Vivre-imagerie de la Migration des cellules épithéliales mammaires après la diminution transitoire des TIP60

Résumé

Nous présentons ici la surveillance en temps réel de la migration cellulaire dans un essai de cicatrisation avec les cellules épithéliales mammaires appauvri TIP60 MCF10A. La mise en œuvre de techniques d’imagerie de cellules vivantes dans notre protocole nous permet d’analyser et de visualiser les unicellulaires mouvement en temps réel et au fil du temps.

Résumé

L’essai de cicatrisation est efficace et l’un des moyens plus économiques pour l’étude de migration cellulaire in vitro. Classiquement, les images sont prises au début et la fin d’une expérience à l’aide d’un microscope à contraste de phase, et les capacités de migration des cellules sont évaluées par la fermeture des plaies. Cependant, le mouvement cellulaire est un phénomène dynamique, et une méthode conventionnelle ne permet pas pour le suivi de mouvement de cellule unique. Afin d’améliorer les tests de cicatrisation actuellement, nous utilisons les techniques d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller la migration cellulaire en temps réel. Cette méthode permet de déterminer le taux de migration cellulaire basé sur une cellule, système de suivi et fournit une meilleure distinction entre la migration cellulaire et la prolifération cellulaire. Ici, nous montrent l’utilisation de l’imagerie de cellules vivantes dans des essais de cicatrisation pour étudier les capacités différentes de migration des cellules épithéliales mammaires, influencées par la présence de TIP60. Motilité cellulaire est très dynamique, notre méthode fournit plus d’idées dans les processus de cicatrisation qu’un instantané de la fermeture de la plaie avec les techniques d’imagerie traditionnels utilisés pour les essais de cicatrisation.

Introduction

VIH-Tat-interactive protéine de 60 kDa (TIP60) est une acétyltransférase de lysine qui peut acetylate histone et protéines non histones^1,2. Ses fonctions sont trouvent à avoir des incidences sur les multiples voies de signalisation, y compris la transcription, la réparation de lésions de l’ADN et apoptose^{1,3,4,5,6, 7 , 8}. en outre, TIP60 est souvent diminuée dans les cancers et sa diminution est corrélée avec métastases cancéreuses et faible taux de survie taux^{9,10,11,12, 13,14}. Métastase tumorale est la principale cause de décès liés au cancer. C’est un processus en plusieurs étapes, et la première étape des métastases implique la migration et l’invasion des cellules tumorales dans les tissus adjacents^15,16. Pour ce faire, les cellules tumorales, tout d’abord, doivent se détacher de la masse de la tumeur primitive, soit sous la forme d’une feuille de cellule collectivement envahisseurs ou comme détaché monocellules¹⁷. Pendant ce processus, les cellules tumorales connaissent souvent épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT), entraînant des changements dans la morphologie et la cellule adhérence capacité^17,18.

Quelques techniques ont été développées pour étudier la migration et la capacité d’invasion de la tumeur des cellules in vitro. Parmi eux, l’essai de cicatrisation est le plus efficace et économique¹⁹. Tout d’abord, cette méthode implique la création d’un fossé artificiel sur une monocouche confluente de cellules, permettant ainsi aux cellules de migrer et de combler l’écart. Deuxièmement, les images des lacunes peuvent être capturés au début et à la fin de l’expérience. Enfin, une comparaison des écarts est utilisée pour déterminer la vitesse de la migration cellulaire. Un microscope à contraste de phase est généralement utilisé pour capturer des images pour des dosages classiques de cicatrisation. Un autre avantage de l’essai de la cicatrisation, c’est qu’il ressemble en partie en vivo migration des cellules tumorales. De même pour in vivo de métastases tumorales, la migration cellulaire lors d’essais de cicatrisation montre tant la migration collective des feuilles épithéliales et la migration des cellules simples jumelés.

Toutefois, la migration cellulaire est connue pour être dynamique, et il est nécessaire de documenter le mouvement des cellules en temps réel. Par exemple, un test conventionnel de cicatrisation ne permet pas un chercheur analyser les mouvements de la cellule unique. En revanche, les cellules cultivées pour des dosages de cicatrisation sont souvent privées de sérum pour inhiber la prolifération cellulaire. Ceci est fait pour écarter la possibilité d’écarts en raison de la prolifération cellulaire. Néanmoins, il y aura toujours quelques prolifération et mort cellulaire et des images à contraste de phase prises avant et après l’expérience sont incapables de différencier entre eux.

La technique d’imagerie de cellules vivantes aborde cette limitation des essais classiques de cicatrisation. En utilisant un microscope de vivre-imagerie combiné avec un incubateur à CO₂ et le contrôle de température approprié, chercheurs peuvent de mesurer la taille de l’espace et son taux de fermeture au fil du temps tout en retraçant les mouvements de migration activement les cellules situées à l’extrémité de la avant envahissante. Par conséquent, la mise en œuvre de cellules vivantes d’imagerie pour surveiller la migration cellulaire ne fournira pas seulement la meilleure visualisation de la migration cellulaire, mais permettra également la possibilité de faire la différence entre la migration cellulaire et la prolifération cellulaire, permettant ainsi une plus fiabilité de l’analyse de la migration cellulaire.

Dans cette étude, les cellules épithéliales mammaires MCF10A servaient à démontrer la combinaison de la cicatrisation, dosage et vivre-cellule d’imagerie afin d’étudier le rôle de TIP60 dans la migration cellulaire. L’appauvrissement de la couche de TIP60 résulte en capacités d’augmentation de la migration dans les cellules MCF10A.

Protocole

1. préparation

1. Préparer le milieu de culture MCF10A : moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco) / F12 (1:1) avec 5 % de cheval sérum, 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, 100 ng/mL de toxine de choléra et 10 µg/mL d’insuline.
2. Préparer un milieu sans sérum : DMEM/F12 (1:1) avec 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, la toxine cholérique 100 ng/mL et 10 µg/mL d’insuline.
3. Utilisez la séquence de siARN suivants :
   siControl :
   Avant : 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
   Revers : 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
   siTIP60 :
   Avant : 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
   Revers : 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
4. Utilisez des récipients de culture cellulaire de 10 cm et plaques 24 puits.

2. transitoire épuisement des siARN TIP60 utilisant

1. Jour 1, aliquote 15 µL de réactif de transfection (p. ex., Lipofectamine RNAiMAX) et 2 mL de milieu de sérum (p. ex., Opti-MEM) a réduit et mélangent avec 10 µL de chaque siARN (stock de 10 µM), respectivement.
2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 min.
3. Graines de cellules⁶ MCF10A 1 x 10 avec 3 mL de milieu de culture dans un plat de 10 cm. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
4. Ajouter le mélange de siARN goutte à goutte dans le plat de 10 cm.
5. Secouez le plat pour faire en sorte que les cellules sont également distribués avant de le mettre dans l’incubateur à 37 ° C.
6. Après 6 h d’incubation, remplacer le support contenant des siARN avec 8 mL de milieu de culture frais.
7. Jour 2, préparer une autre fournée de siARN mélanges et les incuber à température ambiante pendant 20 min.
8. Aspirer à 8 mL de milieu de culture ajouté au jour 1 et le remplacer par 3 mL de milieu de culture frais.
9. Ajouter le deuxième lot de mélange de siARN aux plats goutte à goutte. Secouez la vaisselle pour faire en sorte que les réactifs sont entièrement mélangés avant de les mettre dans l’incubateur.
10. Après 6 h, remplacer le support contenant des siARN avec 8 mL de milieu de culture frais.

3. semences cellules pour le dosage de cicatrisation

1. Le jour 3, jetez le milieu et laver les cellules une fois avec 2 mL de tampon phosphate salin (PBS). Jeter le tampon PBS.
2. Trypsinize les siControl et les cellules traitées siTIP60 en ajoutant 1 mL de 1 x tampon de trypsine-EDTA à la plaque. Remettre dans l’incubateur pendant 20 min.
3. Ajouter 4 mL de milieu de culture complet pour chaque plaque, remettre les cellules en suspension de pipetage et transférez-les sur un tube de 15 mL.
4. Centrifuger à 200 g pendant 5 min et retirer le surnageant.
5. Remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu sans sérum et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
6. Préparer une suspension de cellules de 6 x 10⁵ cellules/mL pour les siControl et siTIP60 ; veiller à ce que les cellules soient bien mélangés. Ajouter 500 µL de la suspension cellulaire à un puits d’une plaque 24 puits pour assurer 100 % de confluence. Graines de 5 à 6 puits chaque pour siControl et siTIP60.
7. Secouez légèrement la plaque en arrière et puis à côté d’assurer la répartition homogène. Éviter un mouvement circulaire. Laisser la plaque dans l’incubateur pendant 24 h.
8. Récolter les cellules restantes pour vérifier l’efficacité défiant de TIP60. Pour ce faire, centrifuger la suspension de cellules restantes à 200 g pendant 5 min et retirer le surnageant.
9. Isoler l’ARN à l’aide d’un commercial réactif, suivant le protocole du fabricant et passez à la PCR quantitative en temps réel pour évaluer l’efficacité défiant.

4. créer la plaie

1. Vérifier sous un microscope à contraste de phase pour s’assurer que les cellules sont pleinement attachés. Observer des cellules au microscope (4 X, 10 X et 20 X grossissement) pour s’assurer que les cellules sont pleinement attachés qu’une monocouche confluente de cellules a formé.
   Remarque : les cellules siControl attachent généralement mieux que les cellules siTIP60. C’est prévu, car l’appauvrissement de la couche de TIP60 rend les cellules plus mésenchymateuse type²⁰. Ici, un microscope à contraste de phase normale benchtop lumière blanche est utilisé.
2. Pour générer la plaie, délicatement gratter une ligne droite à travers le centre du puits avec une pointe de pipette de 200 µL ; la longueur de la plaie générée est la même que le diamètre du puits. Répétez cette étape pour tous les puits restants. Utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque puits.
3. Laver délicatement à l’aide de chaque puits 5 fois sans sérum moyen pour enlever les cellules individuelles.
4. Ajouter 1 mL de milieu sans sérum dans chaque puits et passez à l’imagerie de cellules vivantes.

5. installation de l’imagerie de cellules vivantes

1. Allumez le microscope et le contrôle de la température au moins 1 h avant la mise en place de cellules vivantes d’imagerie afin de s’assurer que la température dans la chambre atteint 37 ° C.
2. Allumez l’alimentation de gaz de dioxyde de carbone (CO₂) avant de commencer l’imagerie de cellules vivantes. Régler le CO₂ concentration à 5 %.
3. Placez la plaque 24 puits sur la scène du microscope, puis sélectionnez l’objectif avec un grossissement de X 10 pour l’imagerie. Diriger la lumière émise pour les oculaires au lieu de la caméra et ajuster le focus pour localiser la plaie et les cellules autour de lui.
   Remarque : dans ce cas, la lumière blanche avec contraste de phase a été utilisée.
4. Utiliser un système d’observation de cellules vivantes pour marquer la position de la plaie dans chaque puits.
   Remarque : La scène automatisée le système d’imagerie de cellules vivantes permet d’acquisition d’images à postes multiples. Les images sont prises sur chaque position marquée une fois chaque intervalle.
5. Mettre en place la condition temporelle : intervalle de 1 h et la durée de 72 h ; Selon ce paramètre, le système prendra photos à chaque emplacement marqué toutes les heures pendant 72 h. mise en place n’importe quel intervalle de temps souhaité et la période de surveillance.
   NOTE : Ici, une durée de 72 heures est préférable car ces cellules commencent à mourir après 72 h dans un milieu sans sérum.

6. suivi de mouvement unicellulaires

1. Exporter les données après 72 h. exporter les données sous forme d’images au format JPEG, tant que les vidéos au format AVI.
   NOTE : Ceci est important parce que les logiciels ImageJ peut reconnaître seulement les vidéos au format AVI. Les vitesses de migration cellulaires différentes entre les cellules siTIP60 et siControl peuvent être clairement observés dans la vidéo.
2. Ouvrir la vidéo AVI dans le logiciel ImageJ.
3. Ouvrez le plugin MTrackJ (le plugin doit être téléchargé et installé séparément) : Plugins > MtrackJ.
4. Ajouter une piste pour les cellules individuelles choisie de la vidéo en cliquant sur l’onglet « Ajouter » dans la barre d’outils MtrackJ. Choisissez une cellule à l’extrémité du front invasive et une cellule qui peut migrer sur ses propres (migration de cellules individuelles). Suivre le mouvement des cellules choisies sur la vidéo et de remonter à l’aide de MtrackJ.
5. Mesurez la distance du mouvement en cliquant sur l’onglet « mesure » sur la barre d’outils.
   NOTE : Ici, presque aucune cellule de la siControl s’installe comme des cellules individuelles, rend difficile de mesurer le mouvement des cellules individuelles, tandis que le nombre des cellules siTIP60 se déplacèrent en cellules individuelles. Cependant, la circulation des cellules situées à l’avant envahissante peut encore être tracée et calculée dans les cellules des siControl et siTIP60.
6. Enregistrer la vidéo avec les pistes au format AVI.

7. la quantification de la capacité de Migration cellulaire

1. Pour la quantification, sélectionnez les images à h « n », où « n » se réfère à la validant lorsque les cellules du siTIP60 ou du siControl ont complètement fermé la plaie et à 0 h.
   NOTE : Ici, 48 h a été choisi, car les blessures dans les cellules siTIP60 ont été presque complètement fermés.
2. Quantifier la pourcentage migration à l’aide de ImageJ selon la formule suivante : (zone de plaie à 0 h - de plaie à « n » h) / zone de plaie à 0 h x 100.

Résultats

Schéma général du test de Migration cellulaire axée sur l’imagerie de cellules vivantes
Figure 1 a est un schéma du présent protocole. MCF10A cellules transfectées avec siControl a montré une morphologie épithéliale typique. Après l’épuisement des TIP60, MCF10A cellules étaient plus mésenchymateuses par rapport aux cellules témoins (Figure 1 b).

Discussion

On sait que dans le processus de migration cellulaire, les cellules peuvent soit déplacer sous forme de feuilles adhérentes ; des grappes ; ou seul, isolés des cellules. Le mode et la dynamique de l’invasion des cellules peuvent varier d’une affection à l’autre, et le phénotype peut changer en quelques heures. L’analyse de cicatrisation traditionnelle est basée sur snapshot images tirées d’un microscope avec un intervalle de temps, par exemple 12 ou 24 h. Il est donc difficile de saisir la dynamique de la fermeture de la...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellule MCF10A	ATCC	CRL-10317TM	Cellule épithéliale mammaire
Milieu DMEM/F12 (1:1)	Gibco	11330-032	Milieu de culture MCF10A
Facteur de croissance épithéliale (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Suppléments pour milieux de culture MCF10A
Toxine cholérique	Sigma-Aldrich	C-8052	Suppléments pour milieux
de culture MCF10AHydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0888	Suppléments pour milieux de culture MCF10A
Insuline	Sigma-Aldrich	I-1882	Suppléments pour milieux de culture MCF10A
Sérum domestique	Gibco	16050-122	Suppléments pour milieux de culture MCF10A
Trypsine	Gibco	25200-056	Pour MCF10A Détacher de la plaque
Hémacytomètre	Fisher Scientific	267110	Pour le comptage des cellules
Opti-MEM milieu sérique réduit	Gibco	31985-070	Pour mélange de siRNA
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies	56532	Réactif transfectif
Réactif Trizol	Invitrogen/Life Technologies	15596-026	Pour l’extraction de l’ARNm
Kit de synthèse d’ADNc iScript	Bio-Rad	170-8891	Pour l’ADNc génération
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5125	Pour qPCR en temps réel
7500 Système de PCR rapide en temps réel	Biosystems		Antenne qPCR en temps réel Antenne de
10 cm	Greiner bio-one	664160	Pour l’expérience Knockdown
Plaque à 24 puits	Cellstar	662160	Pour le test de cicatrisation des plaies
siControl siRNA	Self conçu	Auto-conçu	CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNA	auto-conçu		UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Observateur de cellules vivantes	Zeiss		Zeiss inversé Observateur de cellules pour des expériences sur cellules vivantes