Reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’ARN Double-brin sur ARN monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques

Summary

Nous rapportons les protocoles pour la synthèse et purification d’oligomères de Peptide Nucleic Acid (PNA) incorporant des résidus modifiée. Décrit les méthodes biochimiques et biophysiques pour la caractérisation de la reconnaissance des duplex de RNA par les mis à jour le PNAs.

Abstract

RNAs apparaissent comme biomarqueurs importants et cibles thérapeutiques. Ainsi, il y a beaucoup de potentiel dans le développement de sondes chimiques et thérapeutiques ligands pour la reconnaissance de la séquence d’ARN et de la structure. Chimiquement modifiées Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomères ont été récemment mis au point qui peut reconnaître duplex RNA d’une façon séquence-spécifique. PNAs sont chimiquement stables avec un squelette peptidique comme neutre. PNAs peuvent être synthétisés relativement facilement par la méthode de synthèse de peptide de phase solide Boc-chimie manuelle. PNAs sont purifiés par HPLC en phase inversée, suivie par la caractérisation de la masse moléculaire laser assistée par matrice désorption/ionisation-temps de vol (MALDI-TOF). Technique de (PAGE) l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturants facilite l’imagerie de la formation de triple, car soigneusement conçu gratuit RNA duplex construit et PNA lié triplex souvent voir la migration différents tarifs. PAGE non dénaturants avec coloration de post de bromure d’éthidium est souvent une technique simple et informative pour caractériser les affinités de liaison et les spécificités des oligomères PNA. En règle générale, les piques de RNA ou duplex avec une seule paire de bases des mutations multiples peut être utilisé pour caractériser les propriétés de liaison de PNA, comme liant les affinités et les spécificités. 2-Aminopurine est un isomère de l’adénine (6-aminopurine) ; l’intensité de fluorescence 2-aminopurine est sensible aux changements de l’environnement structurel local et est adaptée pour le suivi de la formation de triple avec les résidus de 2-aminopurine constituée près du site de liaison PNA. 2-Aminopurine titrage de fluorescence permet également de confirmer la sélectivité de liaison de mis à jour le PNAs vers ciblées ARN double brin (dsRNA) pendant ARN monocaténaire (ssRNAs). UV-absorbance-détecté des expériences de fusion thermiques permettent la mesure de la stabilité thermique des duplex PNA-RNA et PNA· Triplex de RNA de₂ . Ici, nous décrivons la synthèse et purification d’oligomères PNA incorporant résidus modifiée et décrivent des méthodes biochimiques et biophysiques pour la caractérisation de la reconnaissance des duplex de RNA par les mis à jour le PNAs.

Introduction

RNAs apparaissent comme biomarqueurs importants et cibles thérapeutiques, due aux avances récentes dans les découvertes des rôles de l’ARN dans la régulation et la catalyse de divers processus biologiques^1,2,3. Traditionnellement, les brins antisens ont été utilisés pour lier à ssRNAs par le biais de Watson-Crick formation duplex^{3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27}. récemment, triplex formant des acides nucléiques peptidiques (TFPNAs) ont été conçus pour lier à ARN doubles brins via Hoogsteen hydrogènes (Figure 1)^3,28,29. ARNdb régions sont présentes dans la plupart du RNAs traditionnel antisens ciblées, y compris le pré-ARNm ARNm, avant ou pri-miARN³et nombreux autres non-codage RNAs^1,26,27. Ciblage des ARN doubles brins par formation de triple hélice à l’aide de TFPNAs peut être avantageux, en raison de sa spécificité de la structure et est d’un grand potentiel pour servir à restaurer les fonctions normales de l’ARN, qui sont la dysrégulation dans les maladies, par exemple.

Le récent travail de Rozners et al.et nous^{3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41}, signalé les efforts sur l’amélioration la liaison sélective de mis à jour le TFPNAs vers ARN doubles brins avec une affinité accrue. Nous avons développé des méthodes de la synthèse des monomères PNA conçus rationnellement (Figure 2) y compris les thio-pseudoisocytosine (L) monomère³⁰ et cytosine de 5-méthyl guanidine modifiés (Q) monomère³¹. Par le biais de diverses méthodes de caractérisation biochimiques et biophysiques, nous avons démontré que PNAs relativement courtes (6-10 résidus) incorporant des résidus L et Q Voir la reconnaissance améliorée des paires Watson-Crick G-C et C-G, respectivement, en ARN doubles brins. En outre, comparées aux PNAs non modifiés, PNAs, contenant des résidus L et Q montrent liaison plus sélective vers dsRNA ARN à simple brin et ADN double brin. La fonctionnalité de guanidine⁴² dans la base de Q permet de PNAs d’entrer de cellules HeLa³¹.

Dans notre laboratoire, nous avons synthétiser PNAs par la Boc-chimie manuelle (Boc ou t- Boc est synonyme de tert-butyloxycarbony (voir Figure 2) synthèse de peptide de phase solide méthode⁴. La synthèse du monomère PNA avec Boc comme l’aminé groupe protecteur est pratique car le groupe Boc est stériquement moins encombrant par rapport à fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine protégeant le groupe, qui peut être bénéfique au cours de monomère PNA de couplage le support solide. Le groupe Boc est labiles et peut être facilement enlevé sur le support solide de 20 à 50 % d’acide trifluoroacétique (TFA) dans du dichlorométhane (DCM) lors de la synthèse de l’ANP. Un synthétiseur de peptide automatisé peut être utilisé pour synthétiser des oligomères PNA ; Cependant, 3 à 5 fois excès de monomère de la PNA est nécessaire pour un synthétiseur de peptide automatisé. Synthèse manuelle nécessite beaucoup moins monomère de la PNA (excès de 2 à 3 fois), avec chaque couplage facilement contrôlée par le Kaiser test⁴³. En outre, les nombreux synthétiseurs automatisés ne sont pas compatibles avec la synthèse de stratégie de Boc en raison de l’utilisation de TFA corrosif durant l’étape de suppression du Boc.

Les oligomères PNA peuvent être purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (CLHP-PI) à le suivie de caractérisation de la masse moléculaire par MALDI-TOF (Figures 3 et 4)^{30, 31}. nous employons PAGE non dénaturants pour suivre la formation de triple, dû au fait que duplex libre de RNA construit et le PNA lié triplex souvent voir la migration différents taux (Figure 5)^30,31 . Aucun étiquetage n’est nécessaire si efficace après coloration est possible pour les deux du RNA duplex et PNA· Bandes de triplex₂ RNA. Une quantité relativement petite de l’échantillon est nécessaire pour les non-dénaturisation PAGE expériences. Toutefois, les tampons de chargement (incubation) et les tampons en cours d’exécution (pH 8,3) peuvent être pas les mêmes, entraînant des mesures étant limités pour le triplex cinétiquement stable, car un pH relativement élevé de 8,3 peut-être considérablement déstabiliser un triplex.

2-Aminopurine est un isomère de l’adénine (6-aminopurine) ; l’intensité de fluorescence 2-aminopurine (avec un pic d’émission à environ 370 nm) est sensible aux changements de l’environnement structurel local et est adapté pour le suivi de la formation d’un triple avec le résidu de la 2-aminopurine constituée près de l’ANP contraignant () site La figure 6) ³¹. Contrairement à nombreux autres colorants qui montrent l’émission de fluorescence dans le domaine du visible, RNA 2-aminopurine-étiquetés peut être exposé à chambre lumineuse sans photo blanchiment. Contrairement à l’expérience de PAGE dans lequel un tampon en cours d’exécution du pH 8,3 est souvent nécessaire, 2-aminopurine basé fluorescence titrage permet la mesure de la liaison dans une solution à un pH spécifié et donc peut permettre la mesure et la détection de relativement faible et cinétiquement contraignant à l’équilibre instable.

UV-absorbance-détecté des expériences de fusion thermiques permettent la mesure de la stabilité thermique des duplex (Figure 7)³¹ et triPlex^30,32,44,45. Selon la longueur et la séquence de composition, la fonte des triplex peut ou peut ne pas montrer une transition claire. Les paramètres thermodynamiques peuvent être obtenus si les courbes de chauffage et de climatisation se chevauchent. Les paramètres thermodynamiques précises peuvent être obtenues en isotherme titration calorimétrique (ITC)³²; Cependant, des quantités relativement importantes d’échantillons sont généralement requises pour le CCI.

Protocol

1. Manuel phase solide Peptide synthèse de PNAs utilisant Boc chimie

Remarque : pour la réussite et la facilité de la synthèse d’oligomère PNA désirée, tous les solvants et réactifs doivent être anhydres. Ajouter les tamis moléculaires appropriées (4 a, pastilles de 1 à 2 mm de diamètre) et occasionnellement purge azote sec dans des bouteilles. Pour la synthèse des monomères PNA modifiés, des protocoles déclarés en références respectives de ^{30 , 31} peuvent être utilisés. Monomères PNA non modifiées peuvent être achetés auprès de sources commerciales. Dans chacune des étapes de lavage, la quantité appropriée de solvant est ajoutée à la résine, formant une boue, avant elle est drainée hors

1. Chargement du premier monomère et le bouchage des amines primaires libres excès sur la résine
   1. peser 30 mg de chlorhydrate de 4-methylbenzhydrylamine (MBHA·HCl) polystyrène résine (disponible dans le commerce ; charger valeur 0,7-1,4 mmol/g ; grosseur de maille de 100-200) et le transfert à un 5 mL cuve de réaction en phase solide peptide munie d’un bouchon de verre et robinet.
   2. Tremper la résine dans une quantité appropriée de DCM pendant 1 h, ce qui permet à la résine de gonfler et d’exposer les amines (sel HCl).
      NOTE : Perles de résine doivent toujours être complètement submergés dans des solvants dans l’ensemble de la synthèse.
   3. Vider la DCM en appliquant un léger courant d’azote sec sur le dessus du ballon. Ajouter 1 mL de 50 % (v/v) N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA) dans du DCM et laissez-le pendant 15 min. Ceci neutralise le sel HCl attaché aux amines libres sur la résine.
   4. Répéter étape 1.1.3. Pendant ce temps, peser 6 µmol de monomère et 6 µmol de hexafluorophosphate (benzotriazol-1-yl-oxy) tripyrrolidinophosphonium (PyBOP) et transférer dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 200 µL de diméthylformamide (DMF) et 12 µmol de DIPEA. La solution de couplage pour 3-5 min. de Vortex
      Remarque : Valeur de chargement désirée utilisée est 0,2 mmol/g. Le premier monomère ajouté est le monomère du C-terminal de la séquence souhaitée de la PNA. La valeur du chargement du premier acide aminé peut être calculée par la méthode de l’acide picrique ⁴⁶.
   Solution
   5. Vider la DIPEA de la DCM. Laver la résine avec du DCM (x 3), suivie de DMF (x 3) et fermer le robinet. Ajoutez la solution de couplage préparés à la résine et agiter doucement. Poussez la résine le long des parois intérieures du bateau dans la solution de couplage à l’aide d’une spatule de nettoyer l’acier inoxydable. Fixez le bouchon de verre et fixez le navire dans un shaker incubateur durant 3 h à 40 ° C.
      Remarque : Vous pouvez également la cuve de réaction peut être conservée stable à température ambiante pendant 6 à 8 heures permettre l’achèvement du peptide réaction de couplage.
   6. Préparer la solution de bouchage en mélangeant 240 µmol d’anhydride acétique et 360 µmol de DIPEA dans 200 µL de DCM. Égoutter la solution de couplage et laver la résine avec DMF (x 3) et DCM (x 3). Ajouter à la solution de bouchage et quittent le navire pendant 30 min, parfois secouer le bateau doucement. Bouchage masque les groupes amine primaire libre excès sur les résines par acétylation.
   7. Répéter étape 1.1.6. Égoutter la solution de bouchage et de laver la résine avec du DCM (x 3).
   8. Enlever une petite aliquote de perles de résine à l’aide d’un mince tube capillaire et placez-les dans un flacon de verre de 1,5 mL. Effectuer le test de Kaiser ⁴³. Ajouter 15 µL de chacune des Kaiser des solutions de test dans le verre cuvette et chauffer à l’aide d’un pistolet à air chaud. Observer la couleur des perles après chauffage. La couleur des perles doit rester inchangée, ce qui indique l’absence de groupes amines libres sur la résine.
      Remarque : Le kit de test de Kaiser est disponible dans le commerce ou peut être préparé selon le protocole signalé. Solution A: ninhydrine dans l’éthanol ; solution B: phénol dans l’éthanol ; solution c : cyanure de potassium (KCN) dans la pyridine.
      ATTENTION : KCN est hautement toxique ; devraient porter des vêtements protecteurs appropriés et de chauffage doit être effectuée sous une hotte ventilée, en l’absence de solvant inflammable ou réactifs.
   9. Répéter l’étape 1.1.6 si les perles de résine d’affichage couleur bleu bleu ou indistincte.
2. Suppression de groupe protecteur d’aminé N-terminal
   1. égoutter les solvants de la cuve et ajouter une solution de 50 % (v/v) d’acide trifluoroacétique (TFA) dans du DCM, veiller à ce que les résines sont complètement submergées. Quitter le navire pendant 15 min, agitant occasionnellement afin de faciliter la déprotection des groupes amine. Répétez les 2 cycles plus.
      ATTENTION : TFA est très corrosive. Vêtements de protection appropriés doivent être portés lors de la manipulation.
   2. Laver la résine avec DCM (x 3), DMF (x 3) et DCM (x 3). Ajouter une solution de 5 % DIPEA dans du DCM. Quitter le navire pendant 15 min. Cette étape active les amines libres en neutralisant les anions de compteur TFA. Répéter une fois de plus.
   3. Débusquer le DIPEA de la solution de DCM. Laver la résine avec du DCM (x 3). Effectuer le test de Kaiser (étape 1.1.8).
      NOTE : Déprotection réussie des groupes amine produira une décoloration bleue des perles. Une fois la déprotection est réussie, couplage ultérieur de monomères de couplage peptidique peut être effectué.
3. Couplage des monomères ultérieures
   1. peser 18 µmol de désiré monomère (pour le monomère Boc-PNA-Q-OH, 13,2 mg de monomère est pesé) et 18 µmol de PyBOP dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 200 µL de DMF et 36 µmol de DIPEA dans le tube de 1,5 mL. Vortex jusqu'à ce que tous les composés solides dissoutes.
   2. Laver la résine avec DMF (x 3). Ajouter la solution de couplage dans le réacteur et agiter doucement. Poussez la résine le long des parois intérieures du bateau dans la solution de couplage à l’aide d’une spatule de nettoyer l’acier inoxydable. Fixez le bouchon de verre et fixez le navire dans un shaker incubateur durant 3 h à 40 ° C.
   3. Vidange hors de la solution de couplage et laver la résine avec DMF (x 3) et DCM (x 3). Effectuez l’étape 1.1.8. Si la couleur des perles reste inchangée, répéter étapes 1.2.1-1.3.3 avant d’avoir terminé la séquence souhaitée de la PNA. Si la décoloration bleue de perles est observée après l’accouplement d’un monomère, répétez les étapes 1.3.1-1.3.3. Si la décoloration persiste toujours, effectuer l’écrêtement à nouveau (étape 1.1.6).
      Remarque : Étendue de couplage temps (3-12 h) et/ou l’utilisation du surplus équivalent du monomère et réactifs de couplage sont recommandés en cas de problèmes avec couplage.
   4. Une fois la séquence souhaitée de la PNA est terminée, laver la résine avec DMF (x 3) et DCM (x 3). Sécher complètement la résine en appliquant un flux continu de gaz azote sec pendant 15 min. Cette résine sèche peut être partagée et utilisée pour attacher la lysine ou un marqueur fluorescent comme cyanine 3 (Cy3) et la carboxyfluorescéine à l’extrémité N-terminale de l’ANP.
4. Fixation de lysine ou fluorescentes tag (Cy3 et Cy5, carboxyfluorescéine) à l’extrémité N de PNA
   1. peser 10 mg de résine, préchargé avec la séquence souhaitée de la PNA. Transvaser dans un réacteur de 5 mL. Faites tremper la résine dans DCM pendant 1 h.
   2. Pour la fixation de lysine, effectuez les étapes 1.2.1-1.3.3, remplaçant le monomère avec soit Boc-Lys (Z) - OH ou Fmoc-Lys (Boc) - OH.
   3. Pour la fixation de carboxyfluorescéine, effectuez les étapes 1.2.1-1.3.3, avec 10 fois excès de 5 6-carboxyfluorescéine comme le monomère, et N, N '-diisopropylcarbodiimide (CPIM) et hydroxybenzotriazole (HOBt) comme les réactifs de couplage dans le DMF. Laissez la réaction de couplage du jour au lendemain dans le shaker incubateur à 40 ° C.
      Remarque : Comme carboxyfluorescéine est sensible à la lumière, le réacteur doit être recouvert d’aluminium.
   4. Pour la fixation du colorant Cy3 ou Cy5, l’étiquette par la méthode de chimie de clic, effectuez les étapes 1.2.1-1.3.3, remplaçant le monomère par N-Boc-2-propargyl-L-glycine. Cela functionalizes le N-terminale de l’ANP avec un groupe d’alcyne. Effectuer la réaction catalysé par le cuivre cliquez pour attacher la Cy3 contenant de l’azide ou fluorescentes Cy5 teindre ^{12 , 47 , 48 , 49}
5. Clivage PNA de support solide, purification et caractérisation
   Remarque : si aucun groupement amine est protégée par le Fmoc groupe protecteur, tout d’abord déprotéger le groupement amine en traitant avec piperdine 20 % dans le DMF solution pendant 15 minutes (2 cycles). Laver la résine avec DMF (x 3) suivie de DCM (x 3). Sécher la résine en appliquant un flux continu de gaz azote sec pendant 15 min.
   1. Transfert de 5 mg de résine sèche dans un petit flacon. Ajouter 10 µL de thioanisole et 4 µL de 1, 2-éthanedithiol, veiller à ce que la résine est immergée dans les réactifs. Maintenir le tube à température ambiante pendant 5 min.
      Remarque : Ces réactifs agissent comme des charognards, qui emprisonnent les espèces cationiques réactives qui sont forment lors de l’enlèvement de la protection des groupes à l’ANP. Charognards appropriés peuvent être choisis à l’issu de la chaîne latérale groupes protecteurs.
   2. Ajouter 100 µL d’AGT dans le tube contenant de la résine et des charognards. Doucement le vortex du mélange et sujet à une centrifugation courte. Maintenir le tube à température ambiante pendant 10 min.
      ATTENTION : TFA est très corrosive. Vêtements de protection appropriés doivent être portés lors de la manipulation.
   3. Soigneusement ajouter 20 µL de l’acide trifluorométhanesulfonique (TFMSA) dans le tube. Agiter doucement le mélange réactionnel avant de le soumettre à une centrifugation courte à température ambiante. Maintenir le tube stable à température ambiante pendant 2 h.
      ATTENTION : TFMSA est très corrosive. Vêtements de protection appropriés doivent être portés lors de la manipulation.
   4. Filtre hors le clivage cocktail dans un ballon à fond rond 5 mL (RBF) avec l’utilisation d’un verre Pasteur pipette équipés de coton. Utilisez une petite quantité d’AGT pour laver la résine.
   5. Purger le gaz d’azote sec au filtrat recueilli jusqu'à ce que tous les solvants volatils sont évaporés. Ajouter 1 mL de l’éther diéthylique froid dans le RBF.
      Remarque : L’éther entraînera l’ANP à précipiter.
      1. Rinçage la BRF avec le diéthyl éther plusieurs fois avant de transférer la solution trouble dans un tube de 1,5 mL. Sujet du tube de centrifugation pour permettre le précipité de l’ANP à régler. Décanter les solvants et ajoute le précipité de 300-500 µL d’eau stérilisés à l’autoclave. Vortex soigneusement pour dissoudre l’autorité nationale palestinienne.
   6. Purifier l’échantillon brut de PNA par RP-HPLC en utilisant water-acetonitrile-0.1% TFA comme phase mobile. Recueillir les fractions correspondantes, s’évaporer tous les solvants utilisant une pompe à vide avant de re-dissoudre l’ANP purifié dans l’eau autoclavé.
   7. Caractériser l’ANP purifiée par analyse de MALDI-TOF avec l’utilisation de α-cyano-4-hydroxycinnamique (ACSSD) comme la matrice de cristallisation échantillon.
   8. , Mesurer l’absorbance UV (260 nm) de l’ANP à 65 ° C. calculer la concentration de l’ANP avec l’équation :
      
      Remarque : ici c est la concentration, A la lecture de l’absorbance obtenue, ε est le coefficient d’extinction de la séquence d’ARN, et l est la longueur du trajet optique de la cuve (1 cm). le coefficient d’extinction de la séquence de la PNA est la somme de coefficient d’extinction de monomères individuels ⁵⁰. Les coefficients d’extinction de l’adénine, cytosine, guanine et thymine sont 15.4, 7.3, 11,7 et 8,8 mL/µmol·cm, respectivement. Le coefficient d’extinction des monomères L et Q utilisé est supposé pour être la même que celle de la cytosine (C) base.

2. PAGE non dénaturants

tampon d’Incubation préparer à

1. préparation de solutions tampons requis
   1. (10 mL) à l’aide de 116,88 mg NaCl (200 mM), 50 µL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,5 mM) de 100 mM, 200 µL de stock 1 M HEPES (20 mM), 9,75 m H ₂ O ; ajuster le tampon à pH 7.5.
   2. Préparer 1 x tampon de Tris-Borate-EDTA (TBE) en cours d’exécution (1 L) à l’aide de 100 mL 10 x Tris-Borate-EDTA à pH 8,3 et 900 mL H ₂ O.
   3. Solution de persulfate (APS) d’Ammonium 10 % prepare (300 µL) en utilisant le persulfate d’ammonium 30 mg et 300 µL H ₂ O.
2. Préparation du gel de polyacrylamide 12 %
   1. nettoyer le peigne former, plaques de verre coulée et entretoises avec éthanol ; le peigne former et les entretoises sont 1 mm d’épaisseur. Mettre en place l’Assemblée gel et sceller avec du ruban adhésif d’étanchéité gel.
   2. Pour un gel de polyacrylamide de 22 cm x 16,5 cm x 1 dimension mm, 50 mL de solution de gel est adéquate. Peser avec 5,7 g d’acrylamide et 0,3 g de N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) et transfert dans une centrifugeuse 50 mL tube.
      ATTENTION : L’Acrylamide est cancérigène. Éviter de respirer les émanations de poussière de l’acrylamide et de veiller à ce que les vêtements de protection appropriés sont porté lors de la manipulation.
   3. Dissoudre des composés solides dans 50 mL 1 tampon TBE X en cours d’exécution en plaçant le tube à centrifuger dans un bain d’eau de 50 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que tous les composés solides ont dissous. Réaliser la centrifugation (3 000 tr/min, 5 min, 25 ° C) pour éliminer toutes les bulles d’air dans la solution. Laisser la solution refroidir à température ambiante.
   4. Ajouter à la solution de gel 250 µL de solution APS 10 % et 50 µL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et mélanger délicatement avec une spatule. Versez immédiatement la solution entre les plaques de verre, en veillant à ne pas y introduire des bulles d’air. Insérer la peigne former et quitter le programme d’installation de gel à température ambiante pendant au moins 60 minutes permettre la polymérisation se produise, avant de le stocker à 4 ° C jusqu’au moment de l’utiliser.
3. Préparation des échantillons
   1. enlever la quantité requise de RNA en épingle à cheveux (1 µM) de la crosse principale dans un tube propre de 1,5 mL. Sécher la solution RNA utilisant une pompe à vide.
      Remarque : Chaque échantillon contient 1 µM d’ARN dans 20 µL de tampon d’incubation. En règle générale, les 13 échantillons d’ARN sont préparés pour expérimenter une seule PAGE. L’ARN pour tous les échantillons peut être préparé ensemble dans un seul tube.
   2. Enlever les volumes requis de PNA ciblé (avec la concentration finale de 50 µM) le stock principal et le transfert dans des tubes distincts 1,5 mL. Faire évaporer l’eau des solutions PNA à l’aide d’une pompe à vide.
   3. 260 ajouter µL de tampon d’incubation dans le 1,5 mL tube contenant séché RNA et mélanger soigneusement pour s’assurer que toutes les ARN est dissolved. Sous réserve de l’ARN pour aligner le refroidissement : Place le tube dans un bloc chauffant (préchauffé à 95 ° C) pendant 5 min immédiatement transférer dans un bain de glace et laisser pendant 10 min.
   4. Ajouter 20 µL d’ARN dans le 1,5 mL chacun des tubes contenant séché de PNA et mélanger soigneusement. Effectuer un recuit : placer le tube contenant le mélange d’ARN et de PNA dans un bloc chauffant (préchauffé à 65 ° C) pendant 10 min. tour hors tension du bloc chauffant et laisser les échantillons refroidissent lentement à température ambiante. Incuber les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.
4. En cours d’exécution et de la transformation de gel
   1. enlever le ruban gel d’étanchéité sur la face inférieure de la plaque de verre. Monter et fixer la plaque de verre sur le stand de gel vertical à l’aide de pinces en plastique.
      NOTE : Le gel en cours d’exécution s’effectue dans une chambre froide à 4 ° c environ. Tous les équipements, les échantillons et les tampons sont refroidis à 4 ° C avant d’exécuter le gel.
   2. Remplir le réservoir tampon inférieur avec 1 x TBE tampon en cours d’exécution jusqu'à ce que la plaque soit immergée dans environ 1 à 2 cm du tampon. Remplir le réservoir tampon supérieur exécutant tampon jusqu'à ce que le niveau de la mémoire tampon dépasse le sommet du gel de 1 à 2 cm. lentement et retirer doucement le peigne former, ce qui permet du tampon en cours d’exécution remplir les puits.
   3. Connecter le support de gel à une alimentation électrique. Avant de courir le gel pendant au moins 30 min avec une tension constante de 250 V, qui est optimisé pour un 22 cm x 16,5 cm x 1 gel mm.
   4. Pendant ce temps, ajouter 4 µL (20 % du volume de l’échantillon) de solution de glycérol de 35 % à chacun des échantillons et mélanger doucement. Une fois terminée la course avant, charger 20 µL de chaque échantillon (y compris un seul échantillon de RNA et échantillons contenant un mélange ARN et PNA) soigneusement dans le fond du bien avec une micropipette et gel chargement conseils, en vous assurant de ne pas y introduire des bulles d’air. Exécutez le gel à une tension constante de 250 V, semblable à la course avant, pendant 5 h.
   5. Arrêter l’alimentation après 5 h et retirez la plaque de verre de la béquille. Retirez le ruban restant de gel d’étanchéité et démonter la plaque de verre. Retirez doucement et immerger le gel dans un récipient rempli de 350 mL d’eau désionisée. Ajouter 35 µL de bromure d’éthidium (10 mg/mL) avec précaution et de placer le récipient sur un agitateur de la plate-forme (basse vitesse) pendant 30 min.
      ATTENTION : Le bromure d’éthidium est un agent mutagène. Vêtements de protection appropriés doivent être portés lors de la manipulation.
   6. Jeter la solution de bromure d’éthidium dans un conteneur à déchets désigné. Rincer le gel avec 1,5 à 2 L d’eau distillée. Scannez le gel à l’aide d’un système imageur (voir Table des matières) avec un laser vert de 532 nm et l’émission filtrent ensemble à 610 nm.
5. Gel analyse
   1. quantifier les intensités de bande de gel à l’aide d’un logiciel libre, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Normaliser les intensités de bande selon :
      
      Remarque : ici j’ai _{max duplex} est l’intensité de la bande de l’épingle de RNA seule sans l’ajout de l’ANP et j’ai _{Triplex max} est l’intensité de la bande triplex avec la plus forte concentration de PNA ajouté.
      1. Calculer la fraction de triple formation selon :
         
   2. intrigue la fraction de la formation de triple (Y) contre la concentration de PNA ajouté () ΜM). Ajuster les données à l’équation pour obtenir la constante de dissociation (K _d) :
      
      Remarque : ici R ₀ est la concentration en ARN en épingle à cheveux (1 µM). Y ₀ et B Voici l’initiale et la variation maximale de la fraction triple, respectivement. Y est la fraction de triplex à concentration de PNA variée. X est la concentration totale de PNA et K _d est la constante de dissociation.

3. 2-Aminopurine Fluorescence essai de liaison

1. préparation des échantillons (contenant dsRNA)
   1. enlever la quantité requise de 2-aminopurine (2AP) étiquetée dsRNA (1 µM pour chaque chapelet) du stock principal dans un tube propre de 1,5 mL. Évaporer l’eau dans les solutions de RNA utilisant une pompe à vide.
      Remarque : Chaque échantillon contient 1 µM d’ARN de 75 µL de tampon d’incubation. En règle générale, les 13 échantillons d’ARN sont préparés. ARN pour tous les échantillons peut être préparé ensemble dans un seul tube.
   2. Enlever les volumes nécessaires de l’ANP ciblée pour diverses concentrations le stock principal et le transfert dans des tubes distincts 1,5 mL. Faire évaporer l’eau des solutions PNA à l’aide d’une pompe à vide.
   3. Ajouter 975 µL de tampon d’incubation dans le 1,5 mL tube contenant séché RNA et mélanger soigneusement pour assurer que tous les RNA est dissoute. Centrifuger la solution RNA brièvement et protégez-la recuit : placer le tube dans un bloc chauffant (préchauffé à 95 ° C) pendant environ 10 minutes de tour hors tension du bloc chauffant et laisser les échantillons refroidissent lentement à température ambiante.
   4. Ajouter 75 µL d’ARN dans le 1,5 mL chacun des tubes contenant séché de PNA et mélanger soigneusement. Laisser les échantillons à température ambiante pendant au moins 1 h. Incuber les échantillons à 4 ° C du jour au lendemain.
2. Préparation des échantillons (contenant ssRNA)
   1. enlever la quantité requise de 2AP-étiqueté ARN à simple brin (1 µM) de la crosse principale dans des tubes de propre de 1,5 mL. Extraire les volumes requis de PNA ciblée pour différentes concentrations du stock principal et transfert dans les tubes respectifs 1,5 mL contenant l’ARN simple brin. Sécher le mélange ARN et PNA à l’aide d’une pompe à vide.
   2. Ajouter 75 µL d’incubation dans chacun des tubes de 1.5 mL de tampon et bien mélange. Soumettre le mélange à recuit : placer le tube dans un bloc chauffant (préchauffé à 95 ° C) pendant 10 min. Turn off le pouvoir et laisser les échantillons refroidissent lentement à température ambiante. Incuber les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.
3. Mesure et analyse
   1. utiliser un spectrofluorimètre pour mesurer les émissions sur une plage de longueur d’onde de 330 à 550 nm. Utiliser une longueur d’onde d’excitation de 303 nm.
      Remarque : Les échantillons sont mesurés à la température ambiante et de chaque échantillon est mesuré 3 fois, où la moyenne est prise.
   Tampon
   2. transférer 70 µL d’incubation dans la cuvette de 1 cm carré. Démarrer la mesure.
   3. Retirer le tampon de la cupule. Rincer la cuve avec de l’eau distillée et purge d’azote gazeux pour sécher. Répétez pour tous les échantillons. Soustraire les mesures de la mémoire tampon de tous les échantillons.
   4. Tracer l’intensité de la fluorescence (u.a.) contre la longueur d’onde (nm). Enregistrer l’intensité de fluorescence à 370 nm pour tous les échantillons. Tracer l’intensité de fluorescence à 370 nm (u.a.) contre les concentrations correspondantes de l’ANP a ajouté (µM).
   5. Bon les données de l’équation de l’étape 2.5.2 pour obtenir la constante de dissociation (K _d) : Y = Y ₀ + (B / (2R ₀)) (R, ₀ + X + K _d-((R, ₀ + X + K _d) ² -4R ₀ X) ^1/2), où R ₀ est la concentration de dsRNA 2AP marqués (1 µM).
      NOTE : Ici Y ₀ et B sont la modification initiale et maximale de l’intensité de fluorescence à 370 nm, respectivement. Y représente l’intensité de fluorescence à 370 nm à concentration de PNA variée. X est la concentration totale de PNA et K _d est la constante de dissociation.

4. UV-Absorbance-détecté des expériences de fusion thermique

1. préparation des échantillons
   Remarque : mesurer l’absorbance UV (260 nm) de l’ARN à 95 ° C (pour s’assurer que les structures secondaires d’ARN sont perturbés). Calculer la concentration de l’ARN avec l’équation :
   
   ​ où c est la concentration, A est la lecture de l’absorbance obtenue, ε est le coefficient d’extinction de la séquence d’ARN, et l est la longueur du trajet optique de la cuve (1 cm). Le coefficient d’extinction de l’ARN est calculé selon un modèle plus proche voisin à l’aide de MeltWin ^{51 ,}, ⁵². Le bloc de programmation peut-être être fournie sur demande. Tubes
   1. enlever la quantité requise d’ARN à simple brin (5 µM) de la souche principale en propre de 1,5 mL. Supprimer les volumes requis de PNA ciblé (5 µM) du stock principal et transfert dans les tubes respectifs 1,5 mL contenant l’ARN simple brin. Sécher le mélange ARN et PNA à l’aide d’une pompe à vide.
   2. Ajouter 130 µL d’incubation dans chacun des tubes de 1.5 mL de tampon et bien mélange. Soumettre le mélange à recuit : placer le tube dans un bloc chauffant (préchauffé à 95 ° C) pendant 10 min. Turn off le pouvoir et laisser les échantillons refroidissent lentement à température ambiante. Incuber les échantillons à 4 ° C jusqu’au lendemain.
2. Mesure et analyse
   1. utiliser un spectrophotomètre UV-Vis pour mesurer l’absorbance à 260 nm en utilisant une cuvette 8-microcell avec une longueur de chemin d’accès de 1 cm. mesure les échantillons ' absorbance à l’augmentation de la température de 15 à 95 ° C, suivi par la diminution de température de 95 à 15 ° C à une vitesse de montée de 0,5 ° C/min.
   2. Transfert 130 µL de l’échantillon dans chacun des puits, en s’assurant que l’un contient bien le tampon d’incubation. Démarrer la mesure. Répéter au besoin.
   3. Normaliser les valeurs d’absorbance avec la lecture normalisé à l’unité de température élevée et reporter l’absorbance normalisée lecture contre la température (° C). Tracer la première dérivée des courbes. Obtenir les températures de fusion en ajustant les courbes premières dérivées d’une fonction gaussienne.

Results

HPLC en phase inversée permet la purification des oligomères PNA. Nous pouvons obtenir des oligomères PNA purs avec deux séries de purification HPLC (Figure 3). L’identité des revue PNAs peut être confirmée par analyse de MALDI-TOF (Figure 4).

PAGE non dénaturants est une technique simple et informative pour caractériser les affinités de liaison et les spécificités des oligomères PNA. Nous utilisons généralement plusieurs barettes RNA ou duplex avec les mutations seul nucléotide pour caractériser les propriétés de liaison (Figure 5). Les données de PAGE non dénaturants illustrées à la Figure 5 indiquent clairement que le Q - et L-modification PNA peut reconnaître une région de dsRNA avec une paire de C-G (Figure 5B, panneau inférieur) mais pas l’un sans une paire de C-G (Figure 5B, top Groupe d’experts). Cette reconnaissance spécifique et renforcée est par le biais de la T· A-U, L· G-C et Q· C-G PNA· Formation de RNA₂ triple base (Figure 1A, C, D). PNAs diverses mutations uniques ou multiples peuvent également être utilisés pour démontrer les propriétés de liaison améliorée d’un PNA mis à jour le. Nous avons montré que l’ajout de Mg^{2 +} 2 mM dans le tampon d’incubation n’affecte pas la liaison significativement³¹.

Nous avons démontré par titrage de fluorescence 2-aminopurine qui un PNA Q - et L-modification se lie à une région de dsRNA ciblées (Figure 6A, 6C, 6D) mais pas ssRNA (Figure 6B, 6E, 6F). PNA P3 se lie à l’ARNdb 2-aminopurine-étiqueté avec une valeur de_d Kde 0,8 ± 0,1 µM. L’intensité de fluorescence à 370 nm pour l’ARN simple brin 2-aminopurine-étiqueté demeure relativement constante avec concentration de P3 variée, indiquant l’absence de liaison des PNA P3 à l’ARN simple brin.

PNAs contenant du spectacle les résidus (P2 et P3) Q aucun thermique fonte transitions (Figure 7), ce qui laisse supposer aucune liaison à l’ARN simple brin. Cela est dû à l’affrontement stérique présent dans Watson-Crick comme Q-G la paire. Par rapport aux non modifiées PNA P1, PNAs P4 et P5 contenant modifié résidus L mais aucun résidu de Q, voir la diminution des températures de fusion pour les duplex de RNA-PNA correspondants en raison de l’affrontement stérique présent dans Watson-Crick comme L-G la paire. Les données de fusion thermiques absorbance UV-détectés sont compatibles avec les données de titrage 2-aminopurine fluorescence, qui montre aussi qu’un PNA contenant des résidus de Q et L ne lie pas à ARN à simple brin sensiblement (Figure 6B, 6E, 6F). Intégrant une base de Q est plus déstabilisante qu’une base de L, comme une base Q a un affrontement stérique plus important dans la formation d’une paire de type Watson-Crick Q-G (Figure 1F) par rapport à une paire de type Watson-Crick L-G (Figure 1E ).

Figure 1 : Les structures chimiques des structures stables paires de bases base triple et instables. (A-D) PNA· major-groove ARN₂ base triples de T· A-U (A), C⁺· G-C (B), L· G-C (C) et Q· C-G (D). (E, F) Watson-Crick instable comme paires de bases du PNA-RNA L-G (E) et Q-G (F). La lettre R représente l’épine dorsale du sucre-phosphate de l’ARN. Liaisons hydrogènes sont indiqués par des pointillés noirs. La figure est reproduite de référence³¹. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Structure chimique des monomères PNA. Quatre monomères PNA (T, C, L et Q) sont indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Structure chimique d’un oligomère PNA et purification par RP-HPLC. (A) la structure chimique de la séquence PNA P3. (B, C) Données de RP-HPLC de brut PNA P3 (B) et re-purifiée PNA P3 (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Spectre de MALDI-TOF de purifiée PNA P3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Hairpin RNA et séquences PNA et caractérisation de la liaison de PAGE non dénaturants. (A) RNA barettes (rHP1 et rHP2), PNA P3 et un PNA· ARN₂ triplex formé entre PNA P3 et rHP2. (B) Non dénaturants PAGE (12 %) résulte pour rHP1 et rHP2 liaison PNA P3. Le tampon d’incubation est de 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Les épingles à cheveux RNA chargés (rHP1 et rHP2) sont à 1 µM dans 20 µL. Les concentrations de l’ANP dans les voies de gauche à droite sont 0, 0,2, 0,4, 1, 1,6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, et 50 µM. PNA P3 ne lie pas aux rHP1 (panneau supérieur) mais lie à rHP2 (panneau inférieur). (C) K_d détermination pour la liaison de P3 à rHP2. La fraction de formation triple (Y) a été complotée contre la concentration de la PNA. La figure est adaptée de référence³¹. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Étude de titrage de fluorescence de liaison PNA P3à 2-aminopurine-étiqueté RNAs. Le résidu 2-aminopurine est désigné comme « 2 » dans la séquence d’ARN. Le tampon d’incubation est de 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) un PNA· ARN₂ triplex formé entre P3 et un ARNdb 2-aminopurine-étiqueté (dsRNA2-2AP). (B) une hypothétique duplex PNA-ARN formé entre P3 et un ARN simple brin 2-aminopurine-étiqueté (ssRNA2-2AP). (C, E) Spectres d’émission de fluorescence pour la 2-aminopurine-étiqueté ARN duplex (1 µM) et l’ARN à simple brin (1 µM), respectivement, avec varié P3 concentration à un pH de 7,5. Le pic à environ 475 nm est due à l’émission de fluorescence faible de la base de L à l’ANP. (D, F) K _d détermination basée sur les parcelles de l’intensité de fluorescence 2-aminopurine (370 nm) du duplex de RNA et ARN simple brin, respectivement, contre la concentration de PNA P3. La figure est adaptée de référence³¹. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Thermal fusion des résultats des duplex de RNA-PNA. Le tampon d’incubation est de 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH₂PO₄, pH 7,5. Tous les échantillons contiennent 5 µM d’ARN simple brin (ssRNA1) et PNA dans 130 µL. (A) ARN à simple brin (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 et P5) et un duplex de PNA-RNA hypothétique formée entre PNA P3 et ssRNA1 dans une orientation parallèle. L’affrontement stérique est indiqué pour le Watson-Crick comme Q-G ou paires de L-G. Courbes de fusion (B) pour différents PNAs liaison au ssRNA1. Les températures de fusion sont indiqués pour les courbes avec fusion des transitions. La figure est adaptée de référence³¹.

Discussion

RNA liaison duplex PNA oligomères (p. ex., 10-mers) sont des molécules de taille moyenne et ainsi peut montrer Maj mobilité électrophorétique lors de la liaison à l’ARN d’une taille comparable ou légèrement plus grande (par exemple, 50-mer ou plus petit). Si un ARN est sensiblement plus importante que l’autorité nationale palestinienne, titrage des ANP dans l’ARN peut ne pas fonctionner en raison d’un décalage de mobilité de gel limité. Ainsi, l’ARN grand peut être tronquée pour les essais non-dénaturisation de PAGE. Titrage d’un grand ARN dans un PNA marqués au fluorophore permet le suivi de la formation de triple par un gel d’agarose non dénaturants avec l’échantillon chargé au milieu du gel⁴⁰.

Pour une expérience de titrage de non-dénaturisation de PAGE avec une concentration totale constante de l’ARN, nous utilisons généralement une concentration d’ARN non étiquetée 1 µm pour efficace post coloration des bandes triplex libre RNA et de bromure d’éthidium. Une concentration aussi faible que 0,2 µM d’ARN peut également être suffisante selon la RNA construction³¹. La concentration de l’ARN sans étiquette (0,2 µM) détermine que les valeurs de_d Kpouvant être mesurée avec précision doivent être environ 0,2 µM ou supérieure. Autres colorants coloration peuvent servir à améliorer l’efficacité de la coloration. Par ailleurs, nos données non publiées suggèrent que Cy3 dye-labeled RNAs peut être utilisé dans les expériences de PAGE non dénaturants pour mesurer les événements de liaison étroite.

Dû au fait que 2-aminopurine n’est que modérément fluorescent, 2-aminopurine titrage de fluorescence est également limitée à la mesure de la liaison avec les valeurs de K_d proche ou supérieure à 0,2 µM³¹. L’ARN ou l’autorité palestinienne peut-être être marqué par un agent relativement brillant pour quantifier une liaison assez serré en solution par titrage de la fluorescence, si la liaison entraîne des changements dans la fluorescence signaux^{53,54, 55}.

La stratégie de ciblage des structures d’ARN par liaison de dsRNA PNAs a été testée pour un nombre limité d’ARN. Il est probable que les propriétés de liaison peuvent varier pour ARN doubles brins avec des compositions différentes séquences et de paires de bases. On peut toujours choisir le brin riches en purines d’un duplex pour la conception de TFPNAs. Il est essentiel de comprendre comment consécutives Q· C-G triples pouvant affecter la stabilité d’un triplex. Études plus approfondies de séquence dépendant sont clairement nécessaires pour comprendre les propriétés de liaison de la séquence dépendante du TFPNAs.

L’affinité de liaison de TFPNAs peut être encore améliorée en augmentant la longueur et/ou modifier davantage les bases et dorsales^56,57 du TFPNAs. Toutefois, une région duplex continue ne peut pas sont souvent constitués de plus de 10 paires de bases consécutives sans interruption par des structures non-Watson-Crick. On peut conjuguer TFPNAs avec petites molécules pour la reconnaissance des structures non-Watson-Crick adjacentes aux régions de dsRNA. En principe, un conjugué de molécule de TFPNA-grêle devrait avoir amélioré affinité et spécificité par rapport à un TFPNA ou une seule petite molécule. Toutefois, les propriétés chimiques et physiques de l’éditeur de liens pour la conjugaison^{58,59,60,61,62,63,64} doit être optimisé.

Le fait que TFPNAs pouvez lier sélectivement à ARN doubles brins sur ssRNAs et dsDNAs suggère qu’il est possible de développer des TFPNAs comme sondes chimiques très utiles et des ligands thérapeutiques potentiels par le biais de la réglementation des RNA dynamique des structures et des interactions avec protéines et métabolites. Assimilation de TFPNAs peut être facilitée grâce à la conjugaison avec des moitiés de pénétration cellulaire tels que de petites molécules, les peptides et les nanoparticules ou complexation avec des structures supramoléculaires comme les liposomes^{5,6 ,12,17,25,31,41,65,66}. Fonctionnalisation de TFPNAs avec des tags bioimaging comme fluorophores et radio-isotopes peut faciliter la détection, l’imagerie et le ciblage des structures d’ARN fonctionnelles dans les organismes vivants.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamis moléculaires, 4A, granulés de 1 à 2 mm de diamètre.	Alfa Aesar	87956
4-Méthylbenzhydrylamine chlorhydrate (MBHA&Yuml ; HCl)	Sigma-Aldrich	532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)	Alfa Aesar	A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)	Alfa Aesar	B25251
Anhyride acétique	Sigma-Aldrich	320102
Kaiser Test Kit  ;	Sigma-Aldrich	60017
Acide trifluoroacétique (TFA)	Alfa Aesar	L06374
Monomères PNA non modifiés	ASM Research Chemicals	GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH	Sigma-Aldrich	B8389 / 47624
Thioanisole	Alfa Aesar	A14846
1,2-Ethanedithiol	Alfa Aesar	L12865
Acide trifluorométhanesulfonique	Alfa Aesar	A10173
LiChrosper® ; 100 RP-18 endcapped (5 µ ; m) LiChroCART® ; 250-4	Merck Millipore	150838
Oligos d’ARN²	Sigma-Aldrich	Personnalisé  ;
Acide &alpha ;-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA)	Sigma-Aldrich	39468
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Alfa Aesar	J15694
HEPES  ;	Lonza	17-737E
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A8887
N.N'-methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich  ;
Persulfate d’ammonium (APS)	Bio-rad	161-0700
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	Bio-rad	161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Tampon, pH 8,3	1ère base	BUF-3010-10X1L
Glycérol  ;	Promega  ;	H5433
Bromure d’éthidium (10 mg/mL)	Bio-rad  ;	161-0433
Cellule de haute précision (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)	Hellma Analytics  ;	105.250-QS