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Article de méthode

AFM et microrhéologie dans la cellule de jaune de œuf embryon de poisson zèbre

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DOI :

10.3791/56224

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29 novembre 2017

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1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

Dans cet article

Résumé

Le manque d’outils pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo empêche de valider leurs rôles au cours du développement. Nous avons utilisé la microscopie à force atomique (AFM) et suivi des nanoparticules pour quantifier les caractéristiques mécaniques sur la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie. Ces méthodes sont fiables et largement applicable en évitant des interventions intrusives.

Résumé

Élucider les facteurs qui orientent l’organisation spatio-temporelle de l’évolution des tissus est l’un des buts principaux de l’étude du développement. Diverses propositions prétendent avoir été importantes contributions à la compréhension des propriétés mécaniques des cellules et des tissus dans leur organisation spatio-temporelle dans différents processus morphogénétiques et de développement. Toutefois, en raison du manque d’outils fiables et accessibles pour mesurer les propriétés des matériaux et des paramètres ligatures en vivo, valider ces hypothèses a été difficile. Nous présentons ici des méthodes utilisant la microscopie à force atomique (AFM) et suivi dans le but de quantifier les propriétés mécaniques de la cellule de jaune de œuf embryon intact zebrafish durant l’épibolie de particules. Épibolie est un processus de développement précoce conservé dont l’étude est facilitée par la transparence de l’embryon. Ces méthodes sont simples à mettre en œuvre, fiable et largement applicable puisqu’ils surmontent des interventions intrusives qui pourraient influer sur la mécanique des tissus. Une stratégie simple a été appliquée pour le montage d’échantillons, l’enregistrement de l’AFM et des injections de nanoparticules et de suivi. Cette approche rend ces méthodes facilement adaptable à d’autres fois du développement ou les organismes.

Introduction

Les principes physiques qui sous-tendent le contrôle biomécanique des processus morphogénétiques sont en grande partie non définies. Alors que des études biomécaniques au niveau moléculaire et cellulaire sont rassemblent élan considérable, l’exploration des paramètres biomécaniques au niveau tissulaire/organisme est à ses balbutiements. Hydrodynamiques régression1 ou vidéo microscopie de Force2 permettent aux chercheurs de distinguer les forces actives et passives, tandis que de microchirurgie laser3, ou la moins intrusive microscopie à force atomique (AFM) de cellules dissociées4 ou en vivo 5 ou nanoparticules microrhéologie6 permettre l’anticipation d’un tissu propriétés mécaniques et les réponses.

AFM est une technique topographique en trois dimensions avec une haute résolution atomique résoudre la rugosité et la conformité de la déviation de conseils en porte-à-faux lors du contact avec une surface sondé7. Différentes méthodes employant l’AFM ont été développés pour étudier les propriétés de surface, y compris mesure de frottement, adhérence des forces et des propriétés viscoélastiques des matériaux diversifiés. Récemment, l’AFM a émergé comme un outil puissant pour récupérer des informations sur les propriétés mécaniques des échantillons biologiques. En particulier, AFM peut extraire non invasive le module de cisaillement complexe de cellules individuelles en appliquant des indentations oscillatoires avec un embout micro attaché au bras de levier du connu flexion constante8. Cela nous permet de déduire les forces qui en résultent. Pourtant, l’AFM n’est pas unique et différentes méthodologies permettent d’extraire des données rhéologiques et mécaniques de cellules individuelles (p. ex., Micropipette aspiration9, magnétique torsion cytometry (MTC)10ou uniaxiales traction essai11).

Pourtant, l’application de ces nouvelles méthodes aux processus morphogénétiques complexes n’est pas simple. Les principaux défis rencontrés lors de la détermination des propriétés mécaniques des tissus embryonnaires sont les petits (µm à mm), doux (dans les 102 - 104 Pa rang) et la nature visco-élastique (donnant lieu à des phénomènes dépendant du temps) de la matière12. Il est donc important d’adapter les méthodes employées pour la détermination des propriétés mécaniques (rigidité, viscosité, adhérence) pour le cas spécifique des embryons et des organismes en développement. Deux questions importantes doivent être pris en considération lors de l’analyse rhéologiques approches pour étudier le développement : pour éviter toute interférence intrusive et de fournir un accès facile. Dans ce scénario, aspiration de micropipette, MTC et essai de traction présentent des limites. Dans le premier cas, la déformation importante qui souffre d’une cellule susceptible de modifier ses propriétés physiologiques et mécaniques9. Dans le second cas, la nécessité d’adhérer fermement le tissu expérimental à un substrat pour s’assurer que les contraintes appliquées déforment le cytosquelette localement pourrait également introduire des effets sur l’état d’activation des cellules et, par conséquent, dans leurs caractéristiques mécaniques10 . Dernières approches traction uniaxiales sont limitées par la géométrie de développer des organismes et accessibilité11.

AFM semble mieux convenir pour l’étude des processus de développement car elle permet l’étude d’échantillons biologiques directement dans leur milieu naturel sans aucune préparation de l’échantillon encombrant. En outre, dissociation des tissus embryonnaires est généralement difficile, la taille réduite des sondes AFM fournit un haut degré de polyvalence sans limitation dans le choix du type de milieu (aqueuse ou non aqueuses), température de l’échantillon ou chimique composition de l’échantillon. AFM est suffisamment polyvalent pour être appliquée à vastes domaines et d’échelles de temps et a été employé pour récupérer les propriétés des matériaux des tissus dans des conditions physiologiques ou stades distincts. Les tissus ensemble natifs comme artères13 ou OS14 ont été étudiées d’un point de vue topographique et dans certains cas, comme la sclère, propriétés mécaniques ont également été consulté le15. Topographie a également été explorée dans les embryons vivants permettant la visualisation, par exemple, cellule du réarrangement d’au cours de la morphogenèse in Xenopus16. Protocoles de préparation témoin dernier, Global ont été développés afin de déterminer les paramètres mécaniques au cours de différents processus de développement. Cartes de nanoindentation ont été générées sur des sections de tissu non fixées natif pour le poussin embryonnaire tube digestif11; propriétés adhésives et mécaniques Récupérée pour individuels ectoderme, mésoderme et endoderme progéniteurs isolés des embryons de poisson-zèbre gastrulating4; mesures de rigidité effectuées pour l’épiblaste et de la ligne primitive sur des explants d’embryons aviaires17; et une nette tendance de dégradés de rigidité définis directement dans le cerveau embryonnaire de Xenopus5.

Un saut qualitatif important d’application AFM pour explorer le développement embryonnaire peut-être provenir de l’approche simples processus morphogénétiques accessibles. Poisson zèbre épibolie est un événement essentiel et conservé, dans lequel les différents tissus coordonnent dans un espace restreint et sphérique de diriger l’expansion de la blastoderme en quelques heures. Dès l’apparition du poisson-zèbre épibolie (stade sphérique), une couche superficielle de cellules, la couche enveloppante (EVL), couvre un plafond semi-sphérique de blastomères centrée sur le pôle animal de l’embryon, assis sur une cellule syncytial massif jaune d’oeuf. Épibolie consiste en l’expansion corticale ward végétal de l’EVL, les cellules profondes (DCs) du blastoderme et la couche externe de la cellule de jaune de œuf syncytial (E-YSL) autour du jaune. Épibolie se termine par la fermeture de l’EVL et les contrôleurs de domaine à la pole vegetal18,19,20. Comment et où les forces sont générés durant l’épibolie et comment ils sont couplés à l’échelle mondiale ne sont pas encore clair1,21.

Ici, nous décrivons en détail comment appliquer AFM pour inférer les propriétés tissu mécanique passive au cours de la progression dans le poisson-zèbre jaune épibolie cellulaire in vivo. Pour ce faire, nous avons utilisé des microsphères petits attachés à encorbellements AFM comme sondes. Ceci permet la récupération d’informations locales précises au sein de la surface des cellules non uniforme jaune de œuf et d’étudier les gradients de tension et leur dynamique au fil du temps. AFM alternative approches telles que celles à l’aide de cale encorbellements22, sera rendu pas aux données locales qui sont assez précises. La technique du coin, qui exige des compétences de manipulation très prudent pour coller une cale plus grande que la taille de l’échantillon à l’extrémité du levier, n’est pas bien adaptée pour sonder l’embryon (~ 2 fois plus grande que la longueur du levier) mécanique.

Modélisation et à caractériser les propriétés viscoélastiques des cellules de façon qualitative et quantitative permet une meilleure compréhension de leur biomécanique. D’un point de vue biomécanique, il est essentiel de comprendre l’épibolie et pas seulement demande connaissance des mesures de tension corticale et dynamiques, qui peuvent être extraites par l’AFM ; ainsi, il y a besoin d’informations sur les propriétés biophysiques du tissu. Pour extraire ces informations, une variété de cellule rhéologie techniques ont été développés au cours des années afin de caractériser les différents types de cellules sous différentes conditions physiologiques23. Citons, entre autres, AFM, MTC et pinces optiques (OT). Ces méthodes, cependant, ont fait leurs preuves insuffisantes pour mésoscopique des analyses à l’échelle d’embryons ou d’organes. Comme alternative, nous avons adapté avec succès les suivi des nanoparticules microrhéologie6 pour in vivo des mesures rhéologiques. Cette technique analyse les déplacements browniens des particules individuelles et déduit les propriétés locales micromécaniques.

Ensemble microrhéologie AFM et nanoparticules permettent la définition de dynamique corticale des ligatures et des propriétés mécaniques internes du jaune durant l’épibolie. Cette information souscrit pleinement à un modèle dans lequel les contraintes anisotropes se développe en raison des différences dans la réponse de déformation de l’EVL et la couche cytoplasmique de jaune d’oeuf (YCL) à la contraction de l’actomyosine isotrope du cortex E-YSL est essentielle pour le mouvement directionnel net de l’EVL et épibolie progression1.

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Protocole

Toutes les étapes du protocole décrits ci-dessous suivent les directives de protection des animaux de nos institutions.

1. Culture de poisson-zèbre

  1. Reproduire et maintenir le poisson-zèbre adulte dans des conditions normales.
    Remarque : Les embryons de type sauvage AB et TL ont été utilisés pour cette étude.
  2. Collecte des embryons et cultivez-les à 28,5 ° C à l’E3 embryon moyenne24. Leur stade selon morphologie comme décrit précédemment19.

2. atomic Force Microscopy

  1. Manuellement les dechorionate mis en scène des embryons de poisson-zèbre (des âges différents selon les intérêts individuels). Enlever les chorions avec deux pinces fines et pointus (voir Table des matières).
    1. Saisissez le chorion à l’aide d’une pince et faire une larme dedans avec l’autre pince. Puis, tenant le chorion dans une région opposée à celle de la déchirure, pousser l’embryon doucement dans l’ouverture.
    2. Effectuer la dechorionation sous un stéréomicroscope dissection avec une portée réglable de grossissement de 8 X à 50 X.
  2. Monter les embryons pour AFM
    1. Préparer une solution de 2 % d’agarose dans le milieu de l’embryon et remplir une boîte de Petri 35 mm avec cela. Laisser solidifier. Faire des petits trous de 1,5 mm de diamètre (deux fois la taille d’embryon) et environ 350 µm de profondeur (l’embryon demi-taille) avec une pince fine dans le lit d’agarose.
    2. Placez les embryons dans les pokes faits dans la couche de gel d’agarose et assurer qu’ils fondent en place en répandant autour d’une solution faible de 0,5 % d’agarose dans le milieu de l’embryon. Verser cette solution autour juste les embryons pour les immobiliser dans les trous.
    3. Avant que l’agarose de la bas point de fusion se solidifie à température ambiante, faire pivoter les embryons de telle sorte que la région d’intérêt à être sondé par AFM feront face vers le haut (Figure 1 a).
  3. Examiner les embryons par AFM
    1. Localiser et les embryons dans la boîte de Pétri employant un objectif 20 X dans un Microscope à Force atomique inversé d’images (voir le Tableau des matériaux25) à température ambiante (23-24 ° C).
      Remarque : Les embryons sont perpétuées immergé dans le milieu de l’embryon et attaché au lit d’agarose.
    2. Sonde de surface de la cellule de jaune d’oeuf d’embryons casted utilisant des billes de polystyrène sphériques 4,5 µm de diamètre attaché au bras de levier avec une constante de ressort nominale de 0,01 N/m. définir l’amplitude crête à crête d’oscillation en porte-à-faux à 5 µm et sa fréquence de 1 Hz.
    3. Collecter des données pour chaque région devrait être testé dans différentes positions et à plusieurs embryons, comme une routine, pour une moyenne de données.
      Remarque : Un bon point de départ est de sonder les cinq positions situées au milieu et dans les coins d’un carré de 10 µm x 10 µm en contrôlant la position en porte-à-faux avec les actionneurs piezo XY du microscope AFM. Imagerie et collecte des données a pris environ 20 min par embryon. Enregistrement des données dans différentes régions de la surface de la cellule embryonnaire jaune, par exemple, le pôle végétal ou différentes régions à proximité de la marge de cellules EVL (Figure 1 b et 1C), n’est possible en utilisant des échantillons distincts orientés différemment.
  4. Calculer les forces
    1. Mesurer le déplacement vertical du levier AFM (z) avec des capteurs de jauge de contrainte couplés à actionneurs piézo et son déplacement (d) à l’aide d’une photodiode quadrant par la méthode optique levier avec le logiciel de contrôle de microscope (voir Table des matières ( 25).
    2. La pente d’une courbe d-z obtenue à partir des données recueillies dans une région nue d’une lamelle de verre permet de calibrer la corrélation entre le signal de la photodiode et la déformation de porte-à-faux (d).
      Remarque : Le déplacement vertical mesuré est égale à la déviation en porte-à-faux et la pente représente la sensibilité de la déviation du levier optique26.
    3. Déduire la constante de ressort cantilever (k) des fluctuations thermiques comme décrit précédemment27.
    4. Calculer l’indentation de l’échantillon (h) comme :
      h = (z - zc) -(d - dhors)          (1)
      NOTE : Ici zc est la position du point de contact et darrêt correspond à l’offset de la photodiode.
    5. Calculer la force (F) sur le cantilever comme :
      F = k · m (2)
  5. Calculer la tension du cortex selon un modèle de liquide-ballon consistant en une couche élastique de tension corticale Tc renfermant un liquide visqueux. Dans ce modèle, pour petites indentations (par rapport à la taille de l’embryon), force augmente proportionnellement4,,28 , comme :
    F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
    NOTE : Ici Rb est le rayon de la perle et Re est le rayon de l’embryon. Pour l’embryon de poisson zèbre, comme le rayon de l’embryon (400 µm) est de deux ordres de grandeur plus grands que celui de la perle (2,25 µm), cette équation peut être approchée comme :
    F = 4π Tc h (4)
    1. Calculer la force de tension-indentation (F-h) courbes dans chaque région de cellule embryonnaire vitellin pour cinq différents point de mesures.
    2. Calculer le Tc pour chaque F-h courbe par moindres carrés non linéaires montage. Pour l’analyse statistique, la tension corticale Tc calculé doit être en moyenne de l’autre F-h courbes.
  6. Mesurer les propriétés viscoélastiques (rhéologie) du cortex en appliquant de faible amplitude (100 nm) oscillations de fréquences multiples au cours de l’AFM composé d’ondes sinusoïdales de fréquences différentes,25.
    1. Calculer un module complexe efficace g*(ƒ) dans le domaine fréquentiel partir des courbes de retrait de force comme :
      g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
      ici j’ai est l’unité imaginaire, et F(f) et h(f) sont les spectres de fréquence (f) de la force et de la mise en retrait. b est la correction pour la traînée visqueuse sur le cantilever extraite les oscillations appliquées sur la surface.
    2. Distinctes g*(ƒ) en parties réelles et imaginaires, comme :
      g * (Ƒ) = g' (f) + ig'' (f)          (6)
      em > g'(f) est le module d’élasticité et est une mesure de l’énergie élastique stockée et récupérée par cycle d’oscillation. g'' (f) est le module visqueux qui prend en compte l’énergie dissipée.
    3. Calculer la tangente de perte, ce qui fournit un indice de la solide-like (< 1) ou liquide (> 1) comportement de la matière, comme :
      g'' (f) / g' (f)          (7)
      Remarque : Avec ce type de mesure, il est possible d’extraire les paramètres indiquant comment visqueux et élastique comment est le matériau le sondé. Bien que b dépend légèrement de la distance de l’extrémité du levier à la surface, étant donné les très faibles valeurs de g´´ exposées par le jaune cell (voir la Figure 2D ci-dessous), de petites variations de b ont un impact négligeable les mensurations29.

3. particules suivi microrhéologie

  1. Effectuer la microinjection de particules dans la cellule oeuf
    1. Fabriquer des micro-aiguilles sur mesure à l’aide d’une horizontale de micropipettes et capillaire en verre borosilicaté (voir Table des matières).
      1. Préparer des micro-aiguilles qui ont un diamètre extérieur de 1. 00 mm, un diamètre intérieur de 0,58 mm et une longueur de 10 cm à l’aide des paramètres de l’extracteur : pression : 500 ; Chaleur : 510 ; Pull : 65 ; Vitesse : 25 ; Temps : 50.
    2. Préparer un plat de Pétri injection en créant des voies de droite mise en retrait dans une agarose à 1 % dans le lit moyen embryon employant des moules faits personnalisés (voir la Table des matières).
      1. Retournez les moules et les placer sur le dessus du gel d’agarose liquide et retirer les moules dès que le gel se solidifie. Pipetter les embryons dans les rainures faites par le moule dans l’agarose sous un stéréomicroscope dissection à un grossissement de X 1,2.
        NOTE : La largeur et la conception des moules permettent les embryons à s’aligner.
    3. Avant l’injection, supprimer presque complètement le support afin de faciliter l’injection (la tension superficielle empêche l’embryon/chorion de coller à l’aiguille lorsque vous l’enlevez après l’injection).
    4. Microinject de nanoparticules fluorescentes (rayon un = 100 nm, voir Table des matières) dilué dans l’eau (1 / 1 000) dans la partie végétale de la cellule de jaune de œuf embryon (Figure 3 a).
    5. Ajuster la micropipette avec micromanipulateurs précision et injecter les billes avec un microinjector automatique avec contrôles de pression et de temps (voir Table des matières). Réglez la pression entre 10 et 20 lb/po².
    6. Avant d’injecter la solution de perle, calibrer le volume à injecter (0,5 nL) en mesurant la taille des gouttelettes envoyées par le microinjector avec un micromètre 1 x 0. 01 mm (voir la Table des matières).
    7. Utiliser un grossissement de 1, 6 X dans la dissection stéréomicroscope pour visualiser les embryons pendant les injections, qui sont effectuées à température ambiante.
  2. Évaluer le comportement viscoélastique du jaune en enregistrant les fluctuations thermiques
    1. Dechorionate les embryons microinjectés comme dans l’étape 2.1 et les intégrer dans une dépression de 0,5 % melting point d’agarose dans une solution moyenne embryon à 30 ° C. Ensuite, transférer sur des plaques à fond de verre (voir Table des matières) et orienter et poussez-les vers le couvre-objet lorsque l’agarose est encore liquide.
      Remarque : Lorsque l’agarose se solidifie à température ambiante, les embryons sont prêts à être photographié.
    2. Placer les embryons montés dans les plaques de fond de verre sur la scène d’un microscope confocal inversé 2 h après microinjection. Capturer des images des nanoparticules pour 26 s à une fréquence d’échantillonnage de 25 Hz avec un objectif X 63 à température ambiante dans un microscope confocal inversé employant le logiciel de microscope commercial standard (taille du pixel = 166 nm, images capturées chaque 40 ms).
    3. Calculer la position du centre de gravité des particules et de définir leurs trajectoires au fil du temps avec le plugin TrackMate de l’open source, logiciels ImageJ (Figure 3 b).
    4. Calculer le déplacement de Mean Square bidimensionnelle (TMS) de chaque particule avec logiciel sur mesure6,30 , comme :
      < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8)
      NOTE : Ici t est le temps écoulé et le décalage dans le temps. Dans un liquide visqueux pur, le MSD augmente inversement avec viscosité (ν) selon la relation d’Einstein-Stokes :
      < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9)
      où T est la température absolue.

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Résultats

Mesures de tension corticale
Pour chaque point de mesure, cinq courbes de force-déplacement (F-z) ont été acquises par l’AFM par la montée en puissance du cantilever à 1 Hz avec une amplitude crête-à-crête de 5 µm (vitesse = 10 µm/s) jusqu'à une échancrure maximale d’environ 2 µm. Cette procédure prend moins de 20 min et n’était pas affectée par la progression de l’épibolie. Chaque condition expérimentale a été testée au moins 5 embryons.

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Discussion

Ici, nous montrons que les propriétés du matériau et certains paramètres biomécaniques de la cellule de jaune de œuf de poisson-zèbre durant l’épibolie peuvent être facilement estimées par l’AFM et nanoparticules microrhéologie.

Alors que l’AFM a été employé pour récupérer des caractéristiques rhéologiques des cellules et des tissus dans des conditions physiologiques4,5,25,

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent pas concurrentes d’intérêts financiers ou autres conflits d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Amayra Hernández-Vega et Philippe-Alexandre Pouille pour avoir participé à la mise en place de la base de ces protocoles. Nous remercions également la plate-forme d’imagerie moléculaire du IBMB-PCB, Xavier Esteban et de membres du laboratoire pour un soutien continu. Le programme de groupes consolidés de la Generalitat de Catalunya et la DGI et la Consolider subventions accordées par le ministère de l’économie et la compétitivité de l’Espagne à l’EMB et DN a soutenu ce travail.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microscope optique inverséNikonTE2000Visualisation de l’échantillon et de l’AFM
Microscope à force atomique (AFM)Surmesure-ToutAFM commercialisé pourrait être utilisé
Microscope confocal inverséZeissLSM780Collecte de données de nanorhéologie
Agarose D1 Low EEOConda8016.00Moulage d’embryons
Agarose LMP ultrapure (à faible point de fusion)Invitrogen16520-100Sécurisation des embryons
Poissons zèbres Moules de micro-injection et de transplantationWorld Precision InstrumentsZ-MOLDSCoulée d’embryons. Sur mesure avec les dimensions d’origine peut également être utilisé
Dumont 5 ForcepsFST11251-201,5 mm de diamètre
Si3N4 cantileverNovascanPT. GSMesure de l’embryon par AFM. Pointe sphérique : 4,5 & micro ; m diamètre et k=0,01 N/m
Nanoparticules fluorescentesTechnologiesFluoSpheres F8811,Pourle suivi nanorhéologie
Extracteur de micropipettesSutter InstrumentsP-2000Fabrication de micro-aiguilles
sur mesure Verre capillaire borosilicatéWarner InstrumentsG100TF-4Fabrication de micro-aiguilles
sur mesure MicromanipulateurNarishigeMN-153Manipulation de la micropipette
Micro-injecteurEppendorfFemtoJet ExpressContrôle du temps et de la pression d’injection
StéréomicroscopeLeicaDFC365FX Visualisation des embryons pendant l’injection
Logiciel d’analyseMathWorksMatlabAnalyse des données AFM et de suivi des particules
Poisson zèbreAB et TL de type sauvage- Souches utilisées pour la collecte d’embryons
Plaques à fond en verreMat TekP35G-0.170-14-CMontage d’embryons pour la collecte de données de nanorhéologie
Micromètre de scèneFST29025-02Mesure du volume d’injection
Life

Références

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