Le manque d’outils pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo empêche de valider leurs rôles au cours du développement. Nous avons utilisé la microscopie à force atomique (AFM) et suivi des nanoparticules pour quantifier les caractéristiques mécaniques sur la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie. Ces méthodes sont fiables et largement applicable en évitant des interventions intrusives.
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Article de méthode
AFM et microrhéologie dans la cellule de jaune de œuf embryon de poisson zèbre
Dans cet article
Résumé
Résumé
Élucider les facteurs qui orientent l’organisation spatio-temporelle de l’évolution des tissus est l’un des buts principaux de l’étude du développement. Diverses propositions prétendent avoir été importantes contributions à la compréhension des propriétés mécaniques des cellules et des tissus dans leur organisation spatio-temporelle dans différents processus morphogénétiques et de développement. Toutefois, en raison du manque d’outils fiables et accessibles pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo, valider ces hypothèses a été difficile. Nous présentons ici des méthodes utilisant la microscopie à force atomique (AFM) et suivi dans le but de quantifier les propriétés mécaniques de la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie de particules. Épibolie est un processus de développement précoce conservé dont l’étude est facilitée par la transparence de l’embryon. Ces méthodes sont simples à mettre en œuvre, fiable et largement applicable puisqu’ils surmontent des interventions intrusives qui pourraient influer sur la mécanique des tissus. Une stratégie simple a été appliquée pour le montage d’échantillons, l’enregistrement de l’AFM et des injections de nanoparticules et de suivi. Cette approche rend ces méthodes facilement adaptable à d’autres fois du développement ou les organismes.
Introduction
Les principes physiques qui sous-tendent le contrôle biomécanique des processus morphogénétiques sont en grande partie non définies. Alors que des études biomécaniques au niveau moléculaire et cellulaire sont rassemblent élan considérable, l’exploration des paramètres biomécaniques au niveau tissulaire/organisme est à ses balbutiements. Hydrodynamiques régression1 ou vidéo microscopie de Force2 permettent aux chercheurs de distinguer les forces actives et passives, tandis que de microchirurgie laser3, ou la moins intrusive microscopie à force atomique (AFM) de cellules dissociées....
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Protocole
Toutes les étapes du protocole décrits ci-dessous suivent les directives de protection des animaux de nos institutions.
1. Culture de poisson-zèbre
- Reproduire et maintenir le poisson-zèbre adulte dans des conditions normales.
Remarque : Les embryons de type sauvage AB et TL ont été utilisés pour cette étude. - Collecte des embryons et cultivez-les à 28,5 ° C à l’E3 embryon moyenne24. Leur stade selon morphologie comme décrit précédemment19.
2. atomic Force Microscopy
- Manuellement les dechorionate mis en scène des embryons de pois....
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Résultats
Mesures de tension corticale
Pour chaque point de mesure, cinq courbes de force-déplacement (F-z) ont été acquises par l’AFM par la montée en puissance du cantilever à 1 Hz avec une amplitude crête-à-crête de 5 µm (vitesse = 10 µm/s) jusqu'à une échancrure maximale d’environ 2 µm. Cette procédure prend moins de 20 min et n’était pas affectée par la progression de l’épibolie. Chaque condition expérimentale a été testée au moins 5 embryons.
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Discussion
Ici, nous montrons que les propriétés du matériau et certains paramètres biomécaniques de la cellule de jaune de œuf de poisson-zèbre durant l’épibolie peuvent être facilement estimées par l’AFM et nanoparticules microrhéologie.
Alors que l’AFM a été employé pour récupérer des caractéristiques rhéologiques des cellules et des tissus dans des conditions physiologiques4,5,25,
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions Amayra Hernández-Vega et Philippe-Alexandre Pouille pour avoir participé à la mise en place de la base de ces protocoles. Nous remercions également la plate-forme d’imagerie moléculaire du IBMB-PCB, Xavier Esteban et de membres du laboratoire pour un soutien continu. Le programme de groupes consolidés de la Generalitat de Catalunya et la DGI et la Consolider subventions accordées par le ministère de l’économie et la compétitivité de l’Espagne à l’EMB et DN a soutenu ce travail.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope optique inversé | Nikon | TE2000 | Visualisation de l’échantillon et de l’AFM |
| Microscope à force atomique (AFM)Sur | mesure-Tout | AFM commercialisé pourrait être utilisé | |
| Microscope confocal inversé | Zeiss | LSM780 | Collecte de données de nanorhéologie |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Moulage d’embryons |
| Agarose LMP ultrapure (à faible point de fusion) | Invitrogen | 16520-100 | Sécurisation des embryons |
| Poissons zèbres Moules de micro-injection et de transplantation | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Coulée d’embryons. Sur mesure avec les dimensions d’origine peut également être utilisé |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1,5 mm de diamètre |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT. GS | Mesure de l’embryon par AFM. Pointe sphérique : 4,5 & micro ; m diamètre et k=0,01 N/m |
| Nanoparticules fluorescentes | Technologies | FluoSpheres F8811,Pour | le suivi nanorhéologie |
| Extracteur de micropipettes | Sutter Instruments | P-2000 | Fabrication de micro-aiguilles |
| sur mesure Verre capillaire borosilicaté | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabrication de micro-aiguilles |
| sur mesure Micromanipulateur | Narishige | MN-153 | Manipulation de la micropipette |
| Micro-injecteur | Eppendorf | FemtoJet Express | Contrôle du temps et de la pression d’injection |
| Stéréomicroscope | Leica | DFC365FX Visualisation des embryons pendant l’injection | |
| Logiciel d’analyse | MathWorks | Matlab | Analyse des données AFM et de suivi des particules |
| Poisson zèbre | AB et TL de type sauvage | - | Souches utilisées pour la collecte d’embryons |
| Plaques à fond en verre | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Montage d’embryons pour la collecte de données de nanorhéologie |
| Micromètre de scène | FST | 29025-02 | Mesure du volume d’injection |
Références
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc....
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Réimpressions et autorisations
