G2-seq : Une haut débit basée sur le séquençage Technique d’identification tard reproduisant des régions du génome

Summary

Nous décrivons une technique permettant de combiner la cytométrie en flux et le séquençage à haut débit pour identifier des régions fin de réplication du génome.

Abstract

Nombreuses techniques ont été développées pour suivre la progression de la réplication de l’ADN par l’intermédiaire de la phase S du cycle cellulaire. La plupart de ces techniques ont été dirigée vers l’élucidation de l’emplacement et le calendrier d’ouverture de la duplication du génome, et non son achèvement. Toutefois, il est essentiel que nous comprenons des régions du génome qui sont les dernières à terminer la réplication, car ces régions souffrent de taux élevés de cassures chromosomiques et de mutation, et ils ont été associés à la maladie et le vieillissement. Ici, nous décrivons comment nous avons étendu une technique qui a été utilisée pour surveiller l’initiation de la réplication pour plutôt identifier ces régions du génome modifié de réplication complet. Cette approche repose sur une combinaison de cytométrie en flux et séquençage à haut débit. Bien que ce rapport se concentre sur l’application de cette technique à la levure, l’approche peut être utilisée avec toutes les cellules qui peuvent être triés dans un cytomètre en flux selon la teneur en ADN.

Introduction

Réplication du génome des eucaryotes est initiée à de nombreux endroits discrets, appelés origines de réplication, de laquelle la réplication fourchettes procéder dans les deux sens (examinées par Fragkos et al., 2015¹). Origines varient dans leur calendrier et l’efficacité de la mise à feu, et plusieurs techniques ont été développées pour surveiller l’activité d’origine de réplication et d’élucider les causes de cette variation. L’activité d’origine individuelle peut être déduite des niveaux de simple brin ADN², qui se forme autour des origines actives, ou en utilisant l’électrophorèse sur gel 2D pour surveiller la réplication spécifiques intermédiaires³, qui peuvent être détectés avec sondes radioactives. Ces deux techniques sont plus facilement appliquées chez S. cerevisiae que dans les cellules de mammifères, parce que les origines sont limitées à des séquences spécifiques connues dans l’ancien. Avec l’avènement des puces à ADN, il est devenu possible d’évaluer l’origine de tir dans le monde. Tout d’abord, cela a été fait par marquage ADN avec des isotopes lourds, libérant des cellules d’un bloc G1 dans isotopes légers contenant moyens et ensuite suivi la formation de lourd-léger hybride ADN dans le génome de⁴. L’introduction du séquençage à haut débit a permis semblable pangénomique suivi d’activité d’origine sans l’obligation de marquage isotopique coûteux. Les cellules ont été triés dans un cytomètre en flux selon la teneur en ADN et leur ADN soumis au séquençage en profondeur. Parce que la couverture de la séquence procède de 1 x à 2 x au cours de la phase S, synchronisation de réplication relative peut être évaluée en comparant les profondeurs lire des cellules en phase S à celles de G1 ou G2,^5,6. Ces techniques, en particulier appliqués à la levure, a conduit à une meilleure compréhension de comment les séquence d’ADN, structure de la chromatine et protéines de réplication de l’ADN réglementent l’efficacité et le calendrier d’origine.

La transmission fidèle de l’information génétique au cours de la prolifération cellulaire ne nécessite pas seulement réussie initiation de la réplication de l’ADN, qui se déroule aux origines, mais aussi la réussite de la réplication, ce qui se produit où se rencontrent les fourches de réplication. Comme l’initiation de la réplication, le calendrier d’achèvement de la réplication varie au sein du génome avec certaines régions restantes non répliquées, même tard dans le cycle cellulaire. Ces régions peuvent être particulièrement éloignées des origines de réplication active ou peuvent contenir des séquences ou des structures de la chromatine qui entravent les ADN polymérases. Réplication tardif des régions peut se manifester comme des sites fragiles, qui sont associés à des cassures chromosomiques et des taux de mutation plus élevés et ont été impliqués dans le cancer et le vieillissement^7,8,9. Toutefois, malgré l’importance du bon achèvement de la réplication de l’ADN dans le maintien de la stabilité du génome, de comprendre où et comment cela se déroule traîne loin derrière celle de l’initiation de la réplication. Et tandis que des gènes individuels dont la réplication tardive a été associée à la maladie ont été étudiées avec, par exemple, qPCR¹⁰, études mondiales visant à élucider les emplacements et les causes de retard font défaut, la réplication sous-jacentes. Ici, nous décrivons une technique nous parler pour comme « G2 seq » dans lequel nous combinons la cytométrie en flux avec le séquençage à haut débit pour faire la lumière sur l’achèvement de la réplication du génome dans¹¹de levure. Avec des modifications mineures, ce protocole peut être adapté à toutes les cellules qui peuvent être à débit-triés selon la teneur en ADN.

Protocol

1. préparation des cellules pour Flow Cytometry tri

1. Inoculer 15 mL tubes à essai contenant 8 mL de bouillon YEPD telles que les cultures atteignent une densité de 5 x 10⁶ à 1. 5 x 10⁷ cellules / mL après une nuit de croissance (Voir discussion note 1).
2. Tournez en bas des cellules de levure (1 400 x g, à température ambiante ou à 4 ° C) dans un tube à centrifuger 15 mL bouchon à vis pendant 5 min, de remettre en suspension des cellules dans 1,5 mL d’éthanol à 70 % et le transfert d’un tube à centrifuger 1,6 mL, laisser ce reposer pendant 1 h à température ambiante ou au moins de 3 h sur glace ( peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° C) (voir point de Discussion (2)).
3. Tournez en bas des cellules de levure dans les microtubes (14 000 x g, 4 ° C) pendant 1 min, resuspendre dans 1 mL de citrate de sodium 50 mM, pH 7,2, centrifuger (14 000 x g, 4 ° C) pendant 1 min, aspirer le surnageant, resuspendre dans 1 mL de citrate de sodium 50 mM, pH 7,2 , contenant 0,25 mg/mL solution de RNAse pendant 1 h à 50 ° C ou une nuit à 37 ° C en bain de bloc ou de chaleur.
4. Ajouter 50 µL de solution de protéinase K (20 mg/mL resuspendues dans 10 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl₂, 50 % en poids de glycérol de volume) et incuber pendant 1 heure à 50 ° C.
5. Tournez en bas des cellules (14 000 x g, 4 ° C), remettre en suspension des cellules dans 1 mL de citrate de sodium 50 mM, pH 7,2, tournez en bas (14 000 x g, 4 ° C), aspirer le surnageant avec vide, remettre en suspension dans 1 mL 1 µM vert acide nucléique souche resuspendue dans 50 mM du citrate de sodium , pH 7,2 et incuber dans l’obscurité pendant 1 h à température ambiante, laisser agir 2 x pour 2 s chaque (puissance de sortie 2 watts).

2. cellule Tri

1. À l’aide d’un trieur de cellules, trier les cellules en fonction de la teneur en ADN en phases G1, S, « G2 précoce » et « fin G2 », recueillant au moins 1,6 millions de cellules haploïdes de chaque phase du cycle cellulaire comme dans la Figure 1 (voir point de Discussion (3)).
2. Cellules de transfert pour microtubes et faire tourner les cellules pendant 20 min à 14 000 x g à 4 ° C dans des microtubes et aspirer le surnageant avec aspirateur (le culot peut être conservé congelés à-20 ° C indéfiniment ; voir point 4).

3. ADN Extraction et la préparation de séquencer des bibliothèques

Remarque : Les étapes suivantes sont basées sur « Protocole I » dans l’extraction de l’ADN génomique de levure Kit (voir Table des matières).

1. Ajouter 120 µL de Digestion « tampon », une mémoire tampon brevetée qui permet l’enzyme lytique de la levure digérer les parois cellulaires et 5 µL d’enzyme lytique de la levure, remettre en suspension au vortex et incuber à 37 ° C pendant 40 à 60 min.
2. Ajouter 120 µL de « Tampon de lyse, « un propriétaire tampon qui contient un détergent et vortex dur pour 10-20 s.
3. Ajouter 250 chloroforme µL - bien mélanger pendant 1 min.
4. Tournant à vitesse maximale pendant 2 minutes.
5. Charger le surnageant sur la colonne de liaison ADN et centrifuger à vitesse maximale pendant 1 minute.
6. Ajouter 300 µL d’ADN de lavage « tampon », une mémoire tampon de propriété industrielle qui contient de l’éthanol et centrifuger pendant 1 min à vitesse maximale. Jeter le débit à travers, ajouter 300 µL de tampon de lavage ADN et répétez le processus de lavage.
7. Transférer la colonne dans un tube à centrifuger frais, ajouter 60 µL d’eau (pas TE) - attendre 1-3 min et puis centrifuger pendant 10 s pour éluer l’ADN.
8. Mesurer la concentration en ajoutant 5 µL d’ADN à 195 µL de réactif de haute sensibilité ADN double brin qui a été dilué 1 : 200 dans un tampon haute sensibilité ADN double brin, puis mesure de fluorescence dans un fluorimètre, à l’aide de 10 µL de normes fournis pour l’étalonnage ; attendre entre 10 et 50 ng de la récolte totale de l’ADN.
9. Soniquer (PIC Incident puissance 450, facteur d’utilisation 30 %, de Cycles par la Burst 200, temps de traitement 60 s, 6 niveau d’eau) pour briser l’ADN en fragments bp 250-350.
10. Préparer une bibliothèque à l’aide de la trousse de préparation des échantillons ADN et il (lectures de single-end au moins 10 millions de 50 PB) séquence sur l’instrument de séquençage de l’ADN en mode rapide (voir la note de synthèse (5)).

4. analyse du séquençage des données et génération de réplication profils

1. Aligner les séquences à Saccharomyces cerevisiae sacCer3 génome à l’aide de Gsnap¹² (voir la note de synthèse (6)).
2. Déterminer par nucléotide lu profondeurs à l’aide « genomeCoverageBed » logiciel^{13 des Bedtools}.
3. Déposez crampons artéfactuelles dans les profondeurs de la lecture, le cas échéant (voir la note de synthèse (7)).
4. Lisses lu profondeurs par chromosome utilisant médianes dans un 20KO coulissante en utilisant la fonction « runMean » dans l’affaire R paquet « caTools » (voir la note de synthèse (8)).
5. Intrigue lu profondeurs en phase S, G2 précoce et tardive G2 en pourcentage des profondeurs de lire entièrement répliqués (voir la note de synthèse (9)).

Results

Nous avons utilisé la procédure décrite ci-dessus pour recenser les sites de réplication tardif dans la levure de bière. Cette approche à l’aide d’une région de réplication fin connue sur un chromosome artificiel des tests prouvé la technique précis et fiable. Nos résultats ont également démontré l’importance biologique de l’achèvement dans les délais de réplication en montrant qu’une région de réplication tardive sur le chromosome 7, que nous avons identifié comme fin de réplication sur ...

Discussion

Bien que cette technique est robuste et relativement simple, une attention particulière devrait être consacrée à ce qui suit :

(1) nous recommandons que les cultures poussent pendant au moins 12 h avant qu’ils atteignent la phase logarithmique, puisque les différences manifestent dans les distributions de cycle cellulaire si les cultures sont récoltés après avoir atteint la densité souhaitée juste 4 h après l’inoculation. Notre hypothèse est qu’une distribution de cycle cellulaire qui a attein...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
YeaStar Kit d’ADN génomique	Genesee Scientific	11-323
1 & micro ; M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	remettre en suspension dans 50 mM de citrate de sodium, pH 7,2
50 mM de citrate de sodium, pH 7,2
RNase (0,25 mg / mL)	Sigma	R6513	0,25 mg / mL de RNaseA remise en suspension dans 50 mM de citrate de sodium, pH 7,2, faire bouillir la solution de RNase pendant 10 minutes avant la première utilisation uniquement, et à partir de là conserver à -20° ;
solution de protéinase K (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	remise en suspension dans 10 mM Tris, pH 7,5, 2 mM CaCl2, 50 % glycérol, conserver à -20° ; C
Modèle 50 Démantailleurs sonique	Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Colonnes Zymo-spin III	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher	Q32851
Fluorimètre Qubit 3.0	ThermoFisher	Q33216
Ultrasoniseur focalisé Covaris modèle LE220	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Kit de préparation d’échantillons	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500	instrument Illumina	SY&ndash ; 401&ndash ; 2501
logiciel d’alignement gsnap	logiciel open source / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap