Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

Summary

Un protocole de dépistage efficace est présenté pour l’identification de petites molécules qui favorisent la différenciation astroglials dans les cellules souches glioblastome (CSS). L’analyse est basée sur un journaliste de différenciation de cellules souches selon laquelle l’expression de la GFP améliorée (eGFP) est entraînée par le promoteur GFAP humain.

Abstract

Glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primaire plus meurtrières et les plus courants chez les adultes, causant environ 14 000 décès chaque année aux États-Unis seulement. Durée médiane de survie après le diagnostic est inférieure à 15 mois avec une chimiothérapie témozolomide, rayonnement et résection chirurgicale maximale. Les défis inhérents à développer des traitements plus efficaces de GBM sont devenus de plus en plus clairs et incluent son effraction inflexible, sa résistance aux traitements standard, sa complexité génétique et moléculaire adaptabilité et sous-populations de GBM cellules avec similitudes phénotypiques des cellules souches normales, ci-après désigné comme des cellules souches glioblastome (CSS). Parce que les CSS sont requises pour la progression et la croissance tumorale, la thérapie axée sur la différenciation représente une modalité de traitement viable pour ces tumeurs incurables.

Le protocole suivant décrit une collection de procédures visant à établir un criblage à haute plateforme visant à l’identification de petites molécules qui favorisent la différenciation astroglials GSC. Au cœur du système est une protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) différenciation journaliste-construction. Le protocole contient les procédures générales suivantes : (1) établir des lignes de GSC différenciation journaliste ; (2) essais/validation de la pertinence du reporter à la capacité d’auto-renouvellement/clonogéniques GSC ; et (3) haute capacité-cytométrie de dépistage des drogues.

La plateforme de criblage fournit une approche simple et peu coûteuse pour identifier des petites molécules qui favorisent la différenciation des CGV. De plus, l’utilisation des bibliothèques de médicaments approuvés par la FDA détient le potentiel pour l’identification d’agents qui peuvent être réutilisés plus rapidement. Aussi, les thérapies qui favorisent la différenciation des cellules souches du cancer sont censés agissent en synergie avec les traitements actuels de « norme de diligence » qui auraient dû être divulgués afin de cibler et éliminer principalement plus de cellules différenciées du cancer.

Introduction

Des études récentes ont montré que les tumeurs contiennent une petite population de cellules, appelées les cellules souches du cancer (CSC) ou les cellules tumorales qui lance, qui sont responsables de la progression tumorale, métastase et résistance aux traitements chimio - et radio ^{1, 2}. la présence de cellules souches cancéreuses et leurs progénitures plus différenciées au sein de tumeurs est considéré comme un facteur important favorisant l’hétérogénéité intratumorale et représente donc un obstacle majeur dans le traitement de cancers³. Hiérarchie de cellule de tumeur, fournie par l....

Protocol

Remarque : Astroglials et systèmes de journaliste lentivirus neuronale ont été achetés sous forme de préparations des gènes pré-emballés, concentré. Connaissance de base de la technique de cytométrie en flux est nécessaire. Aussi, pour une pleine utilisation du présent protocole l’utilisateur doit accéder à un cytomètre de flux avec une capacité de haut débit (accepte les plaques à 96 puits comme source de l’échantillon).

1. des gènes système transcriptionnelle

Remarque : Dans toutes les analyses de cytométrie en flux, utilisez cellules parentales, non-transduites, ou vecteur-transduites (non fluorescent) cellules ....

Results

Trois lignes indépendantes neurospheres dérivé de patient étaient transduites avec le journaliste astroglials de lentivirus codant pour un protéine fluorescente verte (GFP) fondue dans le cadre avec une cassette de résistance Zeocin et entraînés par l’élément humain du promoteur GFAP ( Figure 1). Prochaines clones individuels ont été isolés par l’ensemencement de 0,7 cellules / puits dans une plaque 96 puits (Figure 2), elle a ét.......

Discussion

Alors que la plupart des études précédentes de CSS portés principalement sur les marqueurs qui définissent leur, dans cette étude, nous avons décidé d’adopter l’approche inverse. Nous nous concentrons principalement sur les descendances différenciées générés par CSS (par exemple, les cellules exprimant astroglials et marqueurs neurones). Nous démontrons l’utilisation d’un médicament à haut débit basés sur les cellules contrôle système, qui repose sur l’expression humaine GFAP promoteur dépendant de GFP. Toutes les expéri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ESGRO Complete Accutase	EMD Millipore	SF006
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS (solution saline équilibrée de Hank)	Sigma Aldrich	H6648
GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus)	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 ml réactif stérile jetable réservoirs	Corning	4870
6 puits	Thermo Fisher Scientific	130184
96 puits	Falcon	353072
Biolite T25 cm² ; Gourde ventilée	Thermo Fisher Scientific	130189
Biolite T75 cm² ; Flacon ventilé	Thermo Fisher Scientific	130190
15 ml Tubes à centrifuger	Celltreat	229411
1,5 ml Tubes à centrifuger	Fisher Scientific	05-408-129
Pipette multicanaux Ovation, 12 canaux, 0,5 - 20 uL	VistaLab Technologies	1060-0020
Pipette multicanaux Ovation, 12 canaux, 5-250uL	VistaLab Technologies	1060-0250
Multi pointes de pipette 12 canaux 25 &mu ; l	VistaLab Technologies	4060-1002
Multi pointes de pipette 12 canaux 250 &mu ; l	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT Cytomètre en flux de paillasse	EMD Millipore	0500-4005
NIH Clinical Collections 1 et 2 banques de petites molécules	Evotec
Name	Company	Numéro de catalogue	>Comments
Pour la préparation de milieux de cellules souches neurales (500 mL)			Concentration finale
BSA	GoldBio.com	A-421-250	0,20 %
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
Héparine sel sodique	Sigma Aldrich	H3149	0,0002 %
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5,4 mM
Insuline-Transtransferrine-Sélénium (ITS -G) (100X)	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14,5 mM
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) 100X	Gibco	15140-122	1X
Progestérone	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
Putrescine	Sigma Aldrich	P5780	4.8 et micro ; M
Basic FGF (FGF2), Human	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
EGF, Human	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
Filtre à flacon, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind	Corning	431160	Utiliser pour filtrer les médias