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Construction et évaluation d’un modèle murin ostéolyse substance par l’exposition aux particules CoCrMo descellement aseptique

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DOI :

10.3791/56276

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17 février 2018

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1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un modèle murin ostéolyse substance par l’exposition aux particules CoCrMo, qui constitue un modèle animal idéal pour évaluer les interactions entre particules d’usure et de diverses cellules de descellement aseptique.

Résumé

Ostéolyse de provoquées par les particules d’usure est une cause majeure de descellement aseptique dans l’échec de l’arthroplastie, mais le mécanisme sous-jacent reste incertaine. En raison de longs suivis nécessaires pour la détection et la présence sporadique, il est difficile d’évaluer l’ostéolyse induite par l’ofparticle pathogenèse en cas cliniques. Optimale des modèles animaux sont donc nécessaires pour poursuivre ses études. Le modèle murin d’ostéolyse substance établie par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil efficace et valable pour évaluer les interactions entre les particules et les diverses cellules de descellement aseptique. Dans ce modèle, CoCrMo particules ont d’abord obtenus en courant continu de vide élevé trois électrodes et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate à une concentration de 50 mg/mL. Puis, 50 µL de la suspension qui en résulte a été appliquée au milieu de la calvaria murine après séparation du périoste crânien par sharp dissection. Après deux semaines, les souris ont été sacrifiées, et des spécimens de calotte cranienne ont été récoltés ; les évaluations qualitatives et quantitatives ont été effectuées par l’hématoxyline et éosine coloration et micro tomographie. Les points forts de ce modèle comprennent la simplicité de la procédure, une évaluation quantitative de la perte osseuse, rapidité de développement d’ostéolyse, utilisation potentielle transgénique ou des modèles knock-out et un coût relativement faible. Toutefois, ce modèle ne peut pour servir à évaluer la force mécanique et les effets chroniques des particules dans un descellement aseptique. Modèle murin ostéolyse substance générée par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil idéal pour évaluer les interactions entre les particules d’usure des cellules, par exemple, macrophages, fibroblastes, ostéoblastes et des ostéoclastes, au descellement aseptique.

Introduction

Le descellement aseptique est la cause la plus fréquente d’arthroplastie totale de hanche (THA) et l’échec d’arthroplastie (TKA) totale du genou, qui nécessite une chirurgie de révision1. Toutefois, le mécanisme sous-jacent reste peu clair2. Un suivi long est nécessaire pour la détection d’ostéolyse provoquées par les particules, dont la présence est rare ; par conséquent, il est difficile d’explorer sa pathogenèse en cas cliniques. Par conséquent, autres études mettant l’accent sur des mécanismes complexes de cellulaire et tissulaire nécessitent que les deux expériences in vivo en portent des modèles ostéolyse provoquées par les particules et des essais in vitro dans les cellules liées à l’os de l’homéostasie du3. Un modèle animal valide est important en révélant les effets des particules d’usure sur la perte osseuse, fournissant des preuves pour plus amples analyses cellulaires.

Un modèle murin ostéolyse substance construit par l’exposition aux particules CoCrMo est une méthode efficace et valable pour évaluer les interactions entre les particules et les diverses cellules de descellement aseptique. Dans ce modèle, particules CoCrMo causent ostéolyse substance en induisant des cytokines inflammatoires dans les macrophages, activation des ostéoclastes, inhibant la prolifération ostéoblastique et en encourageant l’apoptose ostéoblastique.

Il faut seulement deux semaines pour établir ce modèle. Ostéolyse peut être visualisé et quantifié par l’hématoxyline et éosine (H & E) souillant et micro computed tomography (micro-CT)2. En outre, ce modèle a une relativement faible coût et transgénique et knock-out souris modèles peuvent être utilisés pour dépister un grand nombre de composés à différentes doses3.

La procédure pour établir et évaluer ce modèle est simple. Tout d’abord, CoCrMo particules ont été obtenues en courant continu de vide élevé trois électrodes et remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 50 mg/mL. Puis, 50 µL de la suspension qui en résulte a été appliquée au milieu de la calvaria murine après séparation du périoste crânien par sharp dissection. Les souris ont été sacrifiées après deux semaines, et les échantillons de calotte cranienne ont été récoltés ; analyses qualitatives et quantitatives ont été effectuées par H & E coloration andmicro-CT.

Un modèle murin ostéolyse substance construit par l’exposition aux particules CoCrMo est un outil idéal pour évaluer les interactions entre particules CoCrMo et diverses cellules, telles que les macrophages, fibroblastes, ostéoblastes et les ostéoclastes, au descellement aseptique.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Nanjing.

1. préparation de particules CoCrMo

  1. Obtenir CoCrMo particules en utilisant un mécano vide élevé trois électrodes de courant continu4. Placez CoCrMo alliage dans l’instrument sous vide de Pa-3 10, 0,04 MPa argon et hydrogène 3 / 2 (v/v) et 650 A cathode actuel.
  2. Mesurer les diamètres de particules CoCrMo.
    1. Ajouter 1 mg de particules CoCrMo dans 1,5 mL d’éthanol anhydre.
    2. Remettre en suspension les particules CoCrMo dans l’éthanol anhydre par agitation ultrasonique à 28 kHz et 600 W pendant 5 min.
    3. Appliquer une goutte (environ 20 µL) de la suspension qui en résulte sur la table objective d’un microscope électronique à transmission (TEM). Série de photos TEM à 200 tension d’accélération kV et 0,24 nm résolution de capture.
    4. Le logiciel fourni permet de calculer la moyenne granulométrie de diamètre et de particules dans les micrographies TEM.
  3. Décontaminer les endotoxines
    1. Autoclave 50 g de particules pendant 15 minutes à 121 ° C et 15 psi.
    2. Détecter les endotoxines par un test quantitatif de Limulus Amebocyte Lysate (LAL) (< 0,25 % UE/mL était censée indiquer l’absence de l’endotoxine)5.
  4. Remettre en suspension les particules dans la solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 50 mg/mL en solution mère6.

2. construction du modèle substance ostéolyse

  1. Anesthésier âgés de 6 semaine C57BL/J6 souris (six souris par groupe) withpentobarbital (50 mg/kg). Le test du pincement permet d’évaluer le niveau de l’anesthésie. Éviter le dessèchement des yeux avec une solution saline normale.
  2. Placez la souris en position couchée. Enlever la fourrure sur le crâne avec un rasoir et désinfecter la peau à l’aide de boules de coton médical contenant 75 % d’éthanol.
  3. Pour la localisation du point, identifier deux points, y compris les milieux entre les deux yeux et les oreilles, respectivement. Ensuite, déterminer la frontière entre ces deux points et inciser la peau le long de la ligne ci-dessus avec des ciseaux (Figure 1 a).
  4. Retirez le périoste crânien de la calotte cranienne avec un scalpel (Figure 1 b)6.
  5. Peau de suture aux deux extrémités par simple suture interrompu.
  6. Faire une ligne de suture par le milieu de l’incision sans nouage. Tenir les deux extrémités de la ligne de suture.
  7. Incorporer 50 µL de la suspension de particules CoCrMo (50 mg/mL dans du PBS) au milieu de la calvarias (Figure 1)2.
  8. Nouez la dernière maille au sein de la simple suture interrompu (Figure 1).
  9. Maintenir la souris pour un autre 2 semaines.

3. évaluation du modèle de substance ostéolyse par Micro-TDM

  1. Sacrifier les souris avec le dioxyde de carbone. Décapiter les souris dans le plan horizontal. Retirez le tissu cérébral à l’intérieur et la peau et la fourrure à l’extérieur. Récolter le calvarias pour d’autres expériences.
  2. Éclaircir tous les tissus mous sur la calotte cranienne doucement avec des pincettes. Difficulté la calvarias déboisées dans 4 % paraformaldéhyde à 4 ° C pendant 24 h. immerger le calvarias en PBS 24h avant micro-tomodensitométrie.
  3. Analyser la souris calvarias par micro-CT haute résolution à une résolution isométrique de 18 µm et paramètres d’énergie des rayons x de 45 kV et 550 mA.
  4. Procéder à une reconstruction tridimensionnelle de données micro-CT avec le logiciel.
  5. Analyse qualitative et quantitative.
    1. Tout d’abord, sélectionnez la région carrée autour de la suture médiane comme la région d’intérêt.
    2. Ensuite, mesurer la densité minérale osseuse (DMO), OS volume/total volume (BV/TV), nombre trabéculaire (Tb.N), l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th), séparation/espacement trabéculaire (Tb.Sp) et pourcentage de porosité totale avec le logiciel pour micro-CT.
    3. Troisièmement, de comparer les trois groupes pour différentes mesures par ANOVA à. Pour l’analyse post-hoc de la variance, appliquer la méthode de Bonferroni2.

4. evaluation de la substance ostéolyse modèle par une coloration H & E

  1. Détartrage des échantillons de la calotte cranienne dans 15 % acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA)-PBS à 4 ° C. Changez la solution de détartrage tous les jours pendant 3 semaines.
  2. Incorporer les échantillons décalcifiées à la paraffine pour un 2 x 1 cm x 1 cube de cm et les couper en 2 sections de µm dans la zone de dépôt de particules.
  3. Tacher les sections à l’hématoxyline et éosine décrite précédemment7.
  4. Capturer les micrographies de la pathomorphism globale au microscope photonique.

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Résultats

Les produit nanoparticules CoCrMo internes étaient environ 50 nm (erreur standard de 3,56) de diamètre, tel que quantifié par TEM (Figure 2). Après l’exposition de souris calvarias CoCrMo particules, les animaux (n = 6 par groupe) ont été maintenus pendant encore deux semaines. Dans les deux semaines, l’incision de substance a été complètement guérie, et la suture peut tomber. Toute infection locale ou une pseudarthrose mai affecter l’évaluation de perte osse...

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Discussion

Il existe deux méthodes principales pour usure provoquées par les particules ostéolyse chez la souris : le modèle air-poche et le modèle de substance ostéolyse. Le modèle air-poche, une pochette-air générée par voie sous-cutanée est tout d’abord établie, suivi par introduction de particules usure et l’implantation dans le tissu d’OS8. Le mur de la pochette imite le périoste au descellement aseptique. Cependant, l’implantation de l’OS est non vasculaires sans activité biologique, ce qui rend diffic...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81572111), les sciences cliniques et technologie projet Fondation de la Province du Jiangsu (BL2012002), le projet de la recherche scientifique de Nanjing (201402007), les sciences naturelles Fondation de la Province de Jiangsu (BK20161385) et la Fondation spéciale de docteur en médecine chinoise Association (2015COS0810).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alliage CoCrMo de la prothèseWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIMatière première pour obtenir des nanoparticules CoCrMo
Fabriqué sous vide poussé à trois électrodes à courant continuCollège de science des matériaux & Ingénierie, Université de technologieauto-conçue
semaines souris mâles C57BL / 6JCentre de recherche animale modèle de l’Université de NanjingN000013
100 % éthanolRéactif de NanjingC0691514023Solvant de nanoparticules CoCrMo pour la transmission microscope électronique balayage
1,5 ml Tubes de microcentrifugationTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW603
Balance microanalytiqueShenzhen Qun long Instrument Equipment Co,. LTDEX125DZH
Agitateur à ultrasonsShanghai Yuhao scientific instrument co., LTDYH-200DHPour suspendre les nanoparticules CoCrMo
Microscope électroniqueà transmission FEITecnai G20
Logiciel SimplePCICompix Inc.Version 6.6Pour calculer le diamètre moyen et la distribution granulométrique.
Plateau de stérilisation à haute hauteurQIULONGYIQIKYQL-100DSPour décontaminer l’endotoxine
Limulus Amebocyte Lysat (LAL) EssaiCharles RiverR13025Pour détecter l’endotoxine  ;
15 ml Tubes de microcentrifugationTaizhou Suyi MedicalB122
Saline tamponnée au phosphateBoster Biological TechnologyAR0030Solvant de la solution mère de nanoparticules CoCrMo
Pentobarbital SodiumSigmaP3761Pour anesthésier les souris
Solution saline normaleSACKLERSR8572EP-15Pour prévenir le dessèchement des yeux des souris
75 % ÉthanolNanjing RéactifC0691560275Désinfection
Boule de coton médicalShuitao1278298933Rasoir de désinfection
KemeiKM-3018Pour raser la fourrure
CiseauxRWD LIFE SCIENCES12005-10Pour inciser la peau
SutureRWD LIFE SCIENCEF34001-01Pour suturer la peau
Porte-aiguilleRWD LIFE SCIENCEF33001-01Pour suturer la peau
AiguilleRWD LIFE SCIENCER14003-12Pour suturer la peau
Pince pour vaisseauxRWD LIFE SCIENCEF22003-09Pour suturer la peau
ScalpelRWD LIFE SCIENCES31010-01Pour récolter le calvaria
Pince à épilerRWD LIFE SCIENCEF12006-10Pour récolter le calvaria
100 µ ; Pipettes LEppendorf3120000240Pour encastrer des particules en suspension dans les calvatias
100 µ ; Pointes de pipetteL AXYGENT-200-YPour encastrer les particules en suspension dans les calvatias
5 ml MicrotubesTaizhou Weierkang Medical Supplies co., LTDW621
4 % ParaformaldéhydeServicebioG1101Fixation
Micro Tomodensitométrie  ;SkyScanSkyScan1176
Ethylène Diamine Acide tétraacétiqueServicebioG1105Détartrage
ParaffineServicebio#0001
Machine à trancher la paraffineLeicaRM2125RTS
Diapositive en verreServicebioG6004
Verre de couvertureServicebio200
Kit de coloration HEServicebio#1-5Coloration HE
Microscope optiqueNikonE200
de Nanjing Machine 6

Références

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
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  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
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  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

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Mots-clés

Mod le murinAnalyse par micro CTColoration H et ESuspension de particulesP rioste cr nienDensit min rale osseuseImagerie TEM

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