Technique mini-Invasive transversal constriction aortique chez les souris pour l’Induction de l’hypertrophie ventriculaire gauche

Résumé

Le but du présent protocole est de décrire étape par étape la technique de constriction aortique transversale peu invasive (TAC) chez la souris. Par élimination d’intubation et ventilation obligatoires pour la procédure standard couramment utilisée, TAC minimalement invasive simplifie l’intervention chirurgicale et réduit l’exercée sur l’animal.

Résumé

Constriction aortique transversale (TAC) chez la souris est l’un, des techniques chirurgicales plus couramment utilisés pour l’étude expérimentale de la pression induite par la surcharge laissé hypertrophie ventriculaire (HVG) et sa progression de l’insuffisance cardiaque. Dans la plupart des études rapportées, cette procédure est exécutée avec intubation et ventilation de l’animal qui le rend exigeante et beaucoup de temps et ajoute à la charge chirurgicale de l’animal. Ce protocole vise à décrire une technique simplifiée de TAC mini-invasive sans intubation et ventilation des souris. Les étapes critiques de la technique sont privilégiés afin d’atteindre une mortalité faible et une grande efficacité dans l’induction de HVG.

Les souris C57BL/6 mâles (âgés de 10 semaines, 25 à 30 g, n = 60) ont été anesthésiés avec une seule injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine et de xylazine. Dans une respiration spontanée animal suivant une sternotomie partielle supérieure de 3 à 4 mm, un segment de suture de soie 6/0 enfilée à travers le œil d’une prothèse de la ligature a été passa sous l’arc aortique et rattacher sur une aiguille de calibre 27 émoussée. Les animaux opérés ont subi la même préparation chirurgicale mais sans rétrécissement aortique. L’efficacité de la procédure dans l’induction de LVH est attestée par une augmentation significative du ratio de poids du coeur/corps. Ce ratio est obtenu au jour 3, 7, 14 et 28 après chirurgie (n = 6-10 dans chaque groupe et chaque point dans le temps). Grâce à notre technique, LVH est observée chez TAC par rapport aux animaux de l’imposture du jour 7 au jour 28. Du dispositif et à la fin (plus de 28 jours) mortalités sont tous les deux très bas à 1,7 %.

En conclusion, notre technique rentable du TAC minimalement invasive chez les souris porte très faible mortalité opératoire et post-opératoire et est très efficace pour induire l’HVG. Il simplifie l’intervention chirurgicale et réduit l’exercée sur l’animal. Elle peut être facilement réalisée en suivant les étapes essentielles décrites dans le présent protocole.

Introduction

Durant les dernières années, l’étude de l’insuffisance cardiaque a été menée dans animal viable les modèles¹. Par rapport aux grands modèles animaux de l’insuffisance cardiaque, petits modèles animaux ont de nombreux avantages potentiels. À côté de la réduction des coûts du logement et de la maintenance, petits modèles animaux sont accessibles à davantage de chercheurs en raison de la moins complexe d’installations nécessaires².

Insuffisance cardiaque murin offre bon nombre des mêmes avantages que les modèles de rat. En outre, réduit à un logement coûte³, souris modèles bénéficient de la disponibilité des souches de le pertinents transgéniques et knock-out (KO). La possibilité de cellule spécifique au type, inductible KO ou stratégies transgéniques font la souris un outil précieux pour l’étude de la pathogenèse de l’insuffisance cardiaque et de tenter d’identifier les nouveaux régimes thérapeutiques³.

Chez la souris de l’insuffisance cardiaque, les modèles actuellement utilisés⁴, constriction aortique transversale (TAC), qui a été décrite par Rockman⁵ est le modèle préféré pour générer la pression induite par la surcharge hypertrophie ventriculaire gauche (HVG)^{1 , 3}. le plus grand avantage de ce modèle est la capacité de permettre la stratification de l’HVG², bien que le ventricule gauche transformant en réponse au TAC est variable chez les souches de souris différents. En particulier, des souris C57BL/6 développent une dilatation rapide LV après un TAC qui ne peut pas se produire avec d’autres souches^4,6,7.

L’apparition soudaine de l’hypertension artérielle atteint avec TAC causes un environ augmentation de 50 % en masse de LV dans les 2 semaines, ce qui permet d’examiner rapidement l’activité des interventions pharmacologiques ou moléculaires visant à moduler le développement de l’HVG⁴. L’induction aiguë d’hypertension artérielle sévère par la TAC ne reproduit pas exactement l’hypertrophie ventriculaire gauche progressiste et remodelage observés en milieu clinique de sténose aortique ou hypertension artérielle. Néanmoins, ce modèle est utilisé par de nombreux chercheurs pour identifier et modifier les nouvelles cibles thérapeutiques dans l’insuffisance cardiaque⁴.

TAC chez les souris requiert une plus grande expertise chirurgicale que celle requise pour les autres techniques utilisées pour induire l’HVG et ultérieures insuffisance cardiaque². La plupart des auteurs exécutez cette procédure d’intubation et la ventilation de l’animal^2,8, qui rend cette procédure plus exigeants et chronophage et ajoute à la charge chirurgicale de l’animal. Seulement quelques chercheurs ont utilisé des TAC minimalement invasive dans leur étude avec une brève référence à l’intervention chirurgicale^9,10,11.

Le but du présent protocole est de décrire étape par étape une technique simplifiée et facile à utiliser de mini-invasive transversale constriction aortique chez les souris, mettant en évidence les étapes cruciales de la procédure. En suivant ces étapes clés, on peut facilement réaliser cette technique.

Protocole

souris mâles C57BL/6J (10 semaines, 25 à 30g, n = 60) sont utilisés dans le présent protocole. Animaux reçoit des soins compatissants conformément aux directives formulées par le Ministère Français de l’Agriculture et de l’enseignement supérieur et de la recherche, et toutes les procédures sont effectuées conformément à la Directive européenne du Conseil communautaire du 24 novembre 1986 () 86/609/CEE) et les lois Français. Le protocole a été approuvé par le " Comité régional d’éthique pour Animal Experimentation CREMEAS " (#2016092816207606).

1. préparation pour la chirurgie

1. maintenir les souris pendant une semaine après l’arrivée dans l’animalerie pour un cycle lumière/obscurité de 12h / 12h, dans des cages standards, avec de la nourriture (pour les détails, voir la Table des matières) et de l’eau disponible ad libitum.
2. Le jour de l’opération, placez les souris dans des cages individuelles quelques minutes avant l’induction de l’anesthésie, afin d’éviter tout stress supplémentaire à l’animal. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, la veille de la chirurgie.
3. Injection intra-peritoneally une dose unique d’un mélange de kétamine (51,4 mg/kg) et de xylazine (3,3 mg/kg) diluée dans du sérum physiologique (0,9 % NaCl).
4. S’assurer de la profondeur de l’anesthésie par l’absence du réflexe orteil-retraite.
5. Raser le cou et la poitrine de l’animal avec un rasoir commercialement disponible et désinfecter la zone rasée avec alcool à 70 %.
6. Placer l’animal en position couchée sur un tapis de travail propre Liège et fixer les pattes avec du ruban adhésif.

2. Chirurgie

1. technique chirurgicale stérile est utilisé tout au long de la procédure. Dans une respiration spontanément animal, effectuer une incision cervicale médiane longitudinale supérieure à 10 mm avec un couteau lame 11 de supra sternale entaille la poitrine moyenne afin d’exposer le sternum ( Figure 1).
2. Escamoter la thyroïde en passant une suture de séjour polypropylène monofilament 4/0 avec un bois-Crile porte-aiguille et morceau de ruban adhésif sur la zone de travail.
3. Séparer carrément les muscles pré trachéales avec une pince micro-chirurgicale afin de découvrir la trachée.
4. Glisser doucement la lisse à pointe courbée pinces micro-chirurgicale avec les mâchoires fermées sur la trachée et derrière le sternum.
5. Par soigneusement ouvrant et fermant les mâchoires de la pince de microchirurgie incurvée à embout lisse réalisent une dissection émoussée sous les muscles pré trachéales et derrière le sternum à la plèvre m’éloigner.
6. Saisir les muscles droit supra-claviculaire avec la pince micro-chirurgicale directement à embout lisse, puis tirer doucement la poitrine de l’animal.
7. Glisser la mâchoire inférieure de la pince de l’os sous le sternum et effectuer une sternotomie partielle supérieure de 3-4 mm ( Figure 2). Direct de la partie inférieure de la mini-sternum légèrement vers la gauche.
8. Traversent une 7/0 séjour polypropylène suture monofilament d’à l’intérieur pour en dehors de l’espace intercostal deuxième de chaque côté de la mini-sternotomie utilisant un porte-aiguille micro-chirurgicale. Rester à proximité de l’angle costo-sternales pour éviter toute blessure aux intercostaux et internes des vaisseaux thoraciques ou plèvre.
9. Étendre les bords sternales à l’aide de sutures de séjour polypropylène monofilament 7/0 de chaque côté et fixez-les sur le tampon de travail avec du ruban adhésif.
10. Doucement écarter les muscles pré trachéales, la graisse médiastinale et thymus utilisant lisse à bout incurvé microchirurgicales pinces pour visualiser la crosse aortique sous grossissement faible puissance (2-3 X) ( Figure 3). Prenez particulièrement soin de ne pas toucher ou endommager la plèvre pariétale pour empêcher le développement d’un pneumothorax.
11. Exposer les tissus mous sous la crosse aortique en attachant des pinces ( Figure 4 A) et répandre doucement ses mâchoires. Préparer un tunnel dans les tissus mous sous la crosse aortique avec une deuxième pince liant en ouvrant et en fermant les mâchoires dans les tissus mous doucement.
12. Passer un segment de ligature soie 6/0, passant à travers le œil d’une aide de ligature ( Figure 4 B) qui s’est tenue dans la main gauche sous la crosse aortique et récupérez-la en attachant des pinces qui s’est tenue dans la main droite entre l’origine du les artères carotides communes ( Figure 5) gauche et droite innommés.
13. Couper une aiguille de calibre 27 sur une longueur de 5 mm et émoussé les deux extrémités en les pressant avec un porte-aiguille Crile. Placez l’aiguille de calibre 27 émoussé à côté de l’arc aortique ( Figure 6) avec une pince micro-chirurgicale directement à embout lisse et nouez la suture serrée autour de l’aiguille et l’aorte entre la carotide commune gauche et droite innommée artères à l’aide de la pince liant deux ( Figure 7). Pour attacher solidement la suture, effectuez un double nœud initial, suivi de quatre nœuds supplémentaires. Assurez-vous que tous les noeuds sont plats.
14. Après la ligature, enlever rapidement mais délicatement l’aiguille pour atteindre un diamètre de 0,4 mm rétrécissement et une constriction aortique reproductible transversal 65-70 %.
15. Vérifier l’hémostase des tissus mous autour de l’arc aortique, des muscles pré trachéales et bords sternales. Mettre une gaze hémostatique résorbable où suintant de sang est observé. Supprimer le polypropylène monofilament de 7/0 rester sutures utilisées pour propager les bords sternales.
16. Passer une suture simple polypropylène monofilament de 6/0 avec une micro-chirurgicale porte-aiguille de dehors à l’intérieur de l’espace intercostal deuxième gauche et ensuite de l’intérieur à en dehors de l’espace intercostal droit second. Rester à proximité de l’angle costo-sternales pour éviter toute blessure aux intercostaux et internes des vaisseaux thoraciques ou plèvre.
17. Rassembler des bords sternales en liant la suture polypropylène monofilament de 6/0 avec un bois-Crile porte-aiguille.
18. Fermer la peau avec un polypropylène monofilament 5/0 exécutant suture en une seule couche avec un bois-Crile porte-aiguille.
19. Effectuer l’intervention factice identique à l’opération de rétrécissement, mais sans lier une suture autour de l’aorte.

3. Convalescence postopératoire

1. suivre de très près les animaux. transférer la souris dans une cage individuelle et le placer dans une position couchée.
2. Autoriser la souris pour récupérer sous un léger réchauffement de la planète complètement éveillé (moins de 1 h après l’induction de l’anesthésie).
3. Pour l’analgésie postopératoire, injecter par voie intrapéritonéale de 0,1 mg/kg de la buprénorphine. répéter les injections sous-cutanées de 0,1 mg/kg de buprénorphine toutes les 8 h pendant les trois premiers jours comme indiqué.
4. Placer les souris fonctionnant dans des cages standards (maximum 3 souris par cage) et minimums 2 souris par cage.

4. Récolte de coeur

1. le jour de l’analyse, euthanasier la souris avec une solution de la kétamine 300 mg/kg et xylazine 20 mg/kg dans une solution saline par injection intrapéritonéale.
2. Tout d’abord récolter le sang de la veine cave inférieure et ensuite par le biais de la même ligne injecter 5 mL de solution de 2,6 mM EDTA dans une solution saline.
3. Récolte le cœur, supprimer les oreillettes et poids du cœur (les ventricules gauche et droit sans oreillettes).
4. Séparer le ventr droite gauchemécanicien responsable avec le septum restant à la partie du ventricule gauche. Peser les deux échantillons de tissus et congelez-les dans l’azote liquide.

Résultats

Survie du dispositif et à la fin
La survie du dispositif était très élevée, 98,3 % (59 sur 60) pour toute la série (TAC et animaux opérés). La mort du seul dispositif était due à une complication hémorragique chez une souris rabotée pour une opération fictive. La survie postopératoire durant la période d’observation de 28 jours était aussi excellente, de 98,3 % (58 sur 59). Le décès post-opératoires seulement tardif est survenu chez une souris de TAC jour (D) 16, proba...

Discussion

Le but du présent protocole est de présenter une illustration étape par étape de la technique chirurgicale pour la constriction aortique transversale peu invasive chez les souris. Description technique détaillée du transverse constriction aortique chez la souris a été signalée par d’autres auteurs^2,8. Toutefois, ces enquêteurs opérer après intubation et ventilation des animaux. L’utilisation d’une étape supplémentaire d’intubation-ventilation augmente la complexi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope chirurgical	Olympus	SZX2-TR30
Rasoir	Rowenta	Nomad TN3650FO
Sutures :Polypropylène
7/0	Ethicon	BV-1X
Polypropylène 6/0	BBraun	C0862061
Silk 6/0 ligature  ;	FST	18020-60
Polypropylène 4/0	Ethicon	8683
Polypropylène 5/0 Ethicon		Z303
Médicaments :
Ketamin	Merial	Imalgè ; ne 1000, LBM154AD
Xylazine	Bayer	Rompun 2 %, KP09PPC
Buprénorphine	Ceva	Vetergesic, 072013
Instruments :  ;
Pince osseuse	Outils chirurgicaux fins	16101-10
Aide à la ligature	Outils chirurgicaux fins	18062-12
Pinces à attacher	chirurgicaux fins	18026-10
Porte-aiguille Crile-Wood	Outils chirurgicaux fins	12003-15
Pince de microchirurgie  ;	Outils chirurgicaux fins	11003-12
Pinces de microchirurgie.	Outils chirurgicaux fins	11002-12
Pinces à tissus	Outils chirurgicaux fins	11021-12
Porte-aiguilles de microchirurgie	Outils chirurgicaux fins	12076-12
Ciseaux de microchirurgie	chirurgicaux fins	91501-09
Ciseaux Mayo	Outils chirurgicaux fins	14511-15
Couteau à 11 lames	Chirurgical fin Outils	10011-00
ARN et qPCR :
TriReagent	Euromedex	TR-118-200
Rneasy Mini kit	Qiagen	74704
Qubit Dosage fluorimétrique de l’ARN	Fisher Scientific	10034622
RNA 6000 Nano kit	Agilent	5067-1511
Kit ADNc haute capacité	Fisher Scientific	10400745
Taqman Master Mix	Fisher Scientific	10157154
Amorces BNP Taqman Fisher	Scientific	Mm01255770_g1
Amorces ANP	Fisher Scientific	Mm01255747_g1  ;
Amorces Taqman ACE	Fisher Scientific	Mm00802048_m1
Amorces Taqman Col1a1	Fisher Scientific	Mm00801666_g1
Amorces Taqman TGFb Fisher	Scientific	Mm01178820_m1
Amorces Taqman Gapdh	Fisher Scientific	Mm99999915_g1
ABIPrism  ; Thermocycleur	Applied Biosystems	7000
Software :
GraphPad Prism	GraphPad	Prism 7
Aliments pour animaux
Régime complet pour rats adultes/souris	Sans danger	UB220610R