Nous démontrons une technologie de puce snap pour effectuer des tests immunologiques reactivity-free multiplexée "sandwich" le simplement claquer deux diapositives. Un appareil à pression est utilisé pour le transfert fiable des réactifs de microarray-aux-puces. La puce du composant logiciel enfichable peut être utilisée pour des réactions biochimiques nécessitant une colocalisation des différents réactifs sans contamination croisée.
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Article de méthode
Enclenchez la puce pour les immunoessais de Cross-reactivity-libre et exempt de Spotter multiplexée "sandwich"
Dans cet article
Résumé
Résumé
Analyse des protéines multiplexé a montré la sensibilité diagnostique supérieure et la précision par rapport aux protéines simples. Microarrays d’anticorps permettent depuis des milliers d’immunoessais micro-échelle réalisées simultanément sur une seule puce. Format de dosage "sandwich" améliore la spécificité de dosage en détectant chaque cible avec deux anticorps, mais souffre d’une réactivité croisée entre les réactifs limitant ainsi leurs capacités de multiplexage. Anticorps colocalisation microarray (ACM) a été développé pour la détection de protéines multiplexé cross-reactivity-libre, mais requiert un pareur cher sur place pour la fabrication de puces lors des essais. Dans ce travail, nous démontrons une technologie de puce de composant logiciel enfichable qui transfère le réactif de microarray-aux-puces de simplement claquer deux puces ensemble, que donc aucun pareur n’est nécessaire au cours de l’incubation de l’échantillon et la demande ultérieure d’anticorps de détection (dAbs) sur stockage de diapositives pré tachetés, se dissociant de la préparation de l’exécution de test. Les deux méthodes de transfert de simples et doubles sont présentés pour parvenir à un alignement précis entre les deux puces à ADN et la fabrication de diapositives pour les deux méthodes sont décrites. Les résultats montrent que < 40 μm alignement a été réalisé avec le double transfert, pour atteindre une densité de tableau de 625 points/cm2. Un test immunologique 50-plexed a été mené pour démontrer la facilité d’utilisation de la puce de composant logiciel enfichable dans l’analyse des protéines multiplexé. Limites de détection des 35 protéines sont dans la gamme de pg/mL.
Introduction
Un panel de biomarqueurs comprenant plusieurs protéines peut fournir plus de sensibilité et de spécificité qu’un biomarqueur unique pour le diagnostic de maladies complexes telles que les cancers1,2. Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) a été l’étalon-or technologie utilisée dans les laboratoires cliniques, atteindre une limite de détection à faible pg/mL dans le plasma, mais les limites à une cible par dosage3,4,5. Microarrays d’anticorps ont été conçus pour accueillir des milliers de tests miniaturisés effectuées en....
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Protocole
1. fabrication et le stockage de snap copeaux
- méthode de transfert unique ( Figure 1 a)
- Spot cAb solutions contenant des 400 anticorps µg/mL et 20 % de glycérol dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur une nitrocellulose (ou un verre fonctionnalisé) lame de test avec un jet d’encre/spotter microarray 13 à une humidité relative de 60 % (1,2 nL pour chaque tache) avec 800 µm--entraxe. Assurez-vous que la lame est fixée sur le pont de spotter selon un angle (ici, le coin inférieur gauche a été utilisé).
- Incuber la lame de test tacheté à température ambiante pendant 1 h a....
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Résultats
Le mode OPERATOIRE pour les single et double les méthodes de transfert est illustré à la Figure 1. Dans le simple transfert, les cabines sont repérés directement sur la diapositive de dosage et les touches sont transférés sur le toboggan de dosage à utiliser dans un modèle de miroir de la cabine (Figure 1 a). Procédure de transfert qu’un seul est nécessaire, mais cette méthode souffre de défauts d’alignement entre les deux puces,.......
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Discussion
Dans ce travail, nous avons présenté une technologie de puce de clin d’oeil qui rend les immunoessais cross-reactivity-libre multiplexes largement disponibles pour les chercheurs avec base montage expérimental. Différent des puces à anticorps existant, aucun observateur « microarray » n’est nécessaire pour les utilisateurs finaux. Les single et double les méthodes de transfert sont démontrés, et double transfert offre précision d’alignement supérieur vers le bas pour ~ 40 μm pour les taches de 98 %, avec le plus grand dé.......
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Déclarations de divulgation
L’Université McGill a déposé une demande de brevet sur certains aspects de ce travail avec Huiyan Li et David Juncker comme inventeurs.
Remerciements
Nous remercions le Dr Rob Sladek pour l’utilisation de la longue-vue de jet d’encre. Nous reconnaissons le support final des instituts de recherche en santé (ICRS), sciences naturelles et génie conseil recherche du Canada (CRSNG), l’Institut canadien de la recherche sur les société de Cancers et la Fondation canadienne pour l’Innovation (FCI). D.J. Merci de soutien d’une Chaire de recherche du Canada.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Comprimé de solution saline tamponnée au phosphate | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Cy5 conjugué à la streptavidine | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Albumine sérique bovine | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycérol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Solution de blocage : StabilGuard Choice Microarray Stabiliser sans BSA | SurModics, Inc | SG02 | |
| Lames revêtues de nitrocellulose | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| lames revêtues d’aminosilique | Schott Amérique du Nord | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Détecteur de microréseaux à jet d’encre | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Joint de module | de lames Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Perles de stabilisation d’humidité | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Logiciel d’analyse Array-Pro | Média Cybernétique | Version 4.5 | |
| Scanner de microréseaux à fluorescence | Agilent | SureScan Scanner de microréseaux Logiciel | |
| de biostatistique | Logiciel GraphPad GraphPad | Prism 6 | |
| Capture d’endogline anticorps | R& D Systems | MAB10972 | |
| Protéine d’endogline | R& D Systems | 1097-FR | |
| Détection d’endogline Anticorps | R& D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (voir tableau 1) | R& D Systems | ||
| IL-6b (voir tableau 1) | Invitrogen |
Références
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al.
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Réimpressions et autorisations
