Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Résumé

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Résumé

Au sein du système immunitaire inné, lymphocytes effecteurs natural killer (NK) cellules jouent un rôle essentiel dans la défense de l’hôte contre les cellules anormales, éliminant notamment tumoraux et virale des cellules infectées. Environ 30 anomalies monogéniques connus, ainsi qu’une foule d’autres pathologies, causent soit fonctionnelle ou classique carence cellulaire NK, se manifestant dans réduite ou absente une activité cytotoxique. Historiquement, la cytotoxicité a été étudiée avec les méthodes radioactives, qui sont encombrants, coûteux et potentiellement dangereux. Cet article décrit une méthode d’axée sur la cytométrie de flux rationalisé, cliniquement applicables afin de quantifier l’activité cytotoxique des cellules NK. Dans ce test, les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) ou des préparations de cellules NK purifiées sont conjointement incubées à différentes proportions avec une lignée de cellules tumorales de cible qui sont sensibles à la cytotoxicité des cellules NK (NKCC). Les cellules cibles sont préalablement étiquetées avec un colorant fluorescent pour permettre leur discrimination des cellules effectrices (cellules NK). Après la période d’incubation, les cellules cibles tués sont identifiés par une tache d’acide nucléique, qui imprègne spécifiquement les cellules mortes. Cette méthode se prête à la fois diagnostique et des applications de recherche et, grâce aux capacités multiparamétriques de la cytométrie en flux, a l’avantage supplémentaire de permettre éventuellement une analyse plus approfondie du phénotype des cellules NK et la fonction.

Introduction

Cellules tueuses naturelles de (NK) sont un sous-ensemble sophistiqué des lymphocytes humains d’innée critique impliqués dans l’élimination des cellules infectées virally, cellules transformées et autres menaces pathogènes ^1,2. Granules lytiques de cellules NK maison cytotoxiques protéines, comme la perforine et granzymes. Lors de leur activation, les cellules NK forment une interaction complexe avec leurs cibles appelées synapse immunologique, auquel cas ces molécules cytotoxiques sont localement libérés, ce qui entraîne la lyse des cellules cibles directes et l’apoptose, ainsi que de la libération de cytokin....

Protocole

Les échantillons ont été collectés conformément aux directives éthiques établies par le programme de protection de la recherche humaine de l’UCLA et approuvées par l’IRB.

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : Sauf indication contraire, tous les réactifs doivent être laissés s’équilibrer à température ambiante avant d’être utilisés. Tous les réactifs doivent rester stériles.

1. Préparez une solution de travail 2x de Tween-20 (c’est-à-dire 0,2 %) en ajoutant 10 μL de solution de Tween-20 à 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium à l’aide d’une pipette p20.

Résultats

Avant de configurer le dosage, il est fortement recommandé que la teneur en cellules NK s’évaluer selon la population de l’effecteur de choix. La figure 1 montre une coloration typique de CD56 avant (bleu clair) et après (rouge) enrichissement de cellules NK. Les cellules NK représentent jusqu'à 15 % de PBMC et doivent être au moins 80 % de pur après enrichissement.

Cytométrie en ce test consiste à .......

Discussion

La méthode décrite ici offre une alternative simple et rentable pour le test de libération traditionnel ⁵¹Cr pour évaluer l’activité cytotoxique des cellules NK. Cette méthode est sensible, reproductible et moins de temps que les méthodes standards précédents, comme l’arc et peut être utilisée à la fois clinique et les applications de recherche.

Alors que le test fonctionne avec les PBMC total et enrichi les cellules NK, la possibilité d’utiliser des PBMC sans avoir besoin de purifi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution saline tamponnée au phosphate (1x, sans Ca2+ et Mg2+)	Corning (Cellgro)	21-040-CM
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
Tween-20	Sigma	BP337-100
RPMI 1640 Média	Corning (Cellgro)	10-040-CV
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur	Omega Scientific	FB-02
Pénicilline Streptomycin	Life Technologies	15140-163	Solution mère à 10 000 U/mL
IL-2	R& D Systems	202-IL-050	Lyophilisé à partir d’un 0,2 &mu ; solution filtrée dans de l’acétonitrile et du TFA avec BSA comme protéine porteuse. Reconstituer avec 500 ul à 100 &mu ; g/mL dans de l’acide acétique stérile 100 mM contenant au moins 0,1 % d’albumine sérique bovine (2,1 x 10E6 UI/ml)
K562 Cellules	ATCC	CCL-243	Lignée cellulaire cancéreuse  ;
Fioles de culture cellulaire T-75	Corning	431464
CFSE kit de prolifération cellulaire	Life Technologies (CellTrace)	C34554	Reconstituer un flacon I avec 18 ul DMSO pour préparer une solution mère de 5 mM. Ne pas congeler/décongeler.
Sytox Red	Life Technologies	S34859	solution mère est fournie à 5 &mu ; M dans 1 mL de DMSO. La solution de DMSO peut être soumise à plusieurs cycles de congélation-décongélation sans dégradation du réactif.
Tubes de prélèvement sanguin d’héparine de sodium/lithium	BD	02-687-95
Plaque en U à 96 puits	Corning	CLS3897
Pipettes sérologiques	BD Falcon
Tubes en polystyrène à fond rond (5mL)	BD Falcon	14959-5
50 mL Tube conique en polypropylène	BD Falcon	352070
15 mL tube conique en polypropylène	BD Falcon	352097
Réservoir de réactifs	USA Scientific	2321-2230
Cocktail d’enrichissement des cellules NK humaines	StemCell Technologies (RosetteSep)	15065

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