Vivre-imagerie de la Migration des cellules épithéliales mammaires après la diminution transitoire des TIP60

VIH-Tat-interactive protéine de 60 kDa (TIP60) est une acétyltransférase de lysine qui peut acetylate histone et protéines non histones^1,2. Ses fonctions sont trouvent à avoir des incidences sur les multiples voies de signalisation, y compris la transcription, la réparation de lésions de l’ADN et apoptose^{1,3,4,5,6, 7 , 8}. en outre, TIP60 est souvent diminuée dans les cancers et sa diminution est corrélée avec métastases cancéreuses et faible taux de survie taux^{9,10,11,12, 13,14}. Métastase tumorale est la principale cause de décès liés au cancer. C’est un processus en plusieurs étapes, et la première étape des métastases implique la migration et l’invasion des cellules tumorales dans les tissus adjacents^15,16. Pour ce faire, les cellules tumorales, tout d’abord, doivent se détacher de la masse de la tumeur primitive, soit sous la forme d’une feuille de cellule collectivement envahisseurs ou comme détaché monocellules¹⁷. Pendant ce processus, les cellules tumorales connaissent souvent épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT), entraînant des changements dans la morphologie et la cellule adhérence capacité^17,18.

Quelques techniques ont été développées pour étudier la migration et la capacité d’invasion de la tumeur des cellules in vitro. Parmi eux, l’essai de cicatrisation est le plus efficace et économique¹⁹. Tout d’abord, cette méthode implique la création d’un fossé artificiel sur une monocouche confluente de cellules, permettant ainsi aux cellules de migrer et de combler l’écart. Deuxièmement, les images des lacunes peuvent être capturés au début et à la fin de l’expérience. Enfin, une comparaison des écarts est utilisée pour déterminer la vitesse de la migration cellulaire. Un microscope à contraste de phase est généralement utilisé pour capturer des images pour des dosages classiques de cicatrisation. Un autre avantage de l’essai de la cicatrisation, c’est qu’il ressemble en partie en vivo migration des cellules tumorales. De même pour in vivo de métastases tumorales, la migration cellulaire lors d’essais de cicatrisation montre tant la migration collective des feuilles épithéliales et la migration des cellules simples jumelés.

Toutefois, la migration cellulaire est connue pour être dynamique, et il est nécessaire de documenter le mouvement des cellules en temps réel. Par exemple, un test conventionnel de cicatrisation ne permet pas un chercheur analyser les mouvements de la cellule unique. En revanche, les cellules cultivées pour des dosages de cicatrisation sont souvent privées de sérum pour inhiber la prolifération cellulaire. Ceci est fait pour écarter la possibilité d’écarts en raison de la prolifération cellulaire. Néanmoins, il y aura toujours quelques prolifération et mort cellulaire et des images à contraste de phase prises avant et après l’expérience sont incapables de différencier entre eux.

La technique d’imagerie de cellules vivantes aborde cette limitation des essais classiques de cicatrisation. En utilisant un microscope de vivre-imagerie combiné avec un incubateur à CO₂ et le contrôle de température approprié, chercheurs peuvent de mesurer la taille de l’espace et son taux de fermeture au fil du temps tout en retraçant les mouvements de migration activement les cellules situées à l’extrémité de la avant envahissante. Par conséquent, la mise en œuvre de cellules vivantes d’imagerie pour surveiller la migration cellulaire ne fournira pas seulement la meilleure visualisation de la migration cellulaire, mais permettra également la possibilité de faire la différence entre la migration cellulaire et la prolifération cellulaire, permettant ainsi une plus fiabilité de l’analyse de la migration cellulaire.

Dans cette étude, les cellules épithéliales mammaires MCF10A servaient à démontrer la combinaison de la cicatrisation, dosage et vivre-cellule d’imagerie afin d’étudier le rôle de TIP60 dans la migration cellulaire. L’appauvrissement de la couche de TIP60 résulte en capacités d’augmentation de la migration dans les cellules MCF10A.

1. préparation

1. Préparer le milieu de culture MCF10A : moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco) / F12 (1:1) avec 5 % de cheval sérum, 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, 100 ng/mL de toxine de choléra et 10 µg/mL d’insuline.
2. Préparer un milieu sans sérum : DMEM/F12 (1:1) avec 20 ng/mL facteur de croissance épithélial, hydrocortisone 0,5 mg/mL, la toxine cholérique 100 ng/mL et 10 µg/mL d’insuline.
3. Utilisez la séquence de siARN suivants :
   siControl :
   Avant : 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
   Revers : 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
   siTIP60 :
   Avant : 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
   Revers : 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
4. Utilisez des récipients de culture cellulaire de 10 cm et plaques 24 puits.

2. transitoire épuisement des siARN TIP60 utilisant

1. Jour 1, aliquote 15 µL de réactif de transfection (p. ex., Lipofectamine RNAiMAX) et 2 mL de milieu de sérum (p. ex., Opti-MEM) a réduit et mélangent avec 10 µL de chaque siARN (stock de 10 µM), respectivement.
2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 min.
3. Graines de cellules⁶ MCF10A 1 x 10 avec 3 mL de milieu de culture dans un plat de 10 cm. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
4. Ajouter le mélange de siARN goutte à goutte dans le plat de 10 cm.
5. Secouez le plat pour faire en sorte que les cellules sont également distribués avant de le mettre dans l’incubateur à 37 ° C.
6. Après 6 h d’incubation, remplacer le support contenant des siARN avec 8 mL de milieu de culture frais.
7. Jour 2, préparer une autre fournée de siARN mélanges et les incuber à température ambiante pendant 20 min.
8. Aspirer à 8 mL de milieu de culture ajouté au jour 1 et le remplacer par 3 mL de milieu de culture frais.
9. Ajouter le deuxième lot de mélange de siARN aux plats goutte à goutte. Secouez la vaisselle pour faire en sorte que les réactifs sont entièrement mélangés avant de les mettre dans l’incubateur.
10. Après 6 h, remplacer le support contenant des siARN avec 8 mL de milieu de culture frais.

3. semences cellules pour le dosage de cicatrisation

1. Le jour 3, jetez le milieu et laver les cellules une fois avec 2 mL de tampon phosphate salin (PBS). Jeter le tampon PBS.
2. Trypsinize les siControl et les cellules traitées siTIP60 en ajoutant 1 mL de 1 x tampon de trypsine-EDTA à la plaque. Remettre dans l’incubateur pendant 20 min.
3. Ajouter 4 mL de milieu de culture complet pour chaque plaque, remettre les cellules en suspension de pipetage et transférez-les sur un tube de 15 mL.
4. Centrifuger à 200 g pendant 5 min et retirer le surnageant.
5. Remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu sans sérum et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
6. Préparer une suspension de cellules de 6 x 10⁵ cellules/mL pour les siControl et siTIP60 ; veiller à ce que les cellules soient bien mélangés. Ajouter 500 µL de la suspension cellulaire à un puits d’une plaque 24 puits pour assurer 100 % de confluence. Graines de 5 à 6 puits chaque pour siControl et siTIP60.
7. Secouez légèrement la plaque en arrière et puis à côté d’assurer la répartition homogène. Éviter un mouvement circulaire. Laisser la plaque dans l’incubateur pendant 24 h.
8. Récolter les cellules restantes pour vérifier l’efficacité défiant de TIP60. Pour ce faire, centrifuger la suspension de cellules restantes à 200 g pendant 5 min et retirer le surnageant.
9. Isoler l’ARN à l’aide d’un commercial réactif, suivant le protocole du fabricant et passez à la PCR quantitative en temps réel pour évaluer l’efficacité défiant.

4. créer la plaie

1. Vérifier sous un microscope à contraste de phase pour s’assurer que les cellules sont pleinement attachés. Observer des cellules au microscope (4 X, 10 X et 20 X grossissement) pour s’assurer que les cellules sont pleinement attachés qu’une monocouche confluente de cellules a formé.
   Remarque : les cellules siControl attachent généralement mieux que les cellules siTIP60. C’est prévu, car l’appauvrissement de la couche de TIP60 rend les cellules plus mésenchymateuse type²⁰. Ici, un microscope à contraste de phase normale benchtop lumière blanche est utilisé.
2. Pour générer la plaie, délicatement gratter une ligne droite à travers le centre du puits avec une pointe de pipette de 200 µL ; la longueur de la plaie générée est la même que le diamètre du puits. Répétez cette étape pour tous les puits restants. Utiliser un nouvel embout de la pipette pour chaque puits.
3. Laver délicatement à l’aide de chaque puits 5 fois sans sérum moyen pour enlever les cellules individuelles.
4. Ajouter 1 mL de milieu sans sérum dans chaque puits et passez à l’imagerie de cellules vivantes.

5. installation de l’imagerie de cellules vivantes

1. Allumez le microscope et le contrôle de la température au moins 1 h avant la mise en place de cellules vivantes d’imagerie afin de s’assurer que la température dans la chambre atteint 37 ° C.
2. Allumez l’alimentation de gaz de dioxyde de carbone (CO₂) avant de commencer l’imagerie de cellules vivantes. Régler le CO₂ concentration à 5 %.
3. Placez la plaque 24 puits sur la scène du microscope, puis sélectionnez l’objectif avec un grossissement de X 10 pour l’imagerie. Diriger la lumière émise pour les oculaires au lieu de la caméra et ajuster le focus pour localiser la plaie et les cellules autour de lui.
   Remarque : dans ce cas, la lumière blanche avec contraste de phase a été utilisée.
4. Utiliser un système d’observation de cellules vivantes pour marquer la position de la plaie dans chaque puits.
   Remarque : La scène automatisée le système d’imagerie de cellules vivantes permet d’acquisition d’images à postes multiples. Les images sont prises sur chaque position marquée une fois chaque intervalle.
5. Mettre en place la condition temporelle : intervalle de 1 h et la durée de 72 h ; Selon ce paramètre, le système prendra photos à chaque emplacement marqué toutes les heures pendant 72 h. mise en place n’importe quel intervalle de temps souhaité et la période de surveillance.
   NOTE : Ici, une durée de 72 heures est préférable car ces cellules commencent à mourir après 72 h dans un milieu sans sérum.

6. suivi de mouvement unicellulaires

1. Exporter les données après 72 h. exporter les données sous forme d’images au format JPEG, tant que les vidéos au format AVI.
   NOTE : Ceci est important parce que les logiciels ImageJ peut reconnaître seulement les vidéos au format AVI. Les vitesses de migration cellulaires différentes entre les cellules siTIP60 et siControl peuvent être clairement observés dans la vidéo.
2. Ouvrir la vidéo AVI dans le logiciel ImageJ.
3. Ouvrez le plugin MTrackJ (le plugin doit être téléchargé et installé séparément) : Plugins > MtrackJ.
4. Ajouter une piste pour les cellules individuelles choisie de la vidéo en cliquant sur l’onglet « Ajouter » dans la barre d’outils MtrackJ. Choisissez une cellule à l’extrémité du front invasive et une cellule qui peut migrer sur ses propres (migration de cellules individuelles). Suivre le mouvement des cellules choisies sur la vidéo et de remonter à l’aide de MtrackJ.
5. Mesurez la distance du mouvement en cliquant sur l’onglet « mesure » sur la barre d’outils.
   NOTE : Ici, presque aucune cellule de la siControl s’installe comme des cellules individuelles, rend difficile de mesurer le mouvement des cellules individuelles, tandis que le nombre des cellules siTIP60 se déplacèrent en cellules individuelles. Cependant, la circulation des cellules situées à l’avant envahissante peut encore être tracée et calculée dans les cellules des siControl et siTIP60.
6. Enregistrer la vidéo avec les pistes au format AVI.

7. la quantification de la capacité de Migration cellulaire

1. Pour la quantification, sélectionnez les images à h « n », où « n » se réfère à la validant lorsque les cellules du siTIP60 ou du siControl ont complètement fermé la plaie et à 0 h.
   NOTE : Ici, 48 h a été choisi, car les blessures dans les cellules siTIP60 ont été presque complètement fermés.
2. Quantifier la pourcentage migration à l’aide de ImageJ selon la formule suivante : (zone de plaie à 0 h - de plaie à « n » h) / zone de plaie à 0 h x 100.

Schéma général du test de Migration cellulaire axée sur l’imagerie de cellules vivantes
Figure 1 a est un schéma du présent protocole. MCF10A cellules transfectées avec siControl a montré une morphologie épithéliale typique. Après l’épuisement des TIP60, MCF10A cellules étaient plus mésenchymateuses par rapport aux cellules témoins (Figure 1 b).

Examen de l’efficacité défiant TIP60
La figure 2 illustre l’efficacité défiant TIP60. Le niveau d’expression TIP60 fortement diminué après un traitement siTIP60. Outre TIP60, les expressions de plusieurs protéines liées à la migration de cellules ont été également examinés20. Par exemple, l’expression de la molécule d’adhérence épithéliale (EpCAM), qui est un marqueur épithélial, a diminué, alors que les manifestations de la fibronectine (FN1) et SNAIL2 (SNAI2), qui sont les deux pilotes de l’EMT, ont augmenté à appauvrissement de la couche de TIP60. Ces données suggèrent que les niveaux de TIP60 dans les cellules de MCF10A utilisés pour l’imagerie de cellules vivantes étaient suffisamment réduits.

Appauvrissement de la couche de TIP60 modifie la dynamique de la Migration cellulaire
La figure 3 montre les vidéos prises pour les cellules siControl et siTIP60. Les vidéos montrent clairement une migration cellulaire plus rapide des siTIP60 par rapport à siControl. En dehors de cela, dans la dynamique de la migration cellulaire entre les cellules siControl et siTIP60 a observé une différence aussi (c.-à-d., les cellules de siControl déplacés sous forme de tableau, tandis que plus de mouvement unicellulaire a été observée dans les cellules de siTIP60).

Augmentation de la Migration cellulaire après TIP60 Knockdown
La figure 4 montre la quantification de la migration cellulaire des cellules siControl et siTIP60. Le pourcentage de cellules migrés a augmenté significativement après l’épuisement des TIP60.

TIP60 Épuisement change le modèle de la Migration cellulaire
La figure 5 montre les vidéos mouvement de cellule unique de suivi. La plupart des cellules siControl migré collectivement dans le cadre des feuilles de la cellule et seulement deux cellules ont montré unicellulaires migration, tandis que la plupart des cellules siTIP60 single-cell migration. Les changements dans la configuration de la migration cellulaire indiquent que les cellules avec TIP60 appauvri ont un phénotype plus mésenchymateux.

Figure 1 : présentation expérimentale et images représentatives. (A) schéma du protocole. (B) des images représentatives de MCF10A cellules transfectées avec siControl ou siTIP60. MCF10A cellules présentent une morphologie plus mésenchymateuse après l’épuisement des TIP60. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : TIP60 était efficacement épuisée après transfection siTIP60. La PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour vérifier le niveau d’expression de TIP60, EpCAM, FN1et SNAI2. L’ARN total a été isolé en utilisant le réactif de Trizol suivant le protocole de la manufacture. 2 µg d’ARN total de chaque échantillon était utilisée pour fabriquer des ADNc. Les résultats sont représentés comme le pli-changement. Actine a été utilisée comme témoin interne. Barre d’erreur indique l’écart d’au moins 3 expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : vidéos d’imagerie de cellules vivantes des cellules siControl et siTIP60 montrent des profils différents de mouvement cellulaire. L’intervalle de temps a été établi à 1 h et la durée était de 72 h. La vidéo a été prise à l’aide d’une observation de cellules vivantes de Zeiss. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces vidéos.

Figure 4 : Quantification du pourcentage de la migration cellulaire. (A) les images représentatives ont été extraites des vidéos d’imagerie de cellules vivantes. Photos prises à 0 h et 48 h ont été utilisés. (B) le dosage du pourcentage de la migration cellulaire sous 48 h a été effectué à l’aide de logiciels ImageJ selon la formule suivante : (zone de plaie à 0 h - de plaie à « n » h) / zone de plaie à 0 h x 100. La barre d’erreur indique l’écart d’au moins trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : vidéos d’imagerie de cellules vivantes afficher le suivi de mouvement monocellulaires. Les lignes de couleur montrent la voie migratoire de chaque cellule unique isolé sélectionnée. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces vidéos.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.