Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

Résumé

Un protocole de dépistage efficace est présenté pour l’identification de petites molécules qui favorisent la différenciation astroglials dans les cellules souches glioblastome (CSS). L’analyse est basée sur un journaliste de différenciation de cellules souches selon laquelle l’expression de la GFP améliorée (eGFP) est entraînée par le promoteur GFAP humain.

Résumé

Glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primaire plus meurtrières et les plus courants chez les adultes, causant environ 14 000 décès chaque année aux États-Unis seulement. Durée médiane de survie après le diagnostic est inférieure à 15 mois avec une chimiothérapie témozolomide, rayonnement et résection chirurgicale maximale. Les défis inhérents à développer des traitements plus efficaces de GBM sont devenus de plus en plus clairs et incluent son effraction inflexible, sa résistance aux traitements standard, sa complexité génétique et moléculaire adaptabilité et sous-populations de GBM cellules avec similitudes phénotypiques des cellules souches normales, ci-après désigné comme des cellules souches glioblastome (CSS). Parce que les CSS sont requises pour la progression et la croissance tumorale, la thérapie axée sur la différenciation représente une modalité de traitement viable pour ces tumeurs incurables.

Le protocole suivant décrit une collection de procédures visant à établir un criblage à haute plateforme visant à l’identification de petites molécules qui favorisent la différenciation astroglials GSC. Au cœur du système est une protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) différenciation journaliste-construction. Le protocole contient les procédures générales suivantes : (1) établir des lignes de GSC différenciation journaliste ; (2) essais/validation de la pertinence du reporter à la capacité d’auto-renouvellement/clonogéniques GSC ; et (3) haute capacité-cytométrie de dépistage des drogues.

La plateforme de criblage fournit une approche simple et peu coûteuse pour identifier des petites molécules qui favorisent la différenciation des CGV. De plus, l’utilisation des bibliothèques de médicaments approuvés par la FDA détient le potentiel pour l’identification d’agents qui peuvent être réutilisés plus rapidement. Aussi, les thérapies qui favorisent la différenciation des cellules souches du cancer sont censés agissent en synergie avec les traitements actuels de « norme de diligence » qui auraient dû être divulgués afin de cibler et éliminer principalement plus de cellules différenciées du cancer.

Introduction

Des études récentes ont montré que les tumeurs contiennent une petite population de cellules, appelées les cellules souches du cancer (CSC) ou les cellules tumorales qui lance, qui sont responsables de la progression tumorale, métastase et résistance aux traitements chimio - et radio ^{1, 2}. la présence de cellules souches cancéreuses et leurs progénitures plus différenciées au sein de tumeurs est considéré comme un facteur important favorisant l’hétérogénéité intratumorale et représente donc un obstacle majeur dans le traitement de cancers³. Hiérarchie de cellule de tumeur, fournie par la théorie des cellules souches du cancer, a inspiré l’élaboration de nouvelles stratégies pour traiter les cancers ⁴. Une approche pour cibler les cellules souches cancéreuses consiste à identifier et à inhiber les voies de signalisation qui sont connus pour être requis pendant le développement embryonnaire de l’organe atteint. En effet, nous et autres avons déjà publié plusieurs documents décrivant le besoin continu de cellules souches-pertinentes signalisation voies neurales Sonic Hedgehog et l’encoche dans le glioblastome^5,6,7. Ce travail a contribué à solidifier la raison d’être de plusieurs essais cliniques de GBM. Une deuxième approche pour cibler les cellules souches cancéreuses est de promouvoir leur différenciation. Cette approche a reçu beaucoup d’aide en raison des résultats favorables des études précliniques et cliniques dans le traitement de la leucémie aiguë promyélocytaire avec acides rétinoïque (ATRA, un analogue de la vitamine A). Ici ATRA a été trouvé pour retirer le bloc de maturation et favoriser le cancer de la différenciation cellulaire⁸. Plus récemment, Piccirillo et ses collègues ont démontré avec élégance que BMP-4 favorise la différenciation GSC dans les astrocytes avec anti-MBG importants effets in vitro et in vivo⁹.

La justification de cette étude est basée sur une approche de « l’ingénierie inversée » afin de cibler les CGV. Compte tenu de la grande hétérogénéité présente dans GBM et avec mauvaise différenciation étant l’une des principales caractéristiques du cancer, nous avons demandé si nous pourrions promouvoir un phénotype plus favorable - différenciation dans un état semblable au astrocyte. Ici, nous n’avons pas de connaissance préalable des voies de signalisation qui maintiennent des CSS dans un échantillon donné de tumeur mais plutôt pour objectif d’obtenir un phénotype souhaité (par exemple les positivité GFAP).

Ce rapport décrit les procédures utilisées pour établir la GSC différenciation journaliste-lignes de la transduction des cultures GSC-enrichi à la sélection clonale de GSC. Les glioblastome Neurosphère lignes utilisées ont été créés au laboratoire du professeur Angelo Vescovi provenant de patients avec un diagnostic de glioblastome primaire à l’hôpital San Raffaele - Milano, Italie. Ces lignes ont été largement étudiées dans plusieurs publications ^{6,10,11,12,13,14}. Il est fortement recommandé que les personnes qui s’intéressent à la mise en œuvre de ces techniques dans leur laboratoire juger de la pertinence du reporter à capacité d’auto-renouvellement de cellules souches du cancer dans les cellules qu’ils envisagent d’étudier (Ceci est vrai pour n’importe quel journaliste). Un protocole détaillé pour l’un des essais clonogéniques in vitro acceptés dans le domaine est fourni pour accomplir ce^15,16. Enfin, un protocole détaillé décrivant l’utilisation des lignes journaliste différenciation dans un dépistage de drogues de cytométrie en flux-basée est fourni à la fin. De note, de même pour le système de différenciation astroglials décrit ici, nous avons avec succès établi et validé des lignes de journaliste de GSC intégrant un journaliste (différenciation neuronale) de MAP2:GFP. Par conséquent, les méthodologies de décrivent dans ce papier peut être appliquée à l’étude de la différenciation cellulaire dans diverses lignées cellulaires.

Certains chiffres dans ce rapport se trouve dans une publication récente : « bésylate d’Atracurium et autres agents bloquants neuromusculaires promouvoir la différenciation astroglials et appauvrissent glioblastoma cellules souches¹⁸.

Protocole

Remarque : Astroglials et systèmes de journaliste lentivirus neuronale ont été achetés sous forme de préparations des gènes pré-emballés, concentré. Connaissance de base de la technique de cytométrie en flux est nécessaire. Aussi, pour une pleine utilisation du présent protocole l’utilisateur doit accéder à un cytomètre de flux avec une capacité de haut débit (accepte les plaques à 96 puits comme source de l’échantillon).

1. des gènes système transcriptionnelle

Remarque : Dans toutes les analyses de cytométrie en flux, utilisez cellules parentales, non-transduites, ou vecteur-transduites (non fluorescent) cellules permettant d’établir la fluorescence de la ligne de base. Notez également que, dans toutes les étapes où trituration mécanique s’impose, Soyez doux. Trituration sévère peut tuer un nombre significatif des CSS fragiles et influencer les résultats de cytométrie de flux.

1. Plaque de 1 x 10⁶ cellules dans 2 mL de milieu de culture complet cellules souches neurales dans une plaque multiwell-6.
2. Transduce cellules en ajoutant journaliste lentivirus à une multiplicité d’infection (moi) égale à 5.
3. Ajouter 2 µL de polybrene pour une concentration finale de 8 µg/mL.
4. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant la nuit.
5. Le lendemain, remplacer le milieu de croissance pour supprimer les virus non lié. Replacez la plaque dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂ et incuber pendant 24 h.
6. Récolte de 0,5 mL du volume total ; faire tourner les cellules à 360 x g pendant 5 min à température ambiante dans un tube conique de 15 mL et éliminer le surnageant par aspiration. Ajouter 0,5 mL de milieu de croissance fraîche cellules souches neurales pour les cellules restantes et remettez la plaque dans l’incubateur pour la poursuite de l’expansion.
7. Ajouter 200 µL de réactif de dissociation et incuber pendant 5 min à 37 ° C.
8. Dissocier les cellules en doucement pipetage de haut en bas.
   NOTE : Trituration dure peut entraîner la mort significative de CSS, dissociation complète est habituellement obtenue après 20 - 30 fois.
9. Pour minimiser la fixation des cellules ou agrégation, ajoutez 800 µL de Hank Balanced Salt Solution (HBSS) pour un volume final de 1 mL.
10. Transférer 200 µL de chaque suspension de cellules à un puits d’une plaque multiwell-96.
11. Pour cette procédure, utilisez un cytomètre de benchtop avec capacité de plaque à 96 puits équipé d’un laser bleu pour l’excitation et la capacité de détecter la protéine fluorescente verte. Effectuer des analyse en cytométrie en flux au moins 10 000 cellules viables pour chaque acquisition.
12. Déterminer le pourcentage de cellules positives à GFP par cytométrie en flux.

2. subclone sélection, Expansion et Validation

1. Cellules de plaque dans 100 µL de milieu de cellules souches neurales à une densité de 0,7 cellules / puits d’une plaque multiwell-96.
2. La culture des clones pendant 11 jours à 37 ° C et 5 % de CO₂. Cette étape est fortement dépendante de type de cellule et nécessitera probablement une adaptation basée sur la lignée cellulaire utilisée. En règle générale, une sphère de diamètre ≥ 100 µm est une bonne indication de la présence de clonogéniques CSS dans le neurospheres.
3. À l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un filtre FITC, marquer les puits qui contiennent un seul Neurosphère où ~ 1 à 5 % des cellules est séropositifs au GFP.
   NOTE : Déterminer que le pourcentage exact de cellules positives GFP n’est pas trop critique à ce stade. Chacun des sous-clones évaluera plus tard par cytométrie en flux. Cette étape est effectuée afin de réduire le total nombre de clones à analyser en mettant l’accent sur les neurospheres qui proviennent d’indifférencié, GFAP-négatif, GSC.
4. Développez clones sélectionnés reporter jusqu'à ce qu’il y a un nombre suffisant de cellules pour l’analyse par cytométrie en flux. Un Sub confluent puits d’une plaque de 6-multiwell contenant ≤ 1.5x10⁵ cellules/mL devrait fournir un nombre suffisant de cellules.
   Remarque : Une procédure détaillée pour l’isolement et l’expansion de la CSS est disponible ¹⁷.

3. détermination de l’Expression GFAP:GFP par cytométrie en flux

1. Récolter une partie aliquote de cellules (0,5 mL) chaque clone de journaliste et de non-transduites témoins pour déterminer le pourcentage exact de cellules positives GFP. Compte tenu des clones de journaliste qui contiennent des cellules positives GFP ~ 1-5 %.
2. Tourner les cellules à 360 x g pendant 5 min à température ambiante et éliminer le surnageant par aspiration.
3. Ajouter 200 µL de réactif de dissociation cellulaire à chaque boulette et incuber les tubes dans un bain d’eau réglé à 37 ° C.
4. Triturer les cellules doucement afin d’obtenir une suspension monocellulaire (généralement entre 20 à 30 fois).
5. Pour minimiser la fixation des cellules ou agrégation, ajouter 800 µL HBSS dans un volume final de 1 mL.
6. Transférer 200 µL / puits d’une plaque de 96-multiwell de chaque suspension de cellules.
7. Pour cette procédure, utilisez un cytomètre de benchtop avec capacité de plaque à 96 puits. Effectuer des analyse en cytométrie en flux au moins 10 000 cellules viables pour chaque acquisition.

4. ELDA autorenouvellement test pour évaluer la capacité clonogéniques

Remarque : Pour les contrôles, parentales, non-transduites, tant que GFP-expression cellules transduites-lentivirus, devraient servir à déterminer le potentiel clonogénique relative des lignes journaliste GSC différenciation des cultures de GSC original d'où ils ont été dérivé.

1. Dissocier la différenciation-journaliste sous-clones dans des suspensions de cellules individuelles comme décrit ci-dessus.
2. Cellules de plaque plaques 96-multiwell dans 100 µL de milieux de croissance complète les cellules souches neurales au densité comprise entre 5 et 500 cellules / puits.
3. Incuber les cellules pendant 9 à 11 jours à 37 ° C et 5 % de CO₂.
4. Marquer des puits positifs en visualisation directe des neurospheres sous un microscope optique. Un puits doit considérer comme « positif » s’il contient au moins un seul Neurosphère grand.
5. Branchez les données : total des puits analysés et le nombre de puits positifs à l’aide de l’interface en ligne de ELDA disponible à http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5. médicaments bibliothèque Dilution préparation

1. Enlever les plaques de la bibliothèque de stockage à-80 ° C, couvrir avec du papier aluminium (protéger les composés sensibles à la lumière). Décongeler pendant environ 30 min à une heure à température ambiante.
2. Utiliser une pipette multicanaux à 12 canaux pour diluer les composés de bibliothèque à 0,2 mM dans un milieu complet cellules souches neurales. Diluer le DMSO à 10 % dans le milieu
   Remarque : La concentration finale de DMSO doit être 0,1 % lorsqu’il est ajouté aux cellules. La toxicité peut entraîner une concentration plus élevée de DMSO dans la culture. Pour cette raison, il est recommandé de tester la sensibilité de DMSO dans la lignée cellulaire utilisée, avant le traitement.
3. Utilisez le DMSO comme excipient pour traiter les cellules qui que se trouvent dans les colonnes de gauche et à droite de chaque assiette (colonnes 1 et 12 ; Wells A à H).
4. Recouvrir les plaques de bibliothèque dilué avec du papier aluminium et retour des planches originales de la bibliothèque au congélateur-80 ° C pour le stockage à long terme.

6. drug Screen

Remarque : Les cellules traitées DMSO devraient servir pour régler bloquant la fluorescence de la ligne de base.

1. Plaque 5 x 10³ cellules dans une plaque multiwell-96 à 99 µL de milieu de culture complet cellules souches neurales.
2. À l’aide d’une pipette multicanaux à 12 canaux, traiter les cellules avec des composés de bibliothèque dilué à une concentration finale de 2 µM (1 µL de drogue de 0,2 mM à 99 µL de suspension cellulaire) ou avec le DMSO (contrôle). Incuber les boîtes pendant 72 h à 37 ° C et 5 % de CO₂.
3. À l’aide d’une pipette multicanaux à 12 canaux ajouter 150 µL de réactif de dissociation cellulaire dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C.
4. Dissocier les cellules en trituration doucement avec une pipette multicanaux à 12 canaux, jusqu'à ce que la suspension monocellulaire est atteint (généralement entre 20 à 30 fois). La quantité de temps nécessaire de dissocier complètement les neurospheres variera entre lignes de GSC. Alors que le réactif de dissociation cellulaire recommandée (voir documentation) est sans danger et incubation jusqu'à 45 minutes n’avait aucun effet sur la viabilité de plusieurs souches de GSC, vérifier pour chaque ligne de GSC qui serviront au dépistage.
   Remarque : Le volume final de chaque bien doit être à peu près 250 µL (100 µL de la suspension cellulaire + 150 µL de réactif de dissociation cellulaire).
5. Déterminer le pourcentage de cellules exprimant le journaliste GFAP:GFP par cytométrie en flux. Utilisez la stratégie de blocage standard. Tout d’abord, tracer des éparpillements avant et latéraux pour avoir une idée générale de la taille des cellules et la viabilité. Puis placez un portail sur la population viable de cellules individuelles. Il s’agit de la population pour laquelle la fluorescence verte (eGFP) sera déterminée. Tout composé qu’entraîne une augmentation du pourcentage de GFP-positifs cellules par plus de trois écarts-types pour le contrôle (DMSO-traitée) est considérée comme positive « hit ». Ce seuil doit être ajusté selon l’application spécifique et la rigueur voulue.
   Remarque : Pour le haut débit écran est recommandé à l’aide d’un simple sous-clone de journaliste de GSC. Après le succès d’identification, chaque coup doit être validé contre sous-clones journaliste supplémentaires de la même ligne de GSC. Pour accroître la confiance pour vrais hits est également recommander essais composés contre le journaliste sous-clones isolées de différents GSC neurospheres lignes.

Résultats

Trois lignes indépendantes neurospheres dérivé de patient étaient transduites avec le journaliste astroglials de lentivirus codant pour un protéine fluorescente verte (GFP) fondue dans le cadre avec une cassette de résistance Zeocin et entraînés par l’élément humain du promoteur GFAP ( Figure 1). Prochaines clones individuels ont été isolés par l’ensemencement de 0,7 cellules / puits dans une plaque 96 puits (Figure 2), elle a ét...

Discussion

Alors que la plupart des études précédentes de CSS portés principalement sur les marqueurs qui définissent leur, dans cette étude, nous avons décidé d’adopter l’approche inverse. Nous nous concentrons principalement sur les descendances différenciées générés par CSS (par exemple, les cellules exprimant astroglials et marqueurs neurones). Nous démontrons l’utilisation d’un médicament à haut débit basés sur les cellules contrôle système, qui repose sur l’expression humaine GFAP promoteur dépendant de GFP. Toutes les expéri...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (solution saline équilibrée de Hank)	Sigma Aldrich	H6648
GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 ml réactif stérile jetable réservoirs	Corning	4870
6 puits	Thermo Fisher Scientific	130184
96 puits	Falcon	353072
Biolite T25 cm² ; Gourde ventilée	Thermo Fisher Scientific	130189
Biolite T75 cm² ; Flacon ventilé	Thermo Fisher Scientific	130190
15 ml Tubes à centrifuger	Celltreat	229411
1,5 ml Tubes à centrifuger	Fisher Scientific	05-408-129
Pipette multicanaux Ovation, 12 canaux, 0,5 - 20 uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Pipette multicanaux Ovation, 12 canaux, 5-250uL	VistaLab Technologies	1060-0250
Multi pointes de pipette 12 canaux 25 &mu ; l	VistaLab Technologies	4060-1002
Multi pointes de pipette 12 canaux 250 &mu ; l	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT Cytomètre en flux de paillasse	EMD Millipore	0500-4005
NIH Clinical Collections 1 et 2 banques de petites molécules	Evotec
Name	Company	Numéro de catalogue	>Comments
Pour la préparation de milieux de cellules souches neurales (500 mL)			Concentration finale
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0,20 %
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Héparine sel sodique	Sigma Aldrich	H3149	0,0002 %
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5,4 mM
Insuline-Transtransferrine-Sélénium (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14,5 mM
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
Progestérone	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
Putrescine	Sigma Aldrich	P5780	4.8 et micro ; M
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
Filtre à flacon, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Utiliser pour filtrer les médias