Quantification de l’abondance et la recharge des niveaux d’ARN de transfert chez Escherichia coli

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour mesurer directement les ARN de transfert, chargement des niveaux purifiée Escherichia coli RNA, mais aussi un moyen de comparer les niveaux relatifs des ARN de transfert, ou tout autre ARN court, entre les différents échantillons basées sur l’ajout de l’épi cellules exprimant un gène de référence.

Résumé

ARN de transfert (ARNt) est un élément essentiel de la machinerie translationnelle dans n’importe quel organisme. ARNt se lie et transférer des acides aminés dans le ribosome de traduction. Les niveaux relatifs des différents ARNt et le ratio de tRNALeu ARNt au total ARNt, connu comme le niveau de charge, sont des facteurs importants dans la détermination de la précision et la vitesse de translation. Par conséquent, l’abondance et les niveaux de charge des ARNt sont des variables importantes pour mesurer lorsque l'on étudie la synthèse des protéines, par exemple dans diverses conditions de stress. Nous décrivons ici une méthode de récolte des ARNt et directement mesurer tant l’abondance relative et le niveau de charge absolu de certaines espèces de tRNA chez Escherichia coli. L’ARNt est récolté de manière que la liaison labile entre le Tarn et ses acides aminés est préservée. L’ARN est ensuite soumis à l’électrophorèse sur gel et Northern blot, qui se traduit par la séparation des ARNt chargées et non chargées. Les niveaux des ARNt spécifiques dans différents échantillons peuvent être comparés en raison de l’ajout du spike-dans les cellules pour la normalisation. Avant la purification du RNA, nous ajoutons 5 % des cellules d’Escherichia coli qui le rare de tRNA^selC à chaque échantillon de surproduction. Le montant de l’espèce de tRNA d’intérêt dans un échantillon est ensuite normalisé à la quantité de tRNA^selC dans le même échantillon. Ajout de spike-dans des cellules avant purification RNA a l’avantage sur l’ajout de purifiée spike-en ARN qui elle tient compte également des différences dans l’efficacité de la lyse des cellules entre les échantillons.

Introduction

Dans ce qui suit, nous présentons une méthode pour quantifier les ARNt spécifiques et mesurer leur charge niveaux par Northern blot. La méthode est basée sur une technique développée par verite et al. ¹. par récolte des cellules dans l’acide trichloracétique (TCA) et de garder les échantillons à 0 ° C tout au long de la purification de RNA, la liaison ester entre l’ARNt et l’acide aminé est conservé^2,3,4. ARNt tRNALeu peut distinguer de leurs homologues nonacylated par électrophorèse sur gel et le transfert de Northern, dû à une diminution de ....

Protocole

1. préparation des cultures bactériennes.

1. Grow toutes les cultures dans les flacons d’Erlenmeyer avec un rapport de volume/flacon de culture d’au plus 1/6. Dans une installation expérimentale de type, poussent les cultures à 37,0 ° C et en agitant à 160 tr/min en morpholinepropanesulfonic acide (MOPS) minimale moyenne ¹⁸ additionné de la source de carbone préféré, par exemple 0,2 % de glucose, pendant au moins 10 les générations successives avant la récolte de RNA.
2. La veille de la récolte de RNA, diluer une culture immature de la souche désirée dans un milieu minimal vadrouilles de telle manière qu’il atteindra le désiré O....

Résultats

Utiliser la procédure décrite ici, l’abondance et la recharge des niveaux de trois tARNs ont été mesurées chez e. coli K-12 avant et acides aminés.

NF915⁴ la souche auxotrophe de l’arginine (thr leu sa argH thi mtl supE44) a été cultivée depuis au moins dix générations dans un milieu minimal MOPS additionné de 0,4 % de glycérol, 50 µg/mL thréonine, leucine, arginine et histidine de 5 µg/.......

Discussion

Ce protocole décrit comment mesurer simultanément le niveau de charge spécifique e. coli ARNt et comparer les niveaux relatifs des ARNt dans différents échantillons. Les points critiques du protocole sont 1) pour manipuler les échantillons de telle sorte que les niveaux de charge ARNt cellulaire sont conservées, 2) pour normaliser les quantités de tRNA de telle sorte que les niveaux relatifs de tRNA dans différents échantillons peuvent être comparés avec fiabilité et 3) pour s’assurer de la sp arrangement des so.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Urée	Merck	57-13-6	Pureté >99 %
Polyacrylamide	Serva	79-06-7
Bis (N,N'-Méthylène-bis-acrylamide)	BIO-RAD	161-0201
Acide trichloracétique (TCA)	Sigma	76-03-9
Phénol	Merck	108-95-2
IPTG
Glucose
, acétate
, EDTA
, éthanol
tris,
acide
chlorhydrique, chlorure
NaH2PO4
Citrate
SDS
Hareng Sperme ADN	Sigma	100403-24-5
BSA
Polivinylpyrrolidone
Ficoll
P32 &gamma ; ATP	Perkin Elmer
Oligos d’ADN (sondes)	TAG Copenhagen
Hybond N+ membrane	GE Healthcare	RPN203B
Crosslinker
Electroblotter	BIO-RAD
Typhoon FLA 7000 Scanner	GE Healthcare	28955809
Spectrophotomètre
Four
Geiger-Mü ; Tube
Écran imageur au phosphore	GE Healthcare
Tube
Flacons de culture Tubes
de microcentrifugation de 1,5 ml Tubes
centrifuger de 20 ml Tubes
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Software
ImageQuant	GE Healthcare
Excel	Microsoft

de sodium, de sodium, de sodiumd’hydridisationllerd’hybridation à à centrifuger