Cet article fournit une procédure détaillée sur la synthèse en phase solide, la purification et la caractérisation des dodecamères d'ARN modifiés à la position C2'- O . Les analyses photométriques UV-vis et dichroïstiques circulaires sont utilisées pour quantifier et caractériser les aspects structurels, c'est -à-dire les brins simples ou à double brin.
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Article de méthode
Protocole pour la synthèse en phase solide d'oligomères d'ARN contenant un 2'-
Dans cet article
Résumé
Résumé
La synthèse en phase solide a été utilisée pour obtenir des polymères canoniques et modifiés d'acides nucléiques, en particulier d'ADN ou d'ARN, ce qui en fait une méthodologie populaire pour des applications dans divers domaines et à des fins de recherche différentes. La procédure décrite ici se concentre sur la synthèse, la purification et la caractérisation des dodecamères de l'ARN 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' contenant zéro, une ou deux modifications situées à la position C2'- O . Les sondes sont basées sur des groupes 2-thiophénylméthyle, incorporés dans des nucléotides d'ARN par synthèse organique standard et introduits dans les oligonucléotides correspondants via leurs phosphoramidites respectifs. Ce rapport utilise la chimie de la phosphoramidite via les quatre nucléobases canoniques (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), ainsi que les nucléotides fonctionnalisés au 2-thiophénylméthyle modifiés au 2'- O- position; Cependant, la méthodologie est susceptible d'un grand varPlusieurs modifications qui ont été développées au cours des années. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un support de verre à pores contrôlés (CPG) suivi d'un clivage de la résine et de la déprotection dans des conditions standard, c'est -à- dire un mélange d'ammoniac et de méthylamine (AMA) suivi par du fluorure d'hydrogène / triéthylamine / N-méthylpyrrolidinone. Les oligonucleotides correspondants ont été purifiés par électrophorèse sur polyacrylamide (dénaturant 20%) suivie d' une élution, le dessalage, et l' isolement par Chromatographie en phase inverse (Sep-pak, C 18 -column). La quantification et les paramètres structurels ont été évalués par analyse photométrique par dichroïsme circulaire (CD-UV) vis-à-vis de l'ultraviolet (UV-vis) et respectivement. Ce rapport vise à servir de ressource et de guide pour les chercheurs débutants et experts intéressés à s'engager dans ce domaine. On s'attend à ce qu'il serve de travail en cours au fur et à mesure que de nouvelles technologies et méthodologies sont développées. La description des méthodologies et des techniques au sein deS document correspond à un synthétiseur ADN / ARN (remis à neuf et acheté en 2013) qui utilise la chimie de la phosphoramidite.
Introduction
La synthèse en phase solide pour obtenir des oligonucléotides d'ADN / ARN est un outil puissant qui a servi plusieurs applications dans différents domaines depuis les années 1970, 1 , 2 , 3 en utilisant des blocs de construction de phosphoramidite 4 . Parmi les exemples de sa large influence figurent: son impact sur l'étiquetage ( via les réactions de la chimie de clic) 5 , la sondage structurel 6 et les technologies antisens 7 , ainsi que son élucidation des méca....
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Protocole
1. Synthèse en phase solide d'oligonucléotides d'ARN
- Préparation de solutions contenant chaque phosphoramidite (tableau 1).
- Comptez le nombre de nucléotides et ajustez-vous dans l'équation n + 1 (où n = nombre de nucléotides) correspondant à chaque base et remplissez le tableau avec les valeurs manquantes. Volume = 0,15 ml par nucléotide à une concentration de 0,1 M, dissous dans de l'acétonitrile anhydre.
- Pesez chaque phosphoramidite dans des bouteilles ambrées de 10 ml (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD) et placez-les immédiatement sous vide à l'aide d'un déshydratant contenant un....
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Résultats
La synthèse de dodecamères d'ARN contenant zéro, une ou deux modifications de 2-thiophénylméthyle à la position C2'- O est décrite avec sa purification et sa caractérisation correspondantes. En outre, une description détaillée de l'analyse structurale réalisée via CD est incluse.
Les quatre brins d'ARN (y compris un brin avec une séquence complémentaire) ont été obtenus par synthèse en phase solide, qu.......
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Discussion
L'intention de ce manuscrit est de servir de guide aux chercheurs sur le terrain, débutant ou expert, pour réussir ou améliorer la synthèse d'oligonucléotides d'ADN ou d'ARN. La méthodologie décrite se concentre sur l'utilisation de la synthèse en phase solide en utilisant un synthétiseur d'ADN / ARN automatisé via une chimie standard de phosphoramidite. Le rapport décrit une description étape par étape de la synthèse, de la purification et de la caractérisation des dodecamères d'ARN. En outr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
La préparation de ce manuscrit a été soutenue par des fonds de démarrage de l'Université du Colorado Denver (JMRE). AF souhaite remercier un prix Research and Creative Activities (RaCAS, CU Denver). Le financement du Bureau des services de recherche, l'Université du Colorado Denver pour couvrir les frais de publication est reconnu. Nous aimerions remercier les membres de laboratoire Mme Cassandra Herbert et M. Yannick K. Dzowo pour leurs contributions dans la partie vidéo.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acétonitrile 99,9 %, HPLC Fisher | Scientific | 75-05-8 | |
| Acétonitrile 99,9 %, anhydre pour le séquençage de l’ADN | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+ % | ACROS Organics | 164850025 | |
| Chlorure d’ammonium 98+ % | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Citrate d’ammonium, dibasique 98 % | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Fluorure d’ammonium ; 98.0 %, grade ACS | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Hydroxyde d’ammonium 28 - 30 % dans l’eau, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Persulfate d’ammonium | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra haute pureté | ; Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pur | VWR-Amresco | 172 | |
| Acide borique | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Pyrocarbonate de diéthyle, 97 % | ACROS Organics | A0368487 | |
| Éthanol, anhydre, de qualité histologique | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Acide éthylènediamine tétraacétique, sel disodique déshydraté 100,2 % | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide ; | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Acide chlorhydrique, 36,5 - 38,0 %, certifié ACS | Plus Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté, 99 %Fisher | Scientific | 7786-30-3 | |
| Méthanol, 99,9 %, ; Qualité HPLC | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Méthylamine 40 % dans l’eau | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Méthyl-2-pyrrolidinone, hydrohydre, 99,5 % | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) ; | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Acétate de sodium, anhydre 99,2 %, Certifié ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Chlorure de sodium, 100,5 %, Certifié ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Phosphate de sodium monobasique dihydraté 99,0 % | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2',4' Triéthylamine, 99+ % | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Trihydrofluorure de triéthylamine, 98 | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Acide trifluoroacétique, 99 % | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6'-Trihydroxyacétophénone monohydraté 98 % | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urée | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Réactifs pour la synthèse de l’ARN : | |||
| Mélange débloquant, 3 % d’acide trichloracétique dans le dichlorométhane | Glen Research | ; 40-4140-57 | |
| Mélange de coiffes A, THF/pyridine/anhydride acétique | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Mélange de capsules B, 10 % de 1-méthylimidazole dans le THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activateur, 0,25 M 5-éthylthio-1H-tétrazole dans de l’acétonitrile anhydre | Glen Research | . 30-3140-52 | |
| Solution oxydante, 0,02 M d’iode dans du THF/Pyridine/Eau | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG ; | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite ; | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite ; | Recherche Glen | 10-3003-xx |
Références
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H.
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Réimpressions et autorisations
