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Article de méthode

Mesurer les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la levure s. cerevisiae réponse à l’hypoxie

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DOI :

10.3791/56226

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10 août 2017

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1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole utilisant RNA-seq pour surveiller les niveaux d’ARNm au fil du temps au cours de la réponse à l’hypoxie des cellules de S. cerevisiae . Cette méthode peut être adaptée pour analyser l’expression des gènes au cours de toute réaction cellulaire.

Résumé

Des changements complexes dans l’expression des gènes véhiculent généralement une grande partie d’une réponse cellulaire. Chaque gène peut changer l’expression avec une cinétique unique comme le gène est régulé par l’horloge particulière de l’un des nombreux stimuli, signalisation des voies ou des effets secondaires. Afin de capturer le gène tout réponse d’expression à l’hypoxie chez la levure S. cerevisiae, RNA-seq analyse a été utilisé pour surveiller les niveaux de mRNA des gènes à des moments précis après l’exposition à l’hypoxie. L’hypoxie a été créée par la croissance de cellules de ~ 100 % N2 gaz. Ce qui est important, contrairement aux autres études hypoxiques, ergostérol et acides gras insaturés ne s’ajoutèrent aux médias parce que ces métabolites affectent l’expression des gènes. Points dans le temps ont été choisis dans la gamme 0 - 4 heures après l’hypoxie, car cette période capte les changements majeurs dans l’expression des gènes. À chaque point dans le temps logarithmique cellules hypoxiques ont rapidement filtré et congelés, limiter l’exposition au O2 et concomitant des changements dans l’expression des gènes. L’ARN total a été extrait des cellules et utilisé pour l’enrichissement d’ARNm, qui était ensuite convertie en ADNc. De cet ADNc, multiplexes bibliothèques ont été créés et huit ou plusieurs échantillons ont été séquencés dans une seule voie d’un séquenceur de prochaine génération. Un pipeline après séquençage est décrite, qui comprend le découpage de base qualité, lire la cartographie et de déterminer le nombre de lectures par gène. DESeq2 dans l’environnement de statistique R servait à identifier les gènes qui changent de façon significative à n’importe lequel des points temps hypoxique. Analyse de trois réplicats biologiques a révélé une reproductibilité élevée, gènes des cinétiques différentes et un grand nombre d’attendre O2-gènes régulés. Ces méthodes peuvent être utilisées pour étudier comment les cellules des divers organismes répondent à une hypoxie au fil du temps et adaptés pour étudier l’expression des gènes au cours d’autres réponses cellulaires.

Introduction

Nombreux organismes réagissent à l’hypoxie ou faible O2, en modifiant l’expression de gène 1,2,3. Cette réponse aide les cellules à composer avec l’absence d’un substrat essentiel pour la respiration aérobie et plusieurs réactions de biosynthèse, mais aussi avec un changement redox état 4. Plusieurs études de microarray réalisées chez S. cerevisiae montrent que les taux d’ARNm de centaines de gènes changent en réponse à l’hypoxie 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. récemment, RNA-seq a été utilisée pour caractériser les modifications de l’expression génique au fil du temps au cours de l’hypoxie 13. Ici, les détails expérimentaux sont présentés et discutés.

L’hypoxie peut être atteint de diverses façons, chacune produisant un niveau différent d’O2. Ici, l’hypoxie a été créée par coulant continuellement ultra haute pureté N2 dans les fioles, qui abaisse [O2] dissous immédiatement avec des cinétiques reproductibles 10. Il est possible qu’il y a quelques O2 molécules qui contribuent au métabolisme et l’expression génique mais cet environnement est considéré comme très proche d’anaérobie. En l’absence d’O2, cellules de levure ne peuvent biosynthétiser hème, ergostérol et acides gras insaturés 4,12,14. Ainsi, des études antérieures ont inclus ces métabolites dans la culture de levure sans oxygène 5,10,15. Cependant, les nombreuses réponses hypoxiques sont médiés par l’épuisement de ces métabolites et ainsi reconstituer les renverse le gène hypoxique expression réponses 12,16. Afin d’imiter l’hypoxie naturel, ces métabolites n’ont pas été ajoutés à la presse. Le temps que les cellules ont été exposées à une hypoxie sans la présence de ces métabolites essentiels, il n’y avait aucune augmentation notable de la mort cellulaire (données non présentées), ni un stress prolongé réponse 13.

La réponse est également dépendante de la souche et son génotype. Les allèles des régulateurs connus des réponses hypoxiques 2sont particulièrement importants. L’arrière-plan de souche S288C est hautement souhaitée afin que les résultats peuvent être comparés aux autres études génomiques effectuées avec cette souche. Cependant, S288C contient un allèle de perte de fonction partiel des HAP1 gène 17, un régulateur transcriptionnel critique pour la réponse à l’hypoxie. Cet allèle a été réparé en S288C à l’aide d’un type sauvage la copie de la Σ1278b souche fond 11.

L’expression des gènes dépend fortement de l’environnement cellulaire. Ainsi, lorsque vous effectuez l’analyse d’ADN messagère de Génome-large, il est important de maintenir un environnement constant tout en variant d’un autre paramètre comme temps, relance ou génotype. Pour obtenir des résultats très reproductibles, considérer ces trois pratiques pour l’étude et tous ses réplicats biologiques ou techniques. Tout d’abord, la même experimenter(s) doit réaliser l’étude, étant donné que les pratiques techniques peuvent varient selon les expérimentateurs. En second lieu, le même lot d’ingrédients devrait servir dans les milieux de culture chaque lot a une composition légèrement différente qui peut affecter l’expression des gènes. Troisièmement, pour minimiser les effets du cycle cellulaire, chaque instant doit provenir des cellules asynchrones dans la phase logarithmique de croissance (1-2 x 107 cellules/mL).

Lorsque caractérisant une réponse complexe comme la réponse d’expression de gène à l’hypoxie, une évolution temporelle est avantageuse pour la détermination de la cinétique de divers événements. Des moments spécifiques doivent être choisis qui saisiront les changements majeurs de la réponse. Dans cette étude, les points dans le temps entre 0 et 4 h ont été observées, parce que les expériences passées ont révélé des changements très répandues dans l’expression des gènes au cours de cette période, 13.

Pour mesurer l’expression génétique global, RNA-seq a été utilisé 18,19. Cette méthode utilise le séquençage de prochaine génération pour déterminer l’abondance relative de transcription de chaque gène. Par rapport à l’analyse ADN microarray, RNA-seq présente une sensibilité plus élevée (pour détecter les transcriptions moins abondantes), une plus grande gamme dynamique (pour mesurer des changements plus importants le pli) et une reproductibilité supérieure (à fidèlement suivre l’expression des gènes au fil du temps). En règle générale, l’ARN cellulaire plus est ARN ribosomique tant de méthodes ont été développées afin d’enrichir pour spécifique RNA espèces 20. Ici, les perles de poly-T ont été utilisés pour purifier transcriptions d’ARNm contenant du poly-A, bien que les différents dans le commerce - kits de déplétion des ARNr disponibles pourraient également être efficaces pour l’enrichissement de l’ARNm.

Ici, la réponse d’expression de gène de S. cerevisiae à l’hypoxie a été caractérisée. Les cellules ont été exposés à une hypoxie et puis échantillonnés à huit points dans le temps (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 et 240 min). Pour confirmer la reproductibilité et de définir les transcriptions statistiquement modifiées, trois réplicats biologiques ont été effectuées. ARN a été extrait par rupture mécanique et de la purification de la colonne et ensuite traitée pour l’analyse de la RNA-seq. Le pipeline après séquençage est décrit et scripts de programmation sont fournies qui permettent la réplication exacte des analyses effectuées. Plus précisément, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, l’environnement statistique R 24et le DESeq2 le paquet de 25 ont été utilisés pour traiter les données de RNA-seq et d’identifier des 607 gènes qui changent de façon significative au cours de hypoxie. Analyse en composantes principales (ACP) et l’expression génique des répliques, a indiqué la reproductibilité de la technique. Clustering et heatmaps révèle cinétique d’expression de grande envergure, tandis que gene ontology (aller) analyse a montré que de nombreux processus cellulaires, comme la respiration aérobie, sont enrichis dans l’ensemble des gènes régulés par l’oxygène.

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Protocole

1. induisant hypoxie

  1. Un jour ou plus avant l’évolution temporelle de l’hypoxie : préparer l’incubateur, cellule de filtrage système, vide, réservoir d’essence, flacons, bouchons, verre étiré et tubes, comme dans la Table des matières.
  2. Char2 place N, incubateur, vide et système à proximité, pour permettre le traitement rapide des cellules de filtrage.
  3. Préparer milieu YPD liquide stérile (1 %, extrait de levure, peptone de 2 %, 2 % de glucose) en mélangeant les composants dans une bouteille en verre et le passage à l’autoclave.
  4. Plan de mise en page des flacons dans l’incubateur.
    NOTE : Le réservoir de2 N, le premier ballon sera un piège à eau, la deuxième fiole sera le dernier point de temps, la troisième fiole sera le point de la deuxième à la dernière heure et ainsi de suite jusqu’au dernier ballon qui est un piège à eau finale. La figure 1 montre l’ordre et les connexions entre les flacons.
  5. La veille de l’évolution temporelle, ensemencer une colonie de levures dans une culture de 5 mL de liquide la DPJ dans un tube stérile. Plus précisément, de ramasser une colonie complète d’une plaque à l’aide d’un écouvillon stérile. Placer le bâton dans le YPD liquide et agiter le bâton jusqu'à ce que la plupart des cellules est en suspension.
  6. Faire pivoter les tubes à 30 ° C pendant la nuit (~ 16 h).
    Remarque : Après 16 h, les cellules de type sauvage atteindra saturation (~ 2 x 108 cellules/mL), indiquée par une culture très nuageuse. Autres souches peuvent prendre plus de temps pour atteindre la saturation et doivent être testés en mesurant la concentration cellulaire avec un spectrophotomètre, comme indiqué dans l’étape 1.9.4.
  7. Le jour de l’évolution temporelle, après 16 heures d’incubation, diluer la culture saturée 01:50 à l’aide d’une pipette de 5 mL au lieu de 4 mL de nuit culture dans 196 mL de YPD liquide dans un flacon stérile de 500 mL. Grandir avec la secousse à ~ 200 tr/min pendant 4 h à 30 ° C.
    Remarque : Après 4 h, une culture de type sauvage atteindra une concentration logarithmique de ~ 1-2 x 107 cellules/mL.
  8. Durant le 4 h d’incubation, étiqueter les flacons (pour les pièges de l’hypoxie et de l’eau) et les 50 mL tubes de prélèvement. Si l’incubateur à l’étape 1.7 ci-dessus n’est pas utilisé pendant le décours temporel de l’hypoxie, allumez l’autre incubateur et réglé à 30 ° C.
  9. Juste avant de le soumettre les cellules à l’hypoxie :
    1. Ajouter environ 50 mL d’eau à deux des flacons stériles 250 mL qui serviront comme les pièges de l’eau.
    2. Remplir 1/3 d’une glace seau avec de l’azote liquide et submerger un support de polystyrène expansé pour tenir les tubes à centrifuger 50 mL.
    3. Mettre en place le système de filtration pour prélever des cellules. Ajouter un disque de filtre stérile sur l’unité de fond du système de filtration stérile pince à épiler, en prenant soin de seulement toucher les bords du disque filtre. Placez l’unité sur l’unité de fond filtre filtre et fixer avec les colliers de fixation fournis avec le système. S’assurer que les unités supérieures et inférieures sont alignées afin qu’il y a un joint étanche et aucune fuite.
    4. Mesurer la concentration en cellules avec un spectrophotomètre. Diluer les cellules afin qu’ils peuvent être mesurés dans la gamme linéaire du spectrophotomètre – OD600 entre ~0.2 - 0,6, selon le spectrophotomètre.
      Remarque : Une unité de600 OD est ~ 3 x 107 cellules/mL, selon la morphologie cellulaire et spectrophotomètre. Une concentration de ~ 1-2 x 107 cellules/mL est attendue, correspondant à l’OD600 de ~0.33 - 0,66.
    5. Obtenir rapidement l’échantillon de temps 0.
      1. Connectez le système de filtre à un vide de fort (~ 10 mbar) via le tuyau à vide et un piège de flacon de 1000 mL. Allumez l’aspirateur. Faire couler la culture (habituellement environ 20 mL) dans le haut de la page et attendre pour liquide à être tiré à travers le filtre (~ 10 s, en fonction sur la force du vide).
      2. Avec précaution, retirez le disque de filtre avec la pince à épiler propre et placer dans un tube à centrifuger 50 mL. Placer immédiatement le tube à centrifuger dans le rack immergé dans l’azote liquide. Ce qui est important, ne pas préalablement Faites refroidir les tubes avant d’insérer le filtre car les tubes exploserait.
      3. Après > 30 s, place le tube dans un congélateur-80 ° C pour l’extraction de l’ARN plus tard. Après chaque filtration, nettoyer et remonter le système de filtre. Rincer le système de tirant d’eau à travers pour 10 s sans un disque filtrant. Enfin, essuyez le système avec une serviette en papier.
    6. Diluer la culture 4 h dans des fioles différents pour les différents points dans le temps, afin que chaque fiole atteigne la concentration logarithmique (~ 1-2 x 107 cellules/mL) au point heure indiquée d’hypoxie.
      Remarque : Le tableau 1 montre les dilutions qui servaient à la souche haploïde S288C HAP1+ de type sauvage. Il est recommandé de tester chaque souche dans ces conditions de culture hypoxique et ajuster les dilutions en conséquence.
    7. Une fois que les cellules et les médias sont ajoutés pour flacons, remplacer le papier d’aluminium couvrant la fiole d’ouverture fermée par un bouchon contenant deux tubes de verre insérés.
    8. Placer les flacons dans l’incubateur dans la layout déterminé plus tôt.
    9. Connecter en toute sécurité le tuyau tel qu’illustré à la Figure 1.
    10. Vérifiez que tous les bouchons sont bien poussé dans les ouvertures de la fiole.
  10. Au temps 0, ouvrir la soupape de régulation. Réglez ensuite le débitmètre à 3 L/min.
    NOTE : Bulles seront observées dans les deux ballons d’eau, indiquant le débit de gaz approprié. Si ce n’est pas le cas, vérifiez que tous les bouchons sont serrées et le tube est correctement attaché.
  11. Fermez l’incubateur et régler la vitesse d’agitation à ~ 200 tr/min. Démarrer un minuteur.
  12. Avant chaque point dans le temps, mis en place le système de filtration comme décrit ci-dessus dans l’étape 1.9.3.
  13. À chaque moment (p. ex., 5 min, 10 min, etc.), ont deux personnes capables de traiter rapidement les cellules comme suit :
    1. Première personne : enlever le ballon approprié du support et retirez le bouchon (avec verre étiré de joint).
      Remarque : Cela ne cassera pas le flux de N2 à tout les autres flacons de culture mais interrompt temporairement le débit pour le dernier casier de l’eau.
    2. La seconde personne : pipette 1 mL de culture et diluer dans une cuvette. Rebrancher le tuyau du flacon de culture qui est maintenant à la fin de la ligne du dernier piège à eau (un tube et un bouchon sera supprimée dans le processus.). Ensuite, mesurer la concentration cellulaire dans la cuve, comme indiqué ci-dessus au point 1.9.4.
    3. Première personne : Versez le reste de la culture dans le système de filtration sous vide et ensuite effectuer le filtrage et la congélation comme décrit ci-dessus à l’étape 1.9.5.
  14. Lorsque vous avez terminé avec tous les points dans le temps, éteignez le gaz de2 N. Fermez d’abord le régulateur et attendre que la pression libérer puis éteignez le débitmètre. Enfin, démonter le système et nettoyer tout le matériel avec l’eau, puis de l’éthanol à 70 %.

2. Extraction de l’ARN

  1. Préparer le tampon RLT pour la purification de RNA de colonne, tel que décrit dans la Table des matières.
  2. Préparer une solution de DNase en ajoutant 10 µL de la solution mère de DNase à 70 µL de tampon de RDD par échantillon (voir Table des matières).
  3. Retirer les tubes de 50 mL contenant des filtres et des cellules du congélateur à-80 ° C et placez sur la glace pour décongeler (~ 15 min). Effectuez les opérations suivantes avec des tubes sur la glace.
  4. Label 2 mL tubes à bouchon vissé et placez-les sur la glace, un tube pour chaque échantillon. Ajouter ~0.6 mL de perles lavé à l’acide dans chaque tube, en utilisant un tube de microtubes de 1,5 mL à ramasser et à mesurer les perles.
  5. Ajouter 0,6 mL de tampon RLT froid aux tubes de 50 mL.
  6. Pipette de haut en bas pour enlever les cellules du filtre et dans la solution. Évitez de laisser le filtre reste dans la solution, tel que le filtre s’imprégner de la solution. Enlever toute la solution absorbée dans le filtre à l’aide de l’embout de la pipette à serrer le filtre contre la paroi du tube.
  7. Transférer la totalité du liquide dans le tube de 50 mL aux tubes à bouchon vissé contenant des perles.
  8. Placer les tubes d’un bouchon qui visse dans un homogénéisateur de moulin de perle et exécuter pour un min.
    Placer immédiatement les tubes sur la glace pendant trois minutes. Encore une fois, placer les tubes dans l’homogénéisateur et exécuter pour un min.
  9. Retirer les tubes de l’homogénéisateur et le déposer sur la glace pendant 5 min. Les perles seront déposent au fond des tubes.
  10. Effectuer le reste des étapes à la température ambiante.
  11. Avec une pipette, transférer seulement le lysat (~ 350 µL), évitant les perles, dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.
  12. Micro-centrifugeuse pendant 2 min à vitesse maximum et le transfert puis le surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.
  13. Ajouter 1 volume d’éthanol à 70 % (fait partir de 200 preuve biologie moléculaire-éthanol). Mélangez bien en pipettant également.
  14. Transférer la solution et aucun précipité dans une colonne de RNA qui a été placée à l’intérieur d’un tube de prélèvement de 2 mL.
  15. Centrifuger pendant 15 s à ≥12, 000 x g et jeter les intermédiaires (le liquide dans le tube).
  16. Ajouter 350 µL de tampon RW1 à la colonne. Centrifuger pendant 15 s à ≥12, 000 x g et jeter le cheminement.
  17. Ajouter 80 µL DNase je mélange de l’incubation à la membrane de la colonne (ne vous pas sur les côtés du tube) et laisser pour reposer pendant 15 minutes.
  18. Ajouter 350 µL de tampon RW1 à colonne. Microtubes pour 15 s à ≥12, 000 x g et jeter le cheminement.
  19. Ajouter 500 µL de tampon RPE à la colonne. Accréditives microcentrifugeuse pour 15 s à ≥12, 000 x g et jetez-la.
  20. Ajouter 500 µL de tampon RPE à la colonne. Micro-centrifugeuse pendant 2 min à ≥12, 000 x g.
  21. Retirez la colonne doucement et placer dans un nouveau tube de prélèvement de 2 mL. Microcentrifugeuse à pleine vitesse pendant 1 minute (pour sécher complètement la membrane).
  22. Jeter le tube de prélèvement et placer la colonne dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Ajouter 30 µL d’eau exempte de RNase à la membrane de la colonne.
  23. Éluer l’ARN de la colonne en microcentrifuging pendant 1 min à ≥12, 000 x g. Lorsque vous chargez les colonnes dans la microcentrifugeuse, assurez-vous que les couvercles de la tube de prélèvement sont orientés dans le sens de la centrifugeuse tourne, pour empêcher les couvercles rupture.
  24. Ajouter un autre 30 µL d’eau exempte de RNase à la membrane de la colonne, tout en gardant la colonne dans le même tube de microcentrifuge.
  25. Micro-centrifugeuse pendant 1 min à ≥12, 000 x g, alors que le volume de l’éluat final est 60 µL.
  26. Stocker chaque tube de 1,5 mL contenant 60 µL d’ARN dans le congélateur à-80 ° C.

3. déterminer la qualité et la Concentration d’ARN

  1. Mesurer la concentration d’ARN et d’ADN dans chaque échantillon de RNA, utilisent un fluorimètre, colorants (b) DNA-RNA-spécifiques et fluorescents et tubes de dosage (c) énumérés dans la Table des matières. Suivez les instructions de la fluorimètre et les colorants.
  2. Vous pouvez également mesurer la concentration de l’acide nucléique avec un spectrophotomètre UV fixé à 260 nm.
    Remarque : Une lecture de260 A 1.0 équivaut à ARN simple brin de ~ 40 µg/mL.
  3. Tester la qualité de RNA en exécutant l’ARN sur un analyseur d’acide nucléique commercial (voir Table des matières) ou sur un standard de formaldéhyde/agarose gel 26.

4. RNA-seq analyse

  1. Le stock total de RNA, représentent 21 µL de 100 ng/µL RNA dans de l’eau exempte de RNase. Utilisez 1 µL de cette 21 µL pour tester la concentration d’ARN comme ci-dessus. Soumettre l’ARN total restant 20 µL (2 µg) à un centre de séquençage externe pour l’enrichissement de l’ARNm, préparation de la bibliothèque spécifique à strand (avec huit ou plus des codes à barres pour le multiplexage) et de séquençage (voir Table des matières). Alternativement, localement effectuer d’enrichissement de l’ARNm et préparation de la bibliothèque et puis soumettre la bibliothèque pour l’ordonnancement.
  2. Piscine huit ou plus multiplexé d’échantillons et de séquence dans une seule voie d’un séquenceur de prochaine génération.
  3. Télécharger le fichier FASTQ qui contient tous les lectures de séquence et lit l’index correspondant. En outre, téléchargez le fichier texte contenant les codes à barres multiplex.
    Remarque : Les lectures d’index peuvent être présents dans un fichier distinct de FASTQ. Placer tous ces fichiers dans un répertoire.
  4. Placez le script fourni ici, « fastq_pipeline.sh », dans le même répertoire. Modifiez ce script en fonction de l’expérience et les répertoires de l’ordinateur.
    NOTE : ce script contient des annotations expliquant les étapes. En bref, la qualité du script supprime les lectures, mappe les lectures sur le génome et génère un fichier délimité par des tabulations qui contient le nombre de lectures par gène pour chaque échantillon.
  5. Déposer les fichiers FASTQ et les données brutes comte lire dans Gene Expression Omnibus du NCBI avant publication 27. Suivez les instructions pour « Soumettre les données high-throughput séquence vers GEO » : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. Importer les données de lecture comte dans l’environnement de statistique R et effectuer une analyse statistique, en utilisant le script R fourni ici, « time_course_script. R ». Modifiez ce script en fonction de l’expérience et les répertoires de l’ordinateur.
    NOTE : Ce script contient des annotations expliquant les étapes. En bref, ce script importe les données lues, normalise les lectures, identifie les gènes qui changent de façon significative au cours du temps, effectue l’analyse PCA et graphique de l’expression de certains gènes.

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Résultats

L’évolution temporelle de l’hypoxie et l’analyse de la RNA-seq effectuées indépendamment de trois fois. Afin d’étudier la reproductibilité des trois répliques, données d’expression pour tous les gènes a été analysées à l’aide de l’analyse en composantes principales (ACP). La figure 2 montre comment les échantillons changent pendant les deux premières composantes principales, qui représentent 58,9 % de la variabilité. Cette analyse a révélé que chaque évolutio...

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Discussion

Dans cette étude, les taux d’ARNm pour tous les gènes a été mesurée au cours de l’hypoxie dans la levure S. cerevisiae. Le but était d’analyser les modifications de l’expression génique comment global en raison de la croissance dans un environnement contrôlé de près-anoxiques. Plusieurs mesures ont été prises pour s’assurer que la méthode décrite ici a été soigneusement contrôlées et reproductibles. Tout d’abord, les cellules sont exposées à un milieu hypoxique précisément défini : 99,999 % N2 en rich...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions l’Institut Lewis-Sigler Integrative Genomics séquençage Core Facility à l’Université de Princeton pour des conseils techniques et séquençage et préparation de bibliothèque d’ARN. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Université Rowan et NIH NIGM R15GM113187 à M.J.H.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Incubateur sec ferméThermo ScientificMaxQ 4000Réglé à 30 °C. Modifiez la porte pour permettre l’entrée d’un tube Tygon. Vous pouvez également utiliser l’incubateur G25 du Nouveau-Brunswick, qui contient un port tubulaire. N’utilisez pas d’agitateur d’eau à ciel ouvert, car la condensation s’accumulera dans les tubes entre les flacons, ce qui pourrait contaminer les cultures.
Micro-analyse Porte-filtreMilliporeXX100253025 mm de diamètre, support en acier inoxydable, n° 5 bouchons en silicone perforé Supports dans un flacon filtrant standard de 125 mL
Vide puissantEdwardsE-LAB 2Le " maison" Le vide est peut-être trop faible. Vous pouvez également utiliser une pompe à vide portable électrique comme celle indiquée ici.
1 000 mLPour servir de piège à vide.
~ 2 longueurs de pied de tube à vide à paroi épaisse, diamètre intérieur 3/8 po, diamètre extérieur 7/8 poTygon38TTDeux pièces : la première connecte l’aspirateur au piège et la seconde relie le piège au système de filtration.
de gaz N2 haute pressiond’une pureté de 99,999 %, >1 000 psi, avec un régulateur et un régulateur de débit de gaz
FlaconOuverture recouverte d’une feuille d’aluminium. Un pour chaque souche de levure.
autoclavées de 250 mLOuvertures recouvertes d’une feuille d’aluminium. Un pour chaque point temporel plus deux pour les pièges à eau.
Bouchons de flacons (taille 6, deux trous de 5 mm de diamètre)Stérilisé à l’éthanol à 70 %. Un pour chaque flacon.
Tube en verre, longueur 9 cm ou 17 cm, diamètre intérieur 2 mm, diamètre extérieur 5 mmStérilisé à 70 % d’éthanol. Deux tubes pour chaque flacon. Placer dans les trous de chaque bouchon. Voir la figure 1 pour l’emplacement des tubes de 9 et 17 cm.
~25 cm de longueur de tube en plastique, diamètre intérieur 5 mmTygonE-3603Une pièce pour chaque flacon. Stérilisé à 70 % d’éthanol.
Disques filtrants stérilesMilliporeHAWP0250025 mm de diamètre, 0,45 & micro ; m taille des pores, une pour chaque point temporel
Stérile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettesPour mesurer la DO 600 (c’est-à-dire la concentration cellulaire)
50 mL TubesUn pour chaque point temporel
Pince à épiler propre et stérile
AzotePour la congélation des cellules
billes lavées à l’acideSigmaG8772Conserver à 4 ° ; C pour lyser les cellules
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104Pour la purification de la colonne d’ARN
Tampon Qiagen RLT Prépareren ajoutant 10 µ ; L de &bêta-Mercaptoéthanol pour 1 mL de tampon RLT, maintenir à 4 &°C.
Tubes de prélèvement de 2 mLQiageninclus dans le Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPEQiageninclus dans le Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1Qiageninclus dans le Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock et solutions de travailQiagen79254L’enzyme DNase I se présente sous forme de poudre lyophilisée dans un flacon en verre. À l’aide d’une aiguille et d’une seringue stériles, injecter 550 & ; micro ; L d’eau sans RNase (fournie dans le kit Qiagen) dans le flacon. Mélangez en retournant doucement le flacon. Pour éviter de dénaturer l’enzyme, ne faites pas de vortex. À l’aide d’une pipette, prélever cette solution mère du flacon et la conserver au congélateur (-20 ° ; C) dans les aliquotes à usage unique (80 & micro ; L chacun). La solution mère ne doit pas être décongelée et recongelée.
Tampon RDDQiageninclus dans le kit Qiagen DNase
TubesPour lyser les cellules lors de l’extraction de l’ARN
broyeur à billes homogénéisateurBiospec Mini-Beadbeater-24112011Conserver en chambre froide
Bacto PeptoneBDDF0118pour milieu liquide YPD
Extrait de levure BactoBDDF0886pour liquide Milieu YPD
glucoseFisherD16pour milieu liquide YPD
Tubes de dosage QubitThermo FisherQ32856pour la mesure de la concentration d’acide nucléique
Quant-iTTM dsDNA BR Kit de dosageThermo FisherQ32853pour la mesure de la concentration d’acide nucléique
Quant-iTTM Kit de dosage d’ARNThermo FisherQ32855pour la mesure de la concentration d’acide nucléique
Fluorimètre QubitThermo FisherQ33216pour la mesure de la concentration d’acide nucléique
Système d’électrophorèse commercialAgilentBioanalyzer 2100pour la mesure de la qualité des acides nucléiques
Séquenceur de nouvelle générationIlluminaHiSeq 2500pour les bibliothèques de séquençage
automatisé de manipulation des liquidesWafergenApollo 324pour la création Banques de séquençage
Kit d’isolement de l’ARNm PrepX PolyAWafergen400047pour isoler l’ARNm de l’ARN total
Kit de 400039 de l’ARN PrepX pour Illuminaséquençage Wafergen pour la création de banques de séquençage spécifiques à un brin à partir d’un répartiteur
de codes-barres d’ARN totalhttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, qui inclut la commandehttp://www.htslib.org/download/
Trimmomatichttp://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installée avant TopHat)http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHathttps://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeqhttp://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installé avant R Studio)https://cran.rstudio.com
R Studio (version gratuite)https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Fiole de Réservoir autoclavé de 500 mL Fioles à centrifuger stériles liquide à bouchon à vis de 2 mL glacés Système Kit de gzip

Références

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106(2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13(2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

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