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Article de méthode

Activation des cellules Müller Glia dans une dégénérescence rétinienne induite par Laser et le modèle de régénération chez le poisson zèbre

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DOI :

10.3791/56249

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27 octobre 2017

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1Department of Ophthalmology, University Hospital of Bern, University of Bern, 2Department of Clinical Research, University of Bern, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Dans cet article

Résumé

Le poisson-zèbre est un populaire modèle animal pour étudier les mécanismes de dégénérescence rétinienne/régénération chez les vertébrés. Ce protocole décrit une méthode pour induire des lésions localisées perturbant la rétine externe avec un minimum de dommages à la rétine interne. Par la suite, nous surveillons in vivo la morphologie de la rétine et la réponse de glia Müller tout au long de la régénération rétinienne.

Résumé

Une fascinante différence entre téléostéen et mammifères est le potentiel tout au long de la rétine chez les téléostéens pour neurogenèse rétinienne et la régénération après des dommages graves. Enquête sur les voies de la régénération chez le poisson zèbre pourrait apporter de nouvelles connaissances pour élaborer des stratégies innovantes pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine chez les mammifères. Dans les présentes, nous nous sommes concentrés sur l’induction d’une lésion focale à la rétine externe chez le poisson zèbre adulte au moyen d’un laser à diode 532 nm. Une lésion localisée permet l’étude des processus biologiques qui ont lieu au cours de la dégénérescence rétinienne et de régénération directement à la zone de dommages. En utilisant la tomographie à cohérence optique non invasif (OCT), nous avons pu définir l’emplacement de la régénération ultérieure de zone et moniteur endommagée in vivo. En effet, l’imagerie OCT produit des images haute résolution et transversales de la rétine de poisson-zèbre, fournissant des informations qui étaient auparavant uniquement disponibles avec les analyses histologiques. Afin de confirmer les données de l’OCT en temps réel, les coupes histologiques ont été réalisées et régénératrice après l’induction de la lésion rétinienne a été étudiée par immunohistochimie.

Introduction

Vision est probablement le sens essentiel de l’être humain et son atteinte a une forte incidence socio-économique. Dans le monde industrialisé, maladies dégénératives de la rétine constituent la majorité de la perte de la vision et de cécité chez la population adulte1. Rétinite pigmentaire (RP) est la cause héréditaire la plus fréquente de cécité chez les personnes âgées de 20 à 60, affectant environ 1,5 millions de personnes dans le monde entier2,3. C’est une famille hétérogène de rétiniennes héréditaires caractérisées par une perte progressive des photorécepteurs (PRs) suivie d’une dégénérescence de l’épithélium pigmentaire rétinien et, par la suite, une gliose et remodelage des neurones interne4. L’évolution de la maladie peut s’expliquer par la perte progressive des deux types de cellules PR, généralement en commençant avec les tiges, qui sont responsables de la vision achromatique dans la pénombre et les cônes, qui sont essentielles pour la vision et l’acuité de la couleur5. Un défaut génétique unique suffit à provoquer des RP. Jusqu'à présent, plus de 130 mutations dans les gènes de plus de 45 ont été associées à la maladie6. Cela conduit à divers phénotypes de la maladie et est une des raisons que la thérapie génique est non généralisables et donc une approche thérapeutique complexe. Par conséquent, il y a un besoin urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques générales pour traiter la dégénérescence rétinienne en aveuglant les maladies.

Souvent la dégénérescence rétinienne implique la perte de PR ; par conséquent, la mort cellulaire PR est une caractéristique des processus dégénératifs dans la rétine7. Il a déjà été démontré que la mort des cellules PR stimule Müller glia cellulaire (MC) activation et la prolifération des8. MCs, le type de cellules gliales majeur dans la rétine des vertébrés, étaient autrefois considéré comme rien de plus qu’une « colle » entre les neurones de la rétine. Ces dernières années, de nombreuses études ont montré que MCs agissent comme plus que simple structurels soutiennent le9. Parmi les différentes fonctions, MCs participent également à la neurogenèse et réparer10. En effet, en réponse à des facteurs diffusibles par la dégénérescence rétine, MCs augmentent considérablement expression de protéine fibrillaire acide gliale (GFAP). Par conséquent, GFAP étiquetage peut servir comme marqueur pour l’activation du MC en réponse secondaire à des lésions rétiniennes et dégénérescence11.

Récemment, nous avons développé une nouvelle adaptation de lésion focale en utilisant un laser pour induire la dégénérescence rétinienne chez le poisson zèbre (Danio rerio). Lésion focale est avantageuse pour l’étude de certains processus biologiques tels que la migration des cellules dans le site lésé et le calendrier précis des événements qui se produisent pendant la régénération rétinienne12. En outre, le poisson-zèbre est devenu important dans la recherche visuelle en raison des similitudes entre son système visuel et celui des autres vertébrés. Les caractéristiques morphologiques et histologiques bruts de rétines humaines et téléostéens présentent des différences peu. En conséquence, les rétines humaines et poisson-zèbre contiennent les mêmes classes de cellule majeur organisés dans le même modèle en couches, où les photorécepteurs de détection de lumière occupent la couche la plus externe, tandis que les neurones de projection rétinienne, les cellules de ganglion, résident dans la plus profonde couche neuronale, proximale de la lentille. Les interneurones rétiniens, les amacrines, bipolaire et les cellules horizontales, localiser entre les photorécepteurs et ganglion cellule couches13. En outre, la rétine du poisson-zèbre est dominée par les cônes et donc plus proche de la rétine humaine que, par exemple, la rétine rongeur étudiée. Une fascinante différence entre téléostéen et mammifères est la neurogenèse persistante dans rétine de poisson et de la régénération rétinienne après avarie. Chez le poisson zèbre, MCs peuvent dédifférenciation et médiation de régénération dans la rétine blessé14,15. Dans le poulet, MCs ont certaines capacité aussi à réintégrer le cycle cellulaire et de dédifférenciation. Suite à une lésion rétinienne chez les poissons adultes, MCs adoptent certaines caractéristiques des cellules souches et progénitrices, migrent vers le tissu rétinien endommagé et produisent de nouveaux neurones16. Le profil d’expression génique des mammifères MCs révèle inattendus similitudes avec cellules souches rétiniennes, et preuve intrinsèque potentiel neurogène des MCs dans le poulet, les rongeurs et rétine même humaine croît17. Néanmoins, pourquoi la réponse régénératrice chez les oiseaux et les mammifères est plus faible comparativement à la réponse robuste chez les poissons n’est pas encore compris. Par conséquent, la compréhension des mécanismes de réparation endogène chez le poisson zèbre peut suggérer des stratégies pour stimuler la régénération rétinienne chez les mammifères et les êtres humains. Utilisant le mécanisme de réparation endogène des MCs comme un outil thérapeutique pour le traitement des patients atteints de dégénérescence rétinienne aurait un impact exceptionnel pour notre société.

Ici, nous fournissons les étapes nécessaires pour utiliser le modèle de dégénérescence/régénération dans la recherche ophtalmologique. Nous nous sommes concentrés d’abord sur induisant des dommages focal dans la rétine neurosensorielle, puis sur l’imagerie des événements de développement sur le site de la blessure et enfin visualisation implication des MCs adjacents. Le protocole général est relativement facile à réaliser et ouvre un large éventail de possibilités pour l’évaluation de la rétine par la suite.

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Protocole

toutes les expériences ont adhéré à la déclaration pour l’utilisation des animaux en ophtalmiques et de la recherche de la Vision de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) et respecter les règlements connexes des autorités gouvernementales.

1. animaux

  1. TgBAC maintenir (gfap:gfap-GFP) poisson zèbre 167 souche (AB) âgés de 6 à 9 mois dans des conditions normales dans l’eau avec une température de 26.5 ° C et un cycle lumière/obscurité de 14/10 h 18.
  2. Suivre les directives de protection des animaux des institutions impliquées pour l’expérimentation animale après approbation par les autorités gouvernementales.

2. Réversible anesthésie systémique

  1. préparer la solution de sel de méthanesulfonate 3-aminobenzoate d’éthyle (tricaïne) dissoudre 400 mg de poudre de tricaïne dans 97,9 mL de l’eau du réservoir et 2,1 mL de 1 M de Tris buffered saline (TBS). Ajuster le pH 7.0 avec 1 M Tris (pH 9) et les conserver à 4 ° C dans l’obscurité jusqu'à un mois.
    NOTE : Tricaïne devrait être établi dans l’eau comme les conditions de vie naturelle de l’animal, de préférence original réservoir d’eau doit être utilisé.
  2. Diluer la solution mère 01:25 dans réservoir d’eau et consommez immédiatement.
  3. Placer le poisson-zèbre dans une boîte de Pétri contenant 50 mL de solution d’anesthésie jusqu'à ce qu’ils deviennent immobiles et ne répondent pas aux stimuli externes (environ 2-5 min, selon le poids et l’âge) de 10 cm.
  4. Transférer chaque poisson à la main sur un support de broche silicone sur mesure pour le traitement au laser ( Figure 1 a).
    MISE EN GARDE ! Le poisson peut rester anesthésié à l’extérieur du réservoir jusqu'à 10 min seulement.
  5. Pour inverser l’anesthésie après traitement et/ou d’imagerie, mettre le poisson-zèbre dans le récipient contenant le réservoir d’eau.
  6. Pour soutenir la reprise, créer un flux d’eau fraîche sur les branchies en déplaçant le poisson-zèbre en arrière dans l’eau.

3. Une lésion focale sur la rétine au laser

Remarque : laser à diode A 532 nm est utilisé pour créer des dommages légers focal sur la rétine du poisson-zèbre. Le montage expérimental du laser permet la mise en place d’une lésion rétinienne focale reproductible chez le poisson zèbre adulte.

  1. Mis en place la puissance du laser : 70 mW ; diamètre de l’antenne : 50 µm ; durée de l’impulsion : Mme 100
    attention ! L’utilisation de la lumière laser nécessite de protection individuelle appropriée et à l’étiquetage de la zone.
  2. Appliquer 1 à 2 gouttes d’hydroxypropylméthylcellulose de 2 % par voie topique dans les yeux avant le traitement et une lentille laser de 2,0 mm du fond de œil permet de focaliser le faisceau de pointage laser sur la rétine.
    MISE EN GARDE ! hydroxypropylméthylcellulose gouttes sont visqueux et peut provoquer des problèmes respiratoires si il va sur les branchies.
  3. Place quatre laser taches autour du nerf optique sur la gauche les yeux et utilisez le œil droit et non traitée comme contrôle interne.

4. In vivo Imagerie de la morphologie de la rétine

  1. au jour J0, visualiser la rétine zebrafish directement après l’induction de laser sans raviver leur fin de l’anesthésie. Dans tous les autres points dans le temps, employer l’anesthésie générale (voir la Section 2 : anesthésie systémique réversible). Placer le poisson-zèbre immobilisé sur un support de broche silicone sur mesure ( Figure 1 B, B.1).
  2. D’obtenir des images optimales, couper une lentille de contact hydrogel disponibles dans le commerce pour s’adapter à le œil de poisson-zèbre (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, épaisseur centrale = 0,4 mm) au moyen d’une perforatrice. Remplir la surface concave de la lentille de méthylcellulose et placez-le sur la cornée.
  3. Équiper le système OCT avec un objectif de lampe de fente sans contact de 78D.
  4. Focus image infrarouge (IR) dans l’IR + mode OCT ( Figure 2 a) à visualiser le fond de le œil et l’IR photos en cliquant sur le " Acquire " bouton ( Figure 2 b) pour localiser le taches sur la rétine à l’aide du système au laser ' logiciel de s.
    5. Mode de
  5. visualiser un article en trois dimensions des couches rétiniennes dans l’IR + OCT et prendre les photos en cliquant sur le " Acquire " bouton ( Figure 2 b). Observer la gravité des blessures dans la couche nucléaire externe (ONL) (voir la Section 3 : blessure focal sur la rétine au Laser) dans ces images.
  6. D’inverser l’anesthésie après traitement et/ou d’imagerie a placé le poisson-zèbre dans un récipient contenant de l’eau du réservoir.
  7. Pour soutenir la reprise, créer un flux d’eau fraîche sur les branchies en déplaçant le poisson-zèbre en arrière dans l’eau.
  8. Effectuer similaire en vivo imagerie rétinienne morphologie au jour 1, 3, 7, 14 et la semaine 6.

5. L’hématoxyline & éosine (H & E) coloration

  1. euthanasier zebrafish par submersion dans le froid (4 ° C) solution anesthésie sur la glace pendant au moins 10 min et enucleate les yeux immédiatement par le biais de petites pinces courbées.
  2. Fixer les yeux tout en paraformaldéhyde à 4 % (PFA) en tampon phosphate salin (PBS) à 4 ° C pendant 20 h et puis déshydrater les échantillons en une série graduée de l’alcool (xylène 100 % pendant 5 minutes deux fois, éthanol 100 % pendant 5 minutes deux fois, éthanol 96 % pendant 3 min deux fois et l’éthanol 70 % 3 mi n une fois).
    MISE EN GARDE ! PFA peut être irritant pour les yeux, du nez et des voies respiratoires supérieures. PFA est un carcinogène humain connu et un danger pour la reproduction présumé.
  3. Intégrer les échantillons à la paraffine, µm 5 coupes au niveau de la papille optique et montez-les sur lames de verre.
  4. Tacher les sections déparaffinées avec solution à 0,1 % acide hématoxyline pendant 5 min et tremper les lames deux fois dans l’eau distillée après trempage des diapositives dans le mélange de l’acide chlorhydrique (HCl dans 250 mL de 2 mL 25 % eau distillée eau) et ammoniac mélanger (2 mL 25 % d’ammoniaque dans 250 mL eau distillée). Tacher les sections avec l’éosine G solution aqueuse 0,5 % pendant 3 min après le développement de l’hématoxyline taches provoquées par l’eau du robinet pendant au moins 10 mn
  5. Monter les lames déshydratées dans milieu de montage de résine acrylique et d’observer les diapositives sous microscope photonique.

6. Immunohistochemistry pour l’Activation de MC

  1. chauffer les coupes déparaffinées dans le tampon de récupération de l’antigène (Tris-EDTA + 0,05 % de détergent non ionique, pH 9,0) pendant 3 min dans un cuit vapeur approprié ou un four à micro-ondes pendant 10-15 min et laver trois fois avec le SCT pour 5 min chaque.
  2. Cercle les sections avec un silicone stylo et ajouter 100 µL bloquant la solution (SCT + sérum normal de chèvre 10 % + 1 % d’albumine sérique bovine, pH 7,6) à température ambiante pendant 1 h.
  3. Tache avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-gliales protéine fibrillaire acide (GFAP) et avec l’anticorps monoclonal de souris anti-glutamine synthétase (GS), tous deux dans une dilution de 1 : 200 (40 µL par exemple). Incubez la diapositive dans une chambre humidifiée à 4 ° C durant la nuit. Laver trois fois avec TBS + 0,1 % Tween 20 pour chaque 5 min.
    4. Anticorps secondaires
  4. finition visualisation avec le cas échéant. Ce protocole utilisé une chèvre de anti-lapin IgG H & anticorps secondaire L vert GFAP et une chèvre anti-souris IgG H & rouge vif L GS, aussi bien dans une dilution de 1/500 à température ambiante pendant 1 h.
  5. Monter les diapositives avec support de montage contenant DAPI et observer les diapositives sous le microscope de fluorescence.

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Résultats

OCT en temps réel: afin d’analyser le rôle des MCs en réparation rétinienne, nous utilisons un modèle de blessure de laser induisant une zone bien délimitée de dommages à la rétine de poisson-zèbre. Le site de dommages a été photographié au moyen de in vivo OCT pour la première fois (jour 0) dans les 60 minutes suivant la lésion (Figure 3). Pour compenser l’optique de le œil de poisson, une lentille de contact sur mesure a été placée...

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Discussion

Régénération/dégénérescence rétinienne chez le poisson-zèbre a étudié différentes approches telles que de mort cellulaire cytotoxine22, une lésion mécanique23et lésion thermique24. Nous avons utilisé un laser à diode 532 nm à endommager la rétine de poisson-zèbre. Ainsi, notre modèle offre plusieurs avantages. Par exemple, nous avons créé rapidement une zone bien définie de lésions localisées dans la rétine externe, plus précisément dans la couche de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Martin Zinkernagel, MD, PhD et Miriam Reisenhofer, PhD pour son apport scientifique à mettre en place le modèle et Federica Bisignani pour son aide technique excellente.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution d’hématoxyline acideSigma-Aldrich, Buchs, Suisse2852
AlbumineSigma-Aldrich, Buchs, SuisseA07030
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-Aldrich, Buchs, Suisse5470
Dako PenDako, Glostrup, DanmarkS2002
Support de montage DAPIVector Labs, Burlingame, CA, États-UnisH-1200
Eosin G solution aqueuse 0,5 %Carl Roth, Arlesheim, SuisseX883.2
ÉthanolSigma-Aldrich, Buchs, Suisse2860
Acide éthylène-diamine tétraacétique (EDTA)Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseED
EukittSigma-Aldrich, Buchs, Suisse3989
Chèvre anti-lapin IgG H& L Alexa Fluor® ; 488Life Technologies, Zoug, SuisseA11008
Chèvre anti-souris IgG H& L Alexa Fluor® ; 594Life Technologies, Zoug, SuisseA11020
Sérum normal de chèvreDako, Glostrup, DanmarkX0907
Lentille de contact en hydrogelJohnson & Johnson AG, Zoug, Suissen.a.1-DayAcuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2 %OmniVision, Neuhausen, Suissen.a.Methocel2 %
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonateSigma-Aldrich, Buchs, SuisseA5040Tricaine, MS-222
Visulas 532sCarl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Allemagnen.a.532nm
Souris laser anticorps monoclonal anti-GSMillipore, Billerica, MA, USAMAB302
HRA + OCT Imaging SystemHeidelberg Engineering, Heidelberg, Germanyn.a.Spectralis
Heidelberg Eye ExplorerHeidelberg Engineering, Heidelberg, Germanyn.a.Version1.9.10.0
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma-Aldrich, Buchs, SwitzerlandP5368
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseP5368
Anticorps polyclonal anti-GFAP pour lapinInvitrogen, Waltham, MA, USA180063
Porte-goupille en siliconeHuco Vision AG Switzerlandn.a.Découpeà la main du plateau de stérilisation en conséquence.
Lampe à fente BM900Haag-Streit AG, Koeniz, Suissen.a.Adaptateur
de lampe à fenteIridex Corp., Mountain View, CA, USAn.a.Superfrost
Plus lames en verreGehard Menzel GmbH, Braunschweig, Allemagne10149870
TgBAC (gfap :gfap-GFP) zf167 (AB)strain KIT, Karlsruhe, Allemagne15204http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Solution saline tamponnée Tris (TBS)Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseP5912
Tween 20Sigma-Aldrich, Buchs, SuisseP1379
78D Lentille de lampe à fente sans contactVolk Optical, Mentor, OH, États-UnisV78C
XyleneSigma-Aldrich, Buchs, Suisse534056
Lentille laser de fond d’œiloculaire Ocular Instruments, Bellevue, WA, États-UnisOFA2-0
2100 RetrieverAptum Biologics Ltd., Southampton, Royaume-UniR2100-EUCuiseur vapeur

Références

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