliquez 4,5 μL à la place pour que la dose la plus élevée (10 ^-1 ) contienne également 450 μg de tIl a composé.
3. Pour évaporer complètement le solvant, placer les cartouches d'acide palmitoleique dans un dessiccateur sous vide pendant 1 h à la température ambiante et 7,59 mmHg de pression.
   REMARQUE: les cartouches peuvent être utilisées jusqu'à 4 h à la RT.

3. Préparation de la drosophile pour l'accès facile à l'at4 Sensilla pour les enregistrements électrophysiologiques In Vivo

NOTE: Les mouches WT (Berlin) sont élevées dans un milieu de farine de maïs standard à 25 ° C dans un cycle de lumière-obscurité 12:12. Lors de l'éclosion, les mouches sont séparées par sexe en groupes de dix, selon lesquelles ils sont hébergés en groupe jusqu'à 7 jours d'âge. Or47b Les ORN dans les mouches mâles et femelles répondent à l'acide palmitoléique. Pour simplifier, seules les mouches mâles sont examinées dans la présente étude.

1. Assembler une glissière de préparation de mouche: sur une glissière en verre, placez une lamelle de verre (18 x 18 mm ² ) sur une petite quantité d'argile de modélisation, formant un angle de ~ 3 ° avec la glissière en verre. Placez un ruban adhésif double face sur l'intérieurDge de la lamelle et sur la zone de la glissière immédiatement en dessous. Remplacez-le par un ruban frais pour chaque jour d'enregistrement ( Figure 2A ).
2. Utilisez un aspirateur à mouches ¹⁵ pour collecter la mouche d'intérêt dans le tube, puis ajoutez une pointe de pipette de 200 μL sur l'extrémité du tube. Appuyez simultanément sur le tube vers l'avant tout en soufflant de l'air dans le tube pour pousser la mouche jusqu'à la fin de la pointe de la pipette. Utilisez une lame de rasoir pour couper juste en dessous du corps de la mouche et 2 longueurs de tête au-dessus de la mouche.
3. Tamp le bas de la pointe de la pipette avec l'argile de modélisation, poussant la mouche vers le haut jusqu'à ce que les antennes et les clypeus soient exposés ( Figure 2B ). Pour éviter de tuer la mouche, ajoutez seulement suffisamment d'argile pour exposer les antennes et l'aristae, car cela empêche l'abdomen de la mouche d'être écrasé. En outre, ajouter de l'argile lentement et doucement pour éviter toute contraction soudaine. Confirmez que la mouche est en vie en vérifiant l'antenneOu le mouvement de proboscis.
4. Utilisez une pince pour manœuvrer la pointe de la pipette qui abrite la mouche. Orientez la tête de façon à ce que le clype se trouve à droite de l'observateur. Réglez la préparation le long de la lamelle à l'aide de pinces fines jusqu'à ce que le côté latéral de l'antenne soit placé contre la surface de lamelles scellées ( Figure 2B ).
5. Placez une tige de maintien sur l'arista pour fixer l'antenne sur le ruban double face pour éviter tout mouvement ( Figure 2B ).
   REMARQUE: La tige de retenue est tirée d'un capillaire en verre borosilicaté avec un extracteur de pipette et maintenue en position avec l'argile de modélisation ( Figure 2A ).
6. Placez la préparation sur la scène de la plate-forme ( Figure 2C ). À l'aide du microscope, confirmez que les trichoïdes sont visibles le long du bord latéral distal du troisième segment de l'antenne.
   REMARQUE: Idéalement, la sensilla devrait être nettement décalée en arrière-plan, ce qui simplifie leur Identification et facilite l'enregistrement ( Figure 3 ). Dans cette préparation, la majorité des sensillas trichoïques accessibles sont du type at4.
7. Maintenir la préparation sous un flux d'air humidifié constant (2 L / min) délivré via un tube d'alimentation d'air séparé d'une distance d'environ 2 cm de la préparation ( Figure 4 ), comme décrit précédemment ^{2 , 15} .

4. Enregistrement de l'activité at4 Sensillum à partir d'or47b ORN dans les Trichoids at4 en réponse à l'acide palmitoleique

1. Insérez l'électrode de référence dans le clypeus ( Figure 3A ). Pour éviter les dommages aux tissus, assurez-vous que l'électrode est insérée juste en dessous de la surface, où elle peut entrer en contact avec l'hémolymphe sous la cuticule, avec un mouvement rapide et lisse.
2. Abaissez l'électrode d'enregistrement lentement jusqu'à ce qu'elle entre dans le même plan de vue que le sensillum cible (= "Xfig"> Figure 3B). Enregistrez sous un objectif objectif 50X.
   NOTE: La cuticule tricoïdale dure nécessite l'insertion de l'électrode d'enregistrement dans la base sensible, dont la surface plus large fournit une cible plus grande qui réduit la probabilité que l'électrode soit déviée ( Figure 3B , insertion).
3. Avant d'appliquer des stimuli d'odeur à un sensillum, respecter les critères de sélection suivants; Tout échec de la trichoid ne répond pas à ces normes devrait être rejeté et un autre sensillum choisi à la place.
   1. Observez un rapport signal / bruit élevé (voir la Figure 3C pour un exemple).
   2. Observez les pointes identifiables des neurones at4A et at4C ( Figure 3C ).
      REMARQUE: Il est à noter que l'amplitude de l'amplitude at4B apparaît très semblable à at4A ¹⁰ et ne peut être identifiée facilement sans stimulation des odeurs.
   3. Observez que le taux de tir basal des neurones at4A estEnviron ou moins de 20 Hz.
      NOTE: Ce critère est spécifique pour at4A car le taux de tir basal pour le neurone est supérieur à celui des ORN basiques ² . Un tir basal beaucoup plus élevé indique que les neurones peuvent avoir été endommagés lors de l'insertion d'électrodes.
4. Connectez la cartouche au tube de distribution d'odorant. Commencez par le contrôle du solvant et ensuite les odorants, des concentrations faibles à élevées. Utilisez le micromanipulateur pour manoeuvrer la cartouche vers la préparation tout en orientant la cartouche directement à la tête de la préparation. Confirmez visuellement que la cartouche est directement dirigée vers l'antenne ( Figure 4 ) à quelques millimètres.
   REMARQUE: L'objectif est d'orienter l'ouverture de la cartouche directement sur l'antenne et de la positionner à proximité du tissu cible.
5. Assurez-vous que la cartouche odorante est séparée de l'électrode d'enregistrement sur sa droite de 1 à 2 mm et de la pré-P glisse en dessous d'environ 1 mm.
   REMARQUE: Dans la configuration décrite ici, la cartouche odorante est étroitement liée à l'électrode d'enregistrement, à l'électrode de référence et à la diaphane ( Figure 4 ).
   REMARQUE: Faites attention à la distance entre la cartouche et les électrodes d'enregistrement / référence. Une distance d'environ 4 mm est recommandée ¹ . Un contact involontaire peut mettre fin au signal et briser l'extrémité de l'électrode d'enregistrement, endommager le neurone actuel et compliquer d'autres enregistrements.
   REMARQUE: Considérez la distance séparant la cartouche et la diapositive à la mouche. Toucher le lamelle peut également déloger l'électrode d'enregistrement pour perturber l'enregistrement.
6. Appuyez sur "Enregistrer" dans le logiciel d'acquisition de données pour commencer l'enregistrement.
   REMARQUE: pour chaque enregistrement de 10 s, une seule impulsion d'odeur de 500 ms est livrée directement à l'antenne, comme décrit à l'étape 1.9.
7. Après une application odorante,Retirez soigneusement la cartouche avant de la remplacer par une cartouche de la concentration la plus élevée suivante. Continuez jusqu'à ce que la gamme de dosage soit obtenue.
   REMARQUE: Il est recommandé qu'un seul or47b ORN soit enregistré de chaque vol pour éviter tout effet possible de l'adaptation.
8. Rincer soigneusement l'électrode d'enregistrement avec de l'eau distillée après avoir fini l'enregistrement pour la journée.
9. Analyser et tracer les données à l'aide d'un logiciel d'analyse hors ligne disponible dans le commerce.

Résultats

Notre technique a été appliquée avec succès pour déterminer l'efficacité relative des isomères trans ( Figure 5A ) versus cis ( Figure 5B ) de l'acide palmitoleique. Nos données représentatives démontrent que l'acide trans- palmititoleique est un ligand plus efficace pour les ORN Or47b par rapport à l'isoforme cis ( figure 5C ). Un seul neurone a é...

Discussion

Ici, nous avons décrit une procédure par laquelle les réponses des ORS Or47b à l'acide palmitoleique peuvent être induites et enregistrées de manière robuste. Nous avons modifié une méthode conventionnelle de traitement des odeurs longue distance ^{2 , 7 , 10} pour dépanner le problème de l'apport insuffisant d'odorant à la phéromone. Nous avons abordé la question de la volatilité à faible teneur en odeur en fournissan...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Configuration de préparation & Matériaux divers
Pipette Puller Instrument  ;	Sutter Instruments Novato CA USA	P97	Extracteur de pipette
Capillaires en verre borosilicate	World Precision Instruments Sarasota FL USA	1B100F-4	pour fabriquer des tiges de maintien Capillaires
verre aluminosilicate  ;	Sutter Instruments Novato CA USA	AF100-64-10	pour la fabrication d’électrodes
Lames de microscope Superfrost Fisher	Scientific Pittsburgh PA USA	12-550-143	pour station de préparation des mouches
Ruban adhésif double face permanent	Scotch St. Paul MN USA	NA	pour station de préparation des mouches
Microscope droit	Olympus Shinjuku Tokyo Japon	BX51	pour l’appareil d’enregistrement
Plastalina Pâte à modeler	Van Aken North Charleston SC États-Unis	B0019QZMQQ	pour la station de préparation et pour stabiliser la tige de maintien
Unité de filtre jetable stérile à débit rapide avec membrane SFCA, 0,45 mm	Nalgene Rochester NY USA#	156-4045	pour stériliser la solution AHL
Name	Company  ;   ;   ;	Numéro de catalogue	Comments
>Matériaux des cartouches	;   ;   ;
200 et micro ; L pointe de pipette  ;	VWR Radnor PA USA	53508-810	pour fabriquer des cartouches anti-odeurs et du papier filtre de préparation aux mouches
	Whatman Maidstone Kent UK	740-E	pour fabriquer des cartouches anti-odeurs  ;
Dessiccateur sous vide  ;	Cole-Parmer Vernon Hills IL USA	VX-06514-30	pour vaporiser l’éthanol solvant
Name	Company  ;   ;   ;	Numéro de catalogue<	strong>Comments
Odorant Materials	;   ;   ; Acide
cis-palmitoléique	Caïman Chemical Ann Arbor MI USA	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Or47b odorant
trans-palmitoléique	Cayman Chemical Ann Arbor MI USA	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Or47b odorisant
Ethanol	Spectrum Chemical MFG.  ; Nouveau-Brunswick NJ USA	E1028-500MLGL	pour diluer l’acide palmitoléique  ;
fort	forte  ;   ;   ;	Numéro de catalogue	Comments
>Matériel de configuration de la plate-forme	;   ;   ; Micromanipulateur à cartouche
odorisant	Siskiyou Grants Pass OR USA	MX130R	pour positionner l’olfactomètre
Flow Vision logiciel  ;	Alicat Tuscon AZ USA LOGICIEL	FLOWVISIONSC	pour contrôler le débit
Contrôleur de masse	Alicat Tuscon AZ USA	MC-2SLPM-D	pour contrôler le débit de l’air humidifié
Contrôleur de masse	Alicat Tuscon AZ USA	MC-500SCCM-D	pour contrôler le débit pour la stimulation des odeurs
Clampex	Molecular Devices Sunnyvale CA USA	Ver. 10.4	Logiciel d’acquisition de données
Tube de distribution d’air	Ace Glass Vineland NJ USA	8802-936  ;	pour fournir de l’air humidifié
Objectif 50X  ;	Olympus Shinjuku Tokyo Japon	LMPLFL50X	plate-forme d’enregistrement
Clampfit 10	Molecular Devices Sunnyvale CA USA	Ver. 10.4	logiciel pour l’analyse des pointes  ;
Igor Pro 6	WaveMetrics Lake Oswego OR USA	Ver. 6.37	logiciel pour l’analyse des données  ;
Moniteur audio	ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA	NPIEXB-AUDIS-08B	Signale auditivement les pics individuels
Amplificateur extracellulaire	ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA	NPIEXT-02F	pour augmenter l’amplitude des signaux électriques
Contrôleur de soupape	Warner Instruments  ;   ;   ;	VC-8	pour contrôler l’ouverture de la vanne pour la stimulation des odeurs
Électrode d’enregistrement Micromanipulateur	Sutter Instruments Novato CA USA	MP-285	pour positionner l’électrode d’enregistrement
Headstage Amplificateur	ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA	EQ-16.0008	pour augmenter l’amplitude des signaux électriques
Oscilloscope	Tektronix Beaverton OU ÉTATS-UNIS	TDS2000C	Rapport visuel des pics individuels

en acide