G2-seq : Une haut débit basée sur le séquençage Technique d’identification tard reproduisant des régions du génome

Summary

Nous décrivons une technique permettant de combiner la cytométrie en flux et le séquençage à haut débit pour identifier des régions fin de réplication du génome.

Abstract

Nombreuses techniques ont été développées pour suivre la progression de la réplication de l’ADN par l’intermédiaire de la phase S du cycle cellulaire. La plupart de ces techniques ont été dirigée vers l’élucidation de l’emplacement et le calendrier d’ouverture de la duplication du génome, et non son achèvement. Toutefois, il est essentiel que nous comprenons des régions du génome qui sont les dernières à terminer la réplication, car ces régions souffrent de taux élevés de cassures chromosomiques et de mutation, et ils ont été associés à la maladie et le vieillissement. Ici, nous décrivons comment nous avons étendu une technique qui a été utilisée pour surveiller l’initiation de la réplication pour plutôt identifier ces régions du génome modifié de réplication complet. Cette approche repose sur une combinaison de cytométrie en flux et séquençage à haut débit. Bien que ce rapport se concentre sur l’application de cette technique à la levure, l’approche peut être utilisée avec toutes les cellules qui peuvent être triés dans un cytomètre en flux selon la teneur en ADN.

Introduction

Réplication du génome des eucaryotes est initiée à de nombreux endroits discrets, appelés origines de réplication, de laquelle la réplication fourchettes procéder dans les deux sens (examinées par Fragkos et al., 2015¹). Origines varient dans leur calendrier et l’efficacité de la mise à feu, et plusieurs techniques ont été développées pour surveiller l’activité d’origine de réplication et d’élucider les causes de cette variation. L’activité d’origine individuelle peut être déduite des niveaux de simple brin ADN², qui se forme autour des origines actives, ou en utilisant l’électrophorèse sur gel 2D pour surveille....

Protocol

1. préparation des cellules pour Flow Cytometry tri

1. Inoculer 15 mL tubes à essai contenant 8 mL de bouillon YEPD telles que les cultures atteignent une densité de 5 x 10⁶ à 1. 5 x 10⁷ cellules / mL après une nuit de croissance (Voir discussion note 1).
2. Tournez en bas des cellules de levure (1 400 x g, à température ambiante ou à 4 ° C) dans un tube à centrifuger 15 mL bouchon à vis pendant 5 min, de remettre en suspension des cellules dans 1,5 mL d’éthanol à 70 % et le transfert d’un tube à centrifuger 1,6 mL, laisser ce reposer pendant 1 h à température ambiante ou au moins de 3 h sur glace ( peuvent être conservés indéfinime....

Results

Nous avons utilisé la procédure décrite ci-dessus pour recenser les sites de réplication tardif dans la levure de bière. Cette approche à l’aide d’une région de réplication fin connue sur un chromosome artificiel des tests prouvé la technique précis et fiable. Nos résultats ont également démontré l’importance biologique de l’achèvement dans les délais de réplication en montrant qu’une région de réplication tardive sur le chromosome 7, que nous avons identifié comme fin de réplication sur .......

Discussion

Bien que cette technique est robuste et relativement simple, une attention particulière devrait être consacrée à ce qui suit :

(1) nous recommandons que les cultures poussent pendant au moins 12 h avant qu’ils atteignent la phase logarithmique, puisque les différences manifestent dans les distributions de cycle cellulaire si les cultures sont récoltés après avoir atteint la densité souhaitée juste 4 h après l’inoculation. Notre hypothèse est qu’une distribution de cycle cellulaire qui a attein.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar Kit d’ADN génomique	Genesee Scientific	11-323
1 & micro ; M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	remettre en suspension dans 50 mM de citrate de sodium, pH 7,2
50 mM de citrate de sodium, pH 7,2
RNase (0,25 mg / mL)	Sigma	R6513	0,25 mg / mL de RNaseA remise en suspension dans 50 mM de citrate de sodium, pH 7,2, faire bouillir la solution de RNase pendant 10 minutes avant la première utilisation uniquement, et à partir de là conserver à -20° ;
solution de protéinase K (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	remise en suspension dans 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50 % glycérol, conserver à -20° ; C
Modèle 50 Démantailleurs sonique	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Colonnes Zymo-spin III	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Fluorimètre Qubit 3.0	ThermoFisher	Q33216
Ultrasoniseur focalisé Covaris modèle LE220	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Kit de préparation d’échantillons	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500	instrument Illumina	SY&ndash ; 401&ndash ; 2501
logiciel d’alignement gsnap	logiciel open source / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap