Quantification des informations codées par Gene Expression niveaux pendant la durée de vie Modulation sous large gamme diététique Restriction chez c. elegans

Summary

Ici, nous présentons un cadre permettant de relier le large éventail de restriction alimentaire à durée de vie et l’expression des gènes. Les auteurs décrivent des protocoles pour large gamme restriction alimentaire et l’imagerie quantitative de l’expression des gènes sous ce paradigme. Nous exposons plus amples analyses informatiques pour révéler qui sous-tendent les fonctions de traitement d’informations des circuits génétiques impliqués dans la détection de nourriture.

Abstract

Systèmes sensoriels que les animaux puissent détecter, traiter et répondre à leur environnement. Abondance de la nourriture est un signal environnemental qui a des effets profonds sur le comportement et la physiologie animale. Récemment, nous avons démontré que la modulation de la longévité chez le nématode Caenorhabditis elegans , par l’abondance de la nourriture est plus complexe qu’auparavant reconnu. La souplesse de la durée de vie à des changements au niveau alimentaire est déterminée par les gènes spécifiques qui agissent en contrôlant l’informatique au sein d’un circuit neuronal. Notre cadre combine l’analyse génétique, l’imagerie quantitative de haut débit et théorie de l’information. Ici, nous décrivons comment ces techniques peuvent servir à caractériser toute gène qui a une pertinence physiologique au large éventail de restriction alimentaire. Plus précisément, ce flux de travail est conçu pour révéler comment un gène d’intérêt régule la longévité dans le large éventail de restrictions alimentaires ; puis d’établir comment l’expression du gène varie avec le niveau de la nourriture ; et enfin, de fournir une quantification non biaisée de la quantité d’information véhiculée par l’expression des gènes sur l’abondance de la nourriture dans l’environnement. Lorsque plusieurs gènes sont examinés simultanément dans le cadre d’un circuit neuronal, ce flux de travail peut découvrir la stratégie de codage utilisée par le circuit.

Introduction

Tous les organismes doivent être en mesure de détecter et répondre aux changements dans l’environnement pour assurer leur survie. Chez les animaux, le système nerveux est le premier détecteur et transducteur des informations sur l’environnement et coordonne la réponse physiologique à tout changement qui pourrait affecter la survie de l’organisme¹. Abondance de la nourriture est un signal environnemental qui est bien étudié dans plusieurs contextes qui ne régit les comportements liés à l’alimentation, tels que la recherche de nourriture², mais également une incidence sur la longévité de l’animal. La modulation de la durée de vie par des changements dans l’abondance de la nourriture est un phénomène connu comme restriction alimentaire (DR) et a la conservation évolutive large³.

Le nématode Caenorhabditis elegans est un système puissant modèle pour aborder des questions biologiques fondamentales. Une pléthore de techniques ont été développées qui permettent pour la manipulation du génome du ver, tels que les gènes RNAi et in vivo des techniques d’édition. La petite taille physique du ver et sa transparence optique se prêtent également à en vivo imagerie de reporters fluorescents fois transcriptionnels et translationnelles et l’utilité des technologies à haut débit telles que la microfluidique⁴. Ensemble, ces outils peuvent être exploitées pour examiner comment neural circuits directs comportement animal.

C. elegans est une communauté et plusieurs méthodes ont été publiées qui permettent un contrôle précis de l’abondance de la nourriture en manipulant la concentration bactérienne^5,6,7,8 . Au sein de la communauté de recherche de c. elegans , DR a été étudié dans deux contextes différents. Le premier peut être qualifié de « classique DR », car elle reflète les changements observés en réponse à la baisse des concentrations de nourriture chez d’autres organismes. Dans ce contexte, diminuant l’abondance de la nourriture de ad libitum niveaux résulte en une durée de vie accrue jusqu'à ce qu’un niveau optimal est atteint, après que cette longévité point diminue avec une réduction supplémentaire des aliments^6,,^{7, 9}. Le deuxième cadre en vertu duquel le DR a été étudié chez c. elegans est privation alimentaire dont la longévité vers est augmentée par l’élimination complète de toute nourriture bactérienne source^10,11. Dans Entchev et al., (2015)¹², nous a montré que la complexité de la RD résultant de ces deux paradigmes différents peut être examinée en même temps, dans un contexte, nous appelons « large gamme DR ». En utilisant le protocole décrit ci-dessous, nous avons identifié une nouvelle classe de gènes impliqués dans la DR que dans les deux sens moduler la réponse de l’espérance de vie à l’abondance de nourriture et sont impliqués dans les circuits neuronaux qui détectent la nourriture¹² (Figure 1).

La réponse d’un animal aux changements dans l’environnement intègre une séquence de processus biologiques qui relient le système sensoriel à des interactions complexes de régulation véhiculant des informations environnementales à la physiologie. Bien que les détails mécanistiques de ce « flux d’informations » sont souvent inconnues, outils génétiques permet d’acquérir un aperçu de comment ce calcul complex est organisé entre les différentes composantes biologiques. Dans nos travaux récents, nous avons montré que daf-7 et tph-1 sont impliqués dans la transmission des informations environnementales concernant l’abondance de la nourriture grâce à un circuit neuronal détection de nourriture qui module la durée de vie dans c. elegans^{12 , 13}. en appliquant le cadre mathématique de la théorie de l’information¹⁴, nous avons été en mesure de quantifier la quantité d’information sur l’environnement, en termes de bits, qui est représentée par les changements d’expression de gène daf-7 et tph-1 dans des neurones spécifiques différents niveaux différents aliments. Sur cette base, nous étions alors en mesure de découvrir la stratégie d’encodage employée par ce circuit neuronal et comment elle est sous contrôle génétique (Figure 2).

Dans le protocole suivant, nous décrivons les étapes requises pour comprendre quels sont les effets des gènes d’intérêt exprimés dans les neurones spécifiques et comment ils participent à la circulation de l’information sur les aliments de l’environnement à durée de vie. De façon générale, notre cadre est divisé en deux protocoles expérimentaux et un flux de travail numérique. Pour les aspects expérimentaux, il est essentiel de disposer des mutants des gènes d’intérêt pouvant être examinés en vertu de la large gamme Dr Faithful transcriptionnelles journalistes sont également nécessaires pour quantifier le niveau d’expression des gènes au niveau de différents aliments. Pour pouvoir effectuer l’analyse computationnelle discuté dans notre méthode, le dataset doit être de dimensions suffisantes pour fournir des estimations significatives des distributions de l’expression. Même si nous fournissons des codes sources de modèle pour les analyses, l’utilisateur doit être familiarisé avec le langage de la théorie de l’information qui est intensivement employé tout au long de notre cadre de calcul. Les codes sources sont rédigés dans R et C++. Par conséquent, un certain niveau de compétence de programmation est également nécessaire de les appliquer d’une manière significative.

Protocol

1. préparation des Cultures bactériennes et plaques pour général Worm Culture

1. préparer 100 mL de lysogénie (LB) bouillons dans un flacon de verre de 250 mL et stériliser à l’autoclave.
2. Inoculer la bouteille avec une seule colonie de la souche d’Escherichia coli OP50 et incuber à 37 ° C pendant la nuit et puis stockez la culture à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
3. Préparer 5 L de stérile nématode croissance moyenne (NGM) agar ¹⁵ aliquote mL 12 volumes et en boîtes de Pétri stériles 6 cm en plastique.
4. Permettre l’agar régler du jour au lendemain et ensuite stocker à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
5. Graine NGM plaques au moins 3 jours avant d’utiliser avec 225 μl de la culture de OP50 réfrigérée. Stocker les plaques à 20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

2. Préparation des Cultures bactériennes et des Dilutions pour expériences

1. préparer deux lots de 500 mL de médias LB dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L et stériliser à l’autoclave.
2. Inoculer chaque ballon avec une seule colonie de OP50 et se développer à 37 ° C, secouant à 200 tr/min pendant environ 14 h.
3. Supplément les cultures avec la streptomycine antibiotique à une concentration finale de 50 μg/mL. Poursuivre secouer pendant 30 min à 37 ° C puis placer les ballons sur glace pendant 15 min.
4. Transfert de 450 mL de chaque culture dans des bouteilles de centrifugeuse stérile distinct (idéalement capacité bouteilles de 500 mL pour éviter le dédoublement des cultures). Conserver la culture reste sur la glace, car il sera utilisé pour déterminer la concentration des bactéries.
5. Tournez en bas les bouteilles à 4500 x g dans un ensemble de centrifugeuse réfrigérée à 4 ° C pendant 25 min. jetez surnageant et stocker les bouteilles sur la glace.
6. Diluer 100 μL de culture reste de chaque fiole dans 900 μL de stérile lb utiliser 1 mL de LB stérile à zéro le spectrophotomètre et ensuite déterminer l' OD ₆₀₀ de la dilution 10 fois de chaque culture. Si, par exemple, l' OD ₆₀₀ de la dilution 10 fois de la culture au jour le jour est de 0,28 puis la culture avait une réelle de OD ₆₀₀ de 2.8.
7. Utiliser une solution stock de bactéries de 1,12 x ¹⁰ OP50 10 cellules/mL, ce qui équivaut à une OD ₆₀₀ de 56. Par conséquent, à l’aide de l’exemple OD ₆₀₀ de 2,8 par dessus, resuspendre le culot de la culture de 450 mL dans un 20 ^ème du volume original, qui dans ce cas est de 22,50 mL. Remettre en suspension les bactéries avec une solution stérile de basale S additionnée de streptomycine à 50 μg/mL (SB + streptocoque).
8. Resuspendre le culot dans le volume approprié de SB stérile + strep.
9. Faire toutes les concentrations suivantes utilisées dans des expériences de dilutions successives du travail social de SB + strep en utilisant les facteurs de dilution énumérés au tableau 1.

3. Réglage vers le haut la durée de vie des expériences

Remarque : la durée de vie analyses sur la culture de tissu de 6 cm traité contenant 12 mL de gélose NGM additionné de streptomycine et la carbénicilline (NSC), tous deux à une concentration finale de 50 μg/mL. Ces plaques de culture de tissus sont bien adaptés pour des essais de durée de vie sans aucun ou très faibles concentrations bactériennes, comme les vers sont significativement moins enclins à coller à la paroi de la plaque et desséchant. L’utilisation de deux antibiotiques différents empêche la souche OP50 de développer la résistance aux médicaments, ce qui est essentiel dans le contrôle de la concentration bactérienne sur la plaque. En outre, en inactivant les bactéries avec des antibiotiques, nous minimiser les effets sur ver la durée de vie en raison de l’infection pathogène ¹⁶. Cela nous permet de n'envisager que les composantes liées à l’alimentation de la concentration bactérienne dans ces expériences. De nombreuses études de vieillissement de c. elegans supplément plaques NGM avec le chimique fluoro-2 ′-déoxyuridine (FUdR) pour restituer les adultes stérile. Cependant, l’utilisation de FUdR peut être problématique, car son utilisation peut causer plusieurs problèmes de confusion avec la longévité des essais ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21}. Entchev et coll. (2015) ¹² a contourné ce problème en exposition des larves de L4 à Arni d’oeuf-5 ^{22 , 23}, qui inhibe la transition d’ovocyte-à-embryon en bloquant la formation de la coquille de fécondés ovocytes c. elegans, entraînant leur mort.

Les souches de

1. culture c. elegans qui vont être dosés sur ensemencées plaques NGM à 20 ° C. laisser les plaques à affamer pour s’assurer que tous les animaux sont cultivés de façon uniforme et potentiellement compte pour n’importe quel effets transgénérationnels de conditions de développement.
2. Transfert de faim larves L1 nouvelles plaques NGM ensemencées en découpant un petit morceau d’agar (5 x 5 mm) de la plaque après le jeûne à l’aide d’un scalpel stérile et déposer sur une plaque de nouveau, un processus dénommé ' segmentation ' par le c. elegans recherche comm l’unité ¹⁵. Cultiver les vers jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade L4. Cinq larves de L4 par souche sont ensuite transférés à plaques individuelles de NGM ensemencés et conservés à 20 ° C. Ces animaux représente la génération de P0.
3. L4 utilisation descendants de la génération de P0 à mettre en place la génération F1. Placer individuellement larves F1 L4 de la souche de type sauvage N2 sur 30 planches semées de NGM.
   Remarque : Pour des souches mutantes, le nombre de plaques nécessaires dépend de leur taux de croissance. Par exemple, daf-7(ok3125) animaux subissent un arrêt transitoire dauer à 20 ° C. Ainsi, cette souche produit moins larve L4 qu’une plaque de type sauvage N2 worms.
4. Pour compenser cette différence, mis en place des plaques de daf-7(ok3125) un jour plus tôt que N2 assiettes et à un plus grand nombre, un bon rapport de travail est de 3:1.
5. Transfert synchronisé progéniture L4-stade des parents F1 aux plaques NGM additionnés de 1 mM IPTG et 50 carbénicilline µg/mL (ARNi plaques) qui ont été ensemencés avec 225 µL de bactéries HT115 exprimant dsRNA ciblant le gène de l’oeuf-5 et conservés au 20 ° C pendant 24 h. Au moins 360 vers par souche, maintenue à une densité de 15 animaux par plaque, sont nécessaires par expérience.
6. Après l' oeuf-5 traitement Arni, transférer les vers aux plaques de NSC ensemencés avec 225 µL de la OP50 imprégnées de streptomycine à une concentration de 2 x 10 ⁹ cellules/mL (tableau 1) pour 24 heures supplémentaires à 20 ° C. Pour éviter des dégâts physiques à la worms au courant et tous les transferts ultérieurs, doucement ramasser les animaux de dessous le ver en utilisant un ver très fin légèrement incurvé pick. Flotteur les animaux hors le ver choisir en l’immergeant dans une goutte de 10 µL de SB + streptocoque placé sur la surface de la nouvelle plaque de.
7. Le lendemain, redistribuer les vers aux plaques de NSC représentant chacune des aliments niveaux lISTED dans le tableau 1, mais aussi un ensemble de plaques de NSC qui ne contiennent aucuns bactéries. Toutes les plaques de NSC avec 225 µL de la concentration pertinente des bactéries des semences et les plaques de NSC exempte de bactéries avec 225 µL SB + infection streptococcique des graines. Maintenir les vers à une densité de 15 animaux par plaque, entraînant au moins quatre plaques par condition d’aliments par souche. Passer les plaques à la température désirée expérimentale.
8. Transfert aux plaques de NSC fraîches ensemencée avec concentration dans la nourriture appropriée conformément au calendrier figurant dans le tableau 2.
9. Animaux de score pour le mouvement en poussant délicatement avec un fil pick. L’absence de réponse est marqué comme mort. Marquer les animaux pour mort à chaque transfert point et puis tous les jours après le dernier point de transfert.

4. Réglage des expériences d’imagerie

Remarque : les étapes décrites dans cette section ne suffisent pas à générer suffisamment vers par souche d’imagerie une condition expérimentale aliments à une température donnée. Ce protocole peut évoluer pour s’adapter le nombre de conditions qui sont projetés sur un jour donné. Cependant, il faut dans le dispositif expérimental pour s’assurer que l’échéancier est raisonnable et que les animaux à travers différentes souches n’ont pas une différence d’âge supérieure à 12 heures le jour de l’imagerie. Il est fortement recommandé que les journalistes transcriptionnels être imagées sont simple copie transgéniques, comme cela ressemblera plus étroitement la régulation native du gène. Le protocole décrit ci-dessous et résumées dans le tableau 3, fournit également une méthode simplifiée pour obtenir des populations de grand âge synchrone apparié de souches, qui peuvent être utilisés pour d’autres flux de travail expérimental.

1. Culture des animaux dans l’imagerie des expériences sur des plaques de culture de tissu 10 cm traité afin de permettre une plus grande densité de worms (∼ 100 animaux par plaque) que des essais de durée de vie.
2. Remplir les plaques de 10 cm avec 30 mL de gélose NGM et graines avec cinq 225 µL d’extraits de culture de OP50 réfrigérée dans une formation de la Croix-comme.

5. Première Culture de souches Reporter

ensemencées de souches

1. Culture c. elegans qui vont être dosés sur plaques NGM à 20 ° C. laisser les plaques à affamer pour s’assurer que tous les animaux sont cultivés de façon uniforme et potentiellement compte pour tout les effets transgénérationnels des conditions du développement.
2. Chunk L1 affamées larves à graines plaques NGM et grandir jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade L4. Transférer trois larves de L4 par souche à deux plaques de NGM ensemencés à 20 ° C. Ces animaux représente la génération de P0.
3. Utiliser les descendants de L4 de la génération de P0 à mettre en place la génération F1. Placez les larves F1 L4 de la souche sauvage de journaliste sur 4 assiettes NGM ensemencés. Pour les souches mutantes, le nombre de plaques nécessaires dépend de leur taux de croissance. À l’aide de l’exemple précédent de daf-7(ok3125), dans ce contexte, les souches de journaliste nécessitent trois fois les plaques d’immatriculation et doivent être mis en place deux jours avant les souches de journaliste de type sauvage, pour tenir compte des différences dans les taux de croissance.

6. Collecte des œufs et synchronisation des souches journaliste

Remarque : certains gènes d’intérêt dans la communauté de recherche de c. elegans vieillissement entraînent dans la croissance et de Ponte défauts lorsqu’une mutation, ce qui rend plus difficile à générer de grandes populations synchrones d’animaux de différents génotypes. Par exemple, la mutation de daf-7(ok3125) entraîne un défaut grave de ponte en comparaison avec la souche sauvage souche N2. Par conséquent, pour obtenir suffisamment nombre de larves de L4 synchrones de différentes souches pour des expériences d’imagerie quantitatives nécessite une méthode plus robuste que choisir manuellement vers. Pour cette raison, les souches de transcriptional journaliste ont été soumis à une hypochlorite de sodium (NaClO) / traitement de solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) des adultes gravides à briser ouvrir les animaux et libérer leurs œufs, un processus communément appelé ' blanchiment ' par c. elegans recherche communautaire ¹⁵.

1. Compte des différences dans la croissance des taux entre les souches et calculer quelle plaques de chaque souche doivent être récoltées et blanchis. Pour obtenir un exemple de quelle type sauvage et daf-7(ok3125) des souches de journaliste sont blanchies Voir le tableau 3.
2. En série laver les vers d’une souche donnée hors les plaques, sur le jour, avec 15 mL de SB et de recueillir dans un tube stérile de 15 mL. Que les animaux puissent naturellement de sédiments et ensuite régler le volume de liquide à 7 mL.
3. Ajouter 2 mL de 5 % NaClO et 1 mL de 5 M de NaOH dans le tube contenant les adultes gravides. Balançant doucement le mélange à température ambiante pendant pas plus de 3 min. Le NaClO va tuer les bactéries et les vers, tandis que le NaOH provoque les vers à se diviser, libérant des œufs fécondés qu’ils contiennent dans le liquide. La chitine coquille d’oeuf autour les embryons les protège contre les effets du traitement, tant que le temps d’exposition est relativement court. Après le 3 min d’incubation, vortexer le tube pendant environ 30 s pour faciliter le démantèlement des carcasses ver.
4. Après le Centrifuger le mélange à 1 000 x g pendant 1 min granuler les oeufs 3 min d’incubation. Aspirer la plupart du surnageant à l’aide d’une pipette de verre stériles reliée à une bouteille isotherme, laissant ~0.5 mL dans chaque tube, pour ne pas déranger les oeufs.
5. Resuspendre le culot avec 9,5 mL de SB, puis répéter l’étape de centrifugation et de la remise en suspension des mesures supplémentaires deux fois afin que les œufs ont été lavés avec SB trois fois au total.
6. Après la finale de la lave, les œufs par centrifugation de granule et le jeter tout sauf 0,5 mL du surnageant. Remettre en suspension les oeufs dans le restant 0,5 mL de SB et puis aliquote 100 µL sur trois plaques NGM cm 10 graines. Répartir les 100 µL également sur toutes les pelouses bactériennes cinq sur chaque plaque. Pour les souches de type sauvage, œufs ne devraient pas déposés aux densités supérieures à 200 par plaque.
   1. Plaques de donjon à 20 ° C pendant 48 h et d’obtenir une population très homogène des larves de L4. Pour les souches avec des phénotypes de retard de croissance, il est conseillé de déposer autant de œufs selon les disponibilités et augmenter le temps d’incubation. Par exemple, garder daf-7(ok3125)-contenant des souches de journaliste à 20 ° C pour environ 64 h permettre les oeufs éclosent et atteignent le stade L4.

7. Traitement des souches de Reporter avec oeuf-5 Arni

1. laver les vers hors les trois plaques à l’aide de 15 mL de SB en série et de recueillir le liquide dans un tube stérile de 15 ml. Permettre les juvéniles de L4 de sédiments naturellement et puis aspirer tous sauf ~0.5 mL du liquide. Dans le type sauvagesouches de e de journaliste, cette étape supprime toutes les larves moins de L4. Dans les milieux mutante, cette étape facilite le retrait de toutes les larves arrêtées comme dauers dans le cas de daf-7(ok3125).
2. Remettre en suspension les vers avec 9 mL de SB. Encore une fois, contrôler la vitesse de sédimentation des larves L4 et puis aspirer tous sauf ~0.5 mL du surnageant, une fois que la plupart des larves L4 ont granulée. Répétez ce processus une fois de plus. Puis aspirer tous sauf ~0.5 mL du liquide une fois que la majorité des larves L4 ont arrangé.
3. Ajouter 10 µL de basale stérile S additionné de 0,1 % Pluronique F-127 (SB + Plu) au liquide contenant les larves de L4. Cela agit comme un agent tensio-actif et empêche les larves d’adhérer à la surface intérieure des pointes de pipette en plastique.
   1. Resuspendre doucement les larves à l’aide d’une pointe de pipette de faible rétention P200 et puis aliquote 150 µL dans trois assiettes de RNAi de 10 cm qui sont ensemencées avec 5 x 225 µL de bactéries Arni oeuf-5. Veiller à ce que les vers sont également répartis dans l’ensemble de tous les pelouses bactériennes cinq.
4. Une fois que le liquide est absorbé dans la gélose, retirez toutes les larves non-L4 les plaques qui n’ont pas été éliminés par le procédé de lavage par eux égrappage manuellement. Ensuite stocker les plaques à 20 ° C pendant 24 h.

8. Initiation de large-gamme DR

Remarque : après les 24h oeuf-5 traitement Arni, les larves de L4 qui ont été initialement déposés sur les plaques seront devenus adultes 1 - vieux jours.

1. Cueillir les jeunes larves qui s’était échappée de l’étape de suppression manuelle préalable au large à ce stade, laissant seulement les adultes 1 vieux jours - sur les plaques.
2. Pour chaque souche, laver les adultes âgés de 1 jours des trois plaques avec 15 mL de stérile SB + streptocoque dans un tube de 15 mL. Permettre les vers aux sédiments naturellement et puis aspirer tous sauf 0,5 mL du surnageant. Remettre en suspension les vers 9,5 ml de SB + strep et répétez les étapes de la sédimentation et lavage.
3. Après la finale, se laver, laisser les vers dans les sédiments et puis aspirer tous sauf 0,5 mL du surnageant. Ajouter 10µl SB + Plu et resuspendre doucement les larves à l’aide d’une pointe de pipette P200 et puis aliquotes de 100 µL sur un plat de NSC ensemencé par des bactéries 5 x 225 µL à une concentration de 2 x 10 ⁹ cellules/mL.
   1. Répartir 100 µL uniformément sur toutes les pelouses bactériennes cinq. Sous un microscope, estimer le nombre d’animaux présents sur la plaque : le but est d’avoir entre 100-150 worms sur la plaque.
   2. Déterminer le volume de liquide nécessaire pour atteindre une densité de ver dans cette gamme, puis la partie aliquote sur deux plaques supplémentaires. Ajuster le nombre de vers sur la première plaque entrent également dans cette gamme et ensuite stocker les plaques à 20 ° C pendant 24 h.
4. Le lendemain, recueillir les adultes âgés de 2 jours et distribuer de nouvelles plaques NSC ensemencés avec la concentration désirée expérimentale d’aliments (tableau 1), en réutilisant les méthodes décrites aux étapes 2 et 3. Une fois que le liquide soit absorbé dans l’agar, passer les plaques à la température désirée expérimentale pendant 24 h.
5. Le lendemain, recueillir les adultes âgés de 3 jours et distribuer aux plaques de NSC fraîches ensemencées avec la même concentration expérimentale de la nourriture, en réutilisant les méthodes décrites aux étapes 8.3 et 8.4. Une fois que le liquide soit absorbé dans l’agar, retourner les plaques à la température expérimentale pendant 48 h.
6. Recueillir les adultes âgés de 5 jours et distribuer aux plaques de NSC fraîches ensemencées avec la même concentration expérimentale de la nourriture, en réutilisant les méthodes décrites aux étapes 8.3 et 8.4. Une fois que le liquide soit absorbé dans l’agar, retourner les plaques à la température expérimentale pour 24 h.

9. Microfluidique Imaging de journaliste souches

1. le jour 6 de l’âge adulte, image animaux à l’aide d’un personnalisé microfluidique plate-forme ^{24 , 25}. Physiquement, ramassez les animaux en provenance des trois plaques et suspendre dans un tube cryogénique de 5 mL contenant 4,5 mL de SB + strep.
   1. Une fois les vers de sédiments, aspirer tous sauf ~0.5 mL du surnageant et remettre en suspension les animaux dans 4 mL de SB + streptocoque. Ce lavage élimine les bactéries excédentaires qui pourraient interférer avec l’imagerie. Les vers sont introduites dans un dispositif microfluidique personnalisées par l’intermédiaire de pression piloté par flux ^{24 , 25}. Au sein de l’appareil, vers individuels sont dirigés vers et pris au piège dans un canal d’imagerie bloquée par la pression sur puce vannes ²⁶ sous le contrôle de logiciel personnalisé.
2. Une fois qu’un ver est emprisonné en tête la première dans le canal d’imagerie, recueillir une pile z fluorescente, avec 50 sections de 2 µm, à l’aide d’un microscope à épifluorescence standard avec un 40 X objectif à huile (1,3 NA) et une caméra. Recueillir les images fluorescentes rouges et verts pour chacun des reporters transcriptionnelles simultanément à l’aide d’un séparateur d’émission et stockés pour analyse. Acquisition d’images est automatisée à l’aide de logiciels personnalisés.
3. Traiter l’image automatiquement à l’aide personnalisée MATLAB scripts ²⁷ (disponible à https://github.com/meizhan/SVMelegans). Les Z-piles sont chargées dans MATLAB et analysés pour d’identifier les paires de neurone et leur emplacement dans le plan d’imagerie. Les projections maximales sont alors calculées et un algorithme de seuillage est utilisé pour rechercher les cellules fluorescentes individuels. Identification de la cellule est ensuite calculée basée sur les distances relatives et endroits le ver ' tête de s.
4. Pour quantifier la fluorescence de la journaliste, extraire le volume en trois dimensions autour de chaque localisation cellulaire de la z-pile. Intégrer l’intensité sur un nombre constant des pixels les plus brillants, qui encapsulent entièrement la cellule entière dans tous les cas.
5. Pour éliminer le brouillage de modifications expérimentales affections particulières ou spécifiques à la souche de l’intestin auto-fluorescence de chaque animal, calculer l’intensité du fond pour les paires de cellules le plus proche de l’intestin (ADF et ASI) par estimation de la mode de la distribution d’intensité dans un volume autour du neurone. Soustraire cette valeur fond d’intensité de la fluorescence intégrée pour obtenir le résultat final.

10. Assemblage de données

Remarque : les intensités de fluorescence des neurones toutes analysées par le logiciel de traitement d’image sont regroupées dans le fichier de données d’expression filtrée (FED) qui sert à estimer les profils de distribution du gène expression (modèle R et les scripts C++ sont disponibles à https://github.com/giovannidiana/templates).

1. Manuellement vérifier chacun traitée image pour confirmer l’identification correcte pour toutes les cellules. Images avec l’identification de cellules erronées doivent être consignés dans un fichier d’exclusion. Dans Diana et al., (2017) ¹³, le fichier d’exclusion se compose d’un tableau binaire avec ' 0 ' pour corriger et ' 1 ' pour l’identification de la cellule incorrecte. Le nombre de lignes dans la table est égal au nombre de worms imagés avec une colonne pour chaque cellule imagé (i.e ASI, ADF et NSM).
2. Générer le fichier de la FED :
   1. Run le bash script " gen_data + temps " pour générer des fichiers spécifiques des cellules combinant les valeurs d’expression provenant de chaque ver imagée filtrée en utilisant le fichier d’exclusion. Pour chaque dossier généré par le logiciel de traitement d’image, le script bash lit le fichier d’annotation < folderprefix > _EXP.txt pour extraire les conditions expérimentales et le fichier d’exclusion < folderprefix > _X.csv pour sélectionner seulement correctement neurones. Expression valeurs sont lues dans les fichiers < folderprefix > _data_ < neurone > .csv.
   2. Concaténer tous les fichiers dans " FED_split.dat " et trier par le code de lot d’expérience, label et cellule identité à vis sans fin.
   3. Run " tri " (programme C++, usage :. / Trier FED_split.dat FED_merged.dat) pour sélectionner les entrées avec fluorescence différente de zéro pour chaque cellule combiner en rangées simples dans FED_merged.dat.

11. Estimation des informations codées

Remarque : la procédure suivante décrit comment quantifier les informations sur les conditions environnementales spécifiques codées par l’ensemble des expressions de gènes. Dans Diana et al. (2017) ¹³, l’information codée sur l’abondance de la nourriture dans l’environnement a été étudiée, mais la méthode elle-même est applicable à n’importe quel nombre discret d’États environnementaux. L’ingrédient essentiel pour quantifier les variables théorique d’informations telles que les entropies des informations ou de redondance est la distribution de probabilité conjointe des réponses neuronales sous les stimuli environnementaux set considérés. Pour effectuer cette estimation, il est crucial d’avoir un échantillon suffisant de la réponse parmi les populations de vers. Distributions gaussiennes peuvent estimer à partir des échantillons relativement faibles ; Cependant, il est important d’avoir une idée de la forme attendue de la distribution de l’expression pour quantifier la taille de l’échantillon approprié pour une estimation de la densité fiable. En raison de la variabilité inévitable dans différents essais, il est essentiel de vérifier que les valeurs centrales des distributions provenant de différentes séquences répétées de la même expérience ne sont pas systématiquement décalés ou que le quelconque des caractéristiques statistiques de la distribution d’expression ne sont pas significativement modifiées dans des essais. Dans le cas où la variabilité de procès-à-procès est compatible avec la variabilité au sein de chaque essai, il est essentiel d’équilibrer le nombre d’essais par rapport au nombre de vers dans les essais de moyenne sur les facteurs biologiques ou environnementaux qui affectent les procès-à-procès variabilité. Sous-échantillonnage de ces facteurs pourrait fortement biaiser l’analyse information-theoretic.

1. Script comme le R " code3D.R " fournit un modèle pour générer des densités en trois dimensions basées sur le fichier " FED_merged.dat ", modifier ce modèle selon le format d’en-tête FED spécifique. La liste " HeaderNames " représente le nom de chaque champ dans le fichier de la FED tandis que " RONames " recense les afficheurs. Le script utilise le progiciel R ' ks ' ^{28 , 29} pour estimer la distribution multivariée dans une grille hypercubique avec GS bacs dans chaque dimension subdiviser la gamme entre minimum et maximum valeurs dans le dataset pour chaque lecture. Lorsque la variable interne " groupe " est définie sur 0, toutes les données sont utilisées pour l’estimation de la densité. Lorsque le " groupe " étiquette se situe entre 1 à 5, le dataset est divisé en 5 ensembles disjoints, et les densités d’expression sont estimées à partir des 80 % des données résultant de l’exclusion de l’un des cinq ensembles. Cette fonctionnalité est utilisée par la suite pour estimer les incertitudes.
   Remarque : L’utilisation de code3D.R : Rscript code3D.R < GT > < alimentaires > < GS > < outfolder > < label > < groupe > < frac > où GT représente le génotype, la nourriture est la condition environnementale, outfolder est que la préexistant dossier où seront stockées les distributions, étiquette est un préfixe de nom de fichier et frac est la fraction de l’ensemble de données utilisé.
2. Pour chaque condition environnementale générer la distribution multivariée avec grille différentes tailles GS (p. ex. 20,30,40 bacs). Pour réduire la charge de calcul, des valeurs plus petites de la GS sont préférables lorsque des résolutions plus fines ne changent pas significativement l’estimation de l’information. Distribution de l’expression génique sont écrits dans le dossier < outfolder > spécifié lors de l’exécution de code3D.R comme de simples fichiers de texte colonne filename structure < label > _ < GT > _ < alimentaire > _GS < GS > _group < groupe >. dat.
   Remarque : les étapes précédentes fournissent l’estimation de la distribution de probabilité conditionnelle où g désigne le vecteur de tous les afficheurs et f l’état environnemental. Toutefois, pour calculer l’information mutuelle entre l’expression des gènes et l’environnement ^{30 , 31}.
   
   nous avons besoin de la distribution de l’entrée qui détermine également l’entrée (-) en moyenne l’expression génique < img alt = « Équation 4" src="/files/ftp_upload/56292/56292eq4.jpg » / >. Lors de la distribution d’entrée n’est pas directement disponible, une quantité significative de caractériser les fonctions de codage est la capacité de canaux, ce qui peut être obtenue en maximisant l’échange d’informations dans toutes les distributions d’entrée possibles.
3. à l’aide de la distribution de l’expression génique, appliquer l’algorithme de ³² Arimoto-Rob pour estimer la capacité de transmission du système et la répartition de la contribution environnementale qui maximise l’information. On trouvera un exemple d’implémentation de l’algorithme dans le programme C++ " Ccap3D.cpp " pour l’expression génique en trois dimensions code analysé dans Diana et coll. (2017) ¹³. Exemple : si les attributions par le génotype GT123 sont obtenues à partir du 80 % des données (groupe 3) avec la taille de la grille égale à 30 et stockés dans le dossier ". /pdf/ " à l’aide d’une étiquette de préfixe = " PDF ". La commande permettant de calculer l’information codée dans le fond de GT123. / Ccap3D GT123 pdf PDF 30 3
   Remarque : l’estimation de l’information codée par le système est affectée par plusieurs sources d’incertitude, y compris le choix de l’estimation de la densité biais de taille d’algorithme et échantillon. Mesures 11.1-11.2 doivent être répétés à l’aide de méthodes d’estimation de densité différente pour évaluer la taille du biais systématique par chaque algorithme.
4. Pour estimer l’incertitude en raison de la taille de l’échantillon, recalculer les informations des étapes 11.1-11,2 avec groupes entre 1 à 5. La variabilité dans l’ensemble de ces cinq échantillons indépendants de 80 % des données reflète l’impact de la taille de l’échantillon sur l’estimation de l’information.
5. Calculer l’information procédant 11.1-11,2 sur augmentant la fraction des données (comme à l’étape 5) pour corriger la partialité de la taille de l’échantillon (Jack-knife méthode) ³³.

12. Calcul de redondance, de bruit et de corrélation de Signal

1. utilisation optimale des distributions d’entrée provenant de l’estimation de l’information maximale pour calculer l’information mutuelle entre l’entrée et le gène réponse d’expression de chaque neurone N. Le fichier source C++ " GetMI1D.c " est un exemple de programme pour obtenir des renseignements mutuelles marginales de la distribution de probabilité conjointe.
2. Calculer la redondance en prenant la somme des informations mutuelles pour chaque neurone obtenue ci-dessus et puis soustraire la capacité en canaux.
3. Calculer le " shuffle " terme information ^{13 , 34}. Un fichier de modèle C++ source se trouve dans " GetShuffle.c ".
4. Utiliser la " shuffle " terme pour calculer la corrélation de signal et le bruit. Pour la signacorrélation de l nous avons et la corrélation de bruit nous avons .
5. Incertitudes sur la redondance, obtenir le bruit et signal de corrélation en ce qui concerne l’information totale (étape 11.3 de la section précédente) dans plusieurs échantillons de 80 % des données et en prenant la déviation standard.

Results

En effectuant la durée de vie des expériences sur les mutants des gènes d’intérêt aux côtés de la souche sauvage souche N2, on peut établir si ces gènes jouent un rôle dans la réponse de nourriture au large éventail DR. La réponse de type sauvage devrait être comparable à celui représenté dans la Figure 1A. Toute modulation de cette réponse par les mutants, traduit par un effet non uniforme dans l’ensemble des conditions de nourriture, indique que ces gènes affectent la capacité du ver pour répondre correctement aux changements dans l’abondance de la nourriture, à quel point une enquête plus poussée de la réponses d’expression de ces gènes à large gamme DR est justifiée. Si, toutefois, la réponse de la longévité des mutants n’est pas significativement différente de la souche sauvage alors les gènes n’ont aucun rôle dans la transduction des effets de large-gamme DR, au moins au niveau de la durée de vie moyenne. Si les mutations provoquent un déplacement uniform de la réponse de la durée de vie entière les gènes ont un effet indépendant de nourriture sur la longévité. Cela n’exclut pas la possibilité que l’expression des gènes d’intérêt est nourriture-réagir, auquel cas l’information portée par ces gènes ne se transmet pas à la durée de vie.

La prochaine étape du protocole est de déterminer comment les niveaux d’expression changent sous large gamme DR pour les gènes d’intérêt. Dans la Figure 1B, nous illustrons cela à travers les niveaux d’expression d’un journaliste transcriptionnel de daf-7, qui présente une réponse aux changements dans le niveau de la nourriture dans les neurones sensoriels de l’ASI. Chez le mutant daf-7(-) , la réponse de l’expression de la journaliste transcriptionnelle est altérée. Si les gènes d’intérêt sont vraiment sensibles aux aliments au niveau de la durée de vie on peut s’attendre que leur expression changera également avec de la nourriture. Parallèlement, un journaliste transcriptional en arrière-plan mutant devrait avoir un profil d’expression altérée en réponse à large gamme DR. Toutefois, il est également possible que le journaliste transcriptionnel du gène d’intérêt dans un contexte de type sauvage ne montre pas tout changement alimentaire-sensible dans l’expression. Dans ce cas, cela peut indiquer un effet régulateur post-transcriptionnelle qui déborde le cadre du présent protocole.

Dans Diana et al., (2017)¹³, nous avons extrait les valeurs de l’expression pour daf-7 dans ASI et tph-1 dans l’ADF et NSM. Dans la Figure 2A, nous illustrons l’estimation de la distribution de l’expression dans ASI et ADF pour un niveau donné de nourriture. Avoir plusieurs lectures d’images seul ver nous permet d’analyser non seulement la quantité d’information codée de manière indépendante par chaque neurone, mais aussi les informations combinatoires du circuit neuronal ensemble (Figure 2B-2C). Combinant ces deux mesures d’information-theoretic permet de caractériser le système en ce qui concerne la stratégie de codage employée par les neurones pour transmettre des informations sur les produits alimentaires. La quantité de redondance dans le circuit peut être obtenue en prenant la somme des informations mutuelles pour chaque neurone et en soustrayant l’information mutuelle conjointe (capacité de transmission), obtenue en considérant les afficheurs combinatoires du circuit. Une valeur positive de telle différence dénote un caractère redondant de la stratégie de codage car l’information cumulative entre les parties est plus grande que les informations codées par l’ensemble du circuit. À l’inverse, une valeur négative reflète une stratégie synergique car la vraie information codée est supérieure à la somme de ses composantes (Figure 2B). Information et la redondance peuvent être comparés à travers différents génotypes à explorer des rôles possibles de commande supérieurs de régulation des gènes, par exemple à Diana et al. (2017) ¹³ l’effet de la mutation de daf-7 passe à la stratégie de codage de redondants vers synergique (Figure 2C-2D).

Figure 1 : Réponse de durée de vie et l’expression génique en vertu de la large gamme Dr (A) la moyenne durée de vie du type sauvage souche N2 (ligne noire) affiche une réponse complexe à large gamme DR. L’ampleur de cette réaction est atténuée chez un mutant nul du gène daf-7 (ligne rouge). Barres d’erreur représentent erreur type de la moyenne, les données regroupées de Entchev et al. (2015) ¹². les niveaux d’expression (B) la moyenne d’un reporter transcriptionnel du gène daf-7 dans le contexte de type sauvage (ligne noire) affichent également une réponse complexe non monotone à large gamme DR. Dans le bagage génétique de daf-7(-) l’expression de ce journaliste transcriptionnelle est fortement atténuée et montre peu de réponse à des changements au niveau de la nourriture. Barres d’erreur représentent écart-type de la moyenne, les données d’un seul essai en Entchev et al. (2015) ¹². s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Méthodologie computationnelle. (A) Illustration de l’estimation de la densité bidimensionnelle de tph-1 expression expression ADF et daf-7 dans ASI obtenu à partir du paquet « ks » R utilisant une grille dimension 30 x 30. (B) visualisation des informations codées par l’expression commune de tph - daf-7 (ensemble) et individuellement (somme des parties) pour les neurones ADF, ASI et NSM. Caractères redondants et synergiques de l’encodage sont représentés par la différence entre la hauteur des barres empilées sur le droit et l’information codée par le circuit complet. (C) la comparaison entre l’information alimentaire codée par animaux de type sauvage et des mutants daf-7(-) . (D), la réduction d’information mutuelle observée chez les mutants est accompagnée d’un interrupteur vers l’encodage synergique. B-D de panneaux sont adaptés de Diana et al. (2017) ¹³. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Concentration bactérienne (cellules/ml)	Densité optique (600nm)	Facteur de dilution (du précédent)
1.12E + 10	56.000	0.00
2.00E + 09	10.000	5.60
6.32E + 08	3.160	3.16
6.32E + 07	0,316	10 h 00
2.00E + 07	0,100	3.16
0 (S basale)	0,000	NA

Tableau 1 : niveaux d’aliments et les facteurs de dilution utilisés en large éventail Dr Bactériesconcentrations l (cellules/mL) ont été utilisées dans le protocole de DR large éventail, ainsi que leurs mesures respectives de₆₀₀ OD et le facteur de dilution pour obtenir chaque concentration de la précédente.

	Températures expérimentales de durée de vie
Journée	12.5° C	15° C	17,5 ° C	20° C	22.5° C	25° C	27,5 ° C
-12	Morceau toutes les souches aux plaques de NGM frais et maintenir à 20° C
-11
-10	Génération de P0 daf-7(-) souches établir et de maintenir à 20° C (1 L4 par plaque, 5 planches)
-9	Établir P0 génération des souches de type sauvage et de maintenir à 20° C (1 L4 par plaque, 5 planches)
-8
-7
-6
-5	Établir la génération F1 de souches de daf-7(-) et de maintenir à 20° C (1 L4 par plaque, 90 plaques)
-4	Configurer la génération F1 de souches de type sauvage et maintenir à 20° C (1 L4 par assiette, 30 planches)
-3
-2
-1
0	Ramasser les larves L4 F2 à > RNAi oeuf-5 assiettes et maintenir à 20° C (15 L4 / plaque de 24 plaques)
1	Mouvement 1 - jours vieux adultes aux plaques de NSC ensemencé avec 2.0E + 9 niveau alimentaire de cellules/ml et maintiennent à 20 ° C
2	Déplacer 2 - vieux jours adultes aux plaques de NSC ensemencées avec des conditions alimentaires expérimentaux et aux températures expérimentales
3	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert
4
5	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert
6
7	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert
8
9	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert
10
11	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert
12
13
14	Transfert	Transfert	Transfert	Transfert
15
16
17
18	Transfert	Transfert
19
20
21
22	Transfert

Tableau 2 : calendrier des durées de vie menée à différentes températures. Aperçu schématique des étapes nécessaires pour configurer large gamme DR durée de vie des expériences à des températures différentes à l’aide de souches daf-7(-) et sauvage comme exemples. Le nombre de transferts vers des plaques fraîches de chaque niveau de l’aliment expérimental diminue avec l’augmentation de la température. C’est pour tenir compte du fait que les animaux à des températures élevées vieillissent plus rapidement et donc plus sujette aux dommages physiques par transfert.

Jours

IMA

Ging Pipeline -14 Souches de journaliste morceau en fond de daf(-). Maintenir à 20 ° C. -13 Souches de journaliste morceau en fond de type sauvage. Maintenir à 20 ° C. -12 Mis en place P0 génération des souches de journaliste daf-7(-). Utiliser 3 L4 larves par plaque NGM de 10cm. Utiliser 2 plaques et maintenir à 20 ° C. -11 -10 Mis en place P0 génération des souches de journaliste de type sauvage. Utiliser 3 L4 larves par plaque NGM de 10cm. Utiliser 2 plaques et maintenir à 20 ° C. -9 -8 Configurer la génération F1 de souches de journaliste daf-7(-). Utiliser 3 L4 larves par plaque NGM de 10cm. Utiliser 12 assiettes et maintenir à 20 ° C. -7 -6 Configurer la génération F1 de souches de journaliste de type sauvage. Utiliser 3 L4 larves par plaque NGM de 10cm. Utiliser 4 assiettes et maintenir à 20 ° C. -5 -4 -3 Les souches de journaliste daf-7(-) d’eau de Javel dans l’après-midi (~ 5 pm) et déposent leurs oeufs sur 3 plaques NGM de 10cm et à entretenir à 20 ° C. -2 Eau de Javel type sauvage journaliste souches matin (~ 10 h) et le dépôt oeufs 3 10 cm plaques NGM et maintenir à 20 ° C. -1 0 Laver L4 pour plaques d’Arni oeuf-5 cm 10. Utiliser 3 plaques par déformation et maintenir à 20 ° C. 1 Laver 1 jour adultes aux plaques de NSC ensemencés avec 2.0E + 9 cellules / ml. utiliser 3 plaques par déformation et maintenir à 20 ° C. 2 Lavage 2 jours adultes aux plaques de NSC ensemencé avec niveaux alimentaires expérimentaux. Utiliser 3 plaques par déformation et le déplacement à température expérimentale. 3 Transfert aux plaques de NSC fraîches. Utiliser 3 plaques par déformation et maintenir à température expérimentale. 4 5 Transfert aux plaques de NSC fraîches. Utiliser 3 plaques par déformation et maintenir à température expérimentale. 6 Ramasser les animaux hors plaques et se préparer pour l’imagerie.

Tableau 3 : calendrier d’imaging pipeline. Aperçu schématique des étapes nécessaires pour configurer DR large éventail des expériences utilisant des souches fluorescentes journaliste transcriptionnelle dans des milieux daf-7(-) et de type sauvage à différentes températures comme exemples d’imagerie.

Discussion

Nous présentons ici une nouvelle méthode de restriction alimentaire qui encapsule un plus large éventail de concentrations de nourriture que les protocoles publiés antérieurement. Cette méthode lie deux phénomènes auparavant distinctes chez c. elegans DR littérature, privation bactérienne et classique restriction alimentaire, permettant à ces deux effets alimentaires d’être étudié sous un protocole. En utilisant le nouveau paradigme de DR large éventail, nous présentons un cadre général pour examiner l’expression génique cellulaire unique en réponse à un signal environnemental spécifique et de déterminer comment cette cellule encode les informations. Notre cadre se compose de deux protocoles expérimentaux qui montrent comment exécuter des durées de vie et l’imagerie quantitative, respectivement, en vertu de la large gamme Dr Data de ces protocoles expérimentaux peut ensuite être examiné avec les analyses informatiques fournis dans ce cadre pour quantifier l’information codée par des changements dans les niveaux d’expression de gène ou de la durée de vie dans des conditions alimentaires différents.

Durée de vie des expériences utilisant large gamme DR paradigme comportent six niveaux d’alimentation distinctes (tableau 1). Cela nécessite une approche plus fastidieuse que d’examiner la longévité sous moins de niveaux alimentaires, telles que la privation alimentaire^10,11 ou en utilisant le bagage génétique de eat-2 ³⁵. Cependant, examinant à durée de vie sous une seule condition peut limiter les interprétations du rôle d’un gène de la RD. Par exemple, nous avons montré récemment que des mutants de daf-7 ont une atténuation bidirectionnelle de la réponse à la concentration de nourriture par rapport au type sauvage animaux¹² (Figure 1 a). En l’absence de nourriture, des mutants de daf-7 affichent un raccourcissement de leur durée de vie par rapport aux animaux de type sauvage. Si nous avions considéré seulement comme privation alimentaire, nous qui aurait interprété le gène daf-7 comme étant nécessaires pour une extension de durée de vie, seulement quand en fait le rôle de daf-7 est plus complexe. Par conséquent, le résultat essentiel de cette partie du protocole est d’établir si un gène d’intérêt est impliqué dans la modulation de la réponse globale de la durée de vie aux changements dans l’abondance de la nourriture.

Un avantage majeur de ce protocole par rapport aux autres méthodes, c’est qu’il utilise une nouvelle méthode pour éliminer la production de la progéniture des animaux en cours d’analyse de la durée de vie. La plupart des études utilisent la drogue FuDR pour inhiber la prolifération de la lignée germinale chez les adultes, les rendant stériles. Cependant, les études récentes ont montré FuDR traitement peut avoir des effets de condition - et gène-spécifique sur la durée de vie^{17,18,19,20,21}, remettant en question de son applicabilité générale. Dans ce protocole, élimination de la production de la descendance est assurée à travers un 24h traitement des animaux par ARNi ciblant le gène de l’oeuf-5 , qui inhibe la formation de la coquille de chitine de fécondés c. elegans ovocytes ce qui entraîne leur la mort de^22,23. L’avantage de cette méthode est qu’elle est très tardive d’action et donc n’interfère pas avec la lignée germinale, qui est un important régulateur de la longévité chez c. elegans.

Une restriction éventuelle du protocole DR large éventail est sa dépendance sur l’utilisation des antibiotiques pour contrôler la prolifération bactérienne afin d’assurer un contrôle strict de la concentration bactérienne. Une prolifération bactérienne dans l’intestin du ver est connue pour être des principales causes de décès chez c. elegans¹⁶. Ainsi, l’utilisation des antibiotiques bactériostatiques, comme la carbénicilline, dans la gélose NGM prévient la prolifération bactérienne et augmente la durée de vie de worms par rapport aux contrôles non antibiotiques¹⁶. Certains types d’antibiotiques, tels que la rifampicine³⁶ et membres de la famille^37,de tétracycline³⁸, auraient dû être divulgués pour prolonger la durée de vie chez c. elegans indépendamment de leur effet sur les bactéries prolifération. Cependant, il n’y a aucun élément de preuve dans la littérature que carbénicilline ou streptomycine peut augmenter la longévité indépendamment de leur effet sur la prolifération bactérienne.

Durée de vie peut être considérée comme le résultat d’un calcul complex où l’information environnementale, mise en déroute par l’expression génique dans les réseaux neuronaux, est transmise à la physiologie. Notre protocole fournit une méthodologie pour comprendre comment certains gènes affectent ce flux d’information sur l’environnement. Pour répondre à cette question, nous avons besoin pour déterminer la répartition des réponses d’expression de gène au niveau de la cellule unique de traitement d’image fiable. Être capable d’évaluer non seulement la réaction moyenne d’expression génique de changements dans l’abondance de la nourriture mais aussi la distribution statistique complet de grandes populations représente une condition importante pour l’application de notre méthode. Cette description précise des réponses d’expression de gène à l’abondance de nourriture permet à l’application de la théorie de l’information quantifier l’information codée par les neurones spécifiques ainsi que la stratégie de codage utilisé par le circuit neuronal.

Les aspects informatiques et d’imagerie des méthodes décrites dans le présent protocole sont appliquent à un grand ensemble de contextes biologiques. Dans notre travail, nous nous sommes concentrés sur un petit réseau de neurones impliqué dans l’alimentation de détection, cependant, les analyses des fonctionnalités de traitement de l’information ne sont pas limités à un type de cellule spécifique ou des signaux environnementaux spécifiques. À l’avenir, ces méthodologies potentiellement peuvent être étendus qu’à une plus grande variété de variables d’entrées, affectant toute sortie physiologique. Ces approches contribuera à une meilleure compréhension de comment encoder des réseaux de régulation génique, processus et transmettre des informations.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sel de carbénicilline di-sodique	Sigma-Aldrich	C1389-5G	Antibiotique
Streptomycine Sel de sulfate	Sigma-Aldrich	S6501-50G	Antibiotique
; Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758-10G	Inducteur pour plaques ARNi
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	71380-1KG-M	Utilisé dans la gélose S basale et NGM
Hydrogène di-potassique(K2HPO 4)	Sigma-Aldrich	1.05104.1000	Utilisé dans la gélose S basal et NGM
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4 )	Sigma-Aldrich	P9791-1KG	Utilisé dans la gélose S, basale et NGM
Sulfate de magnésium (MgSO4)	Sigma-Aldrich	M2643-1KG	Utilisé dans la gélose
NGMChlorure de calcium (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G	Utilisé dans la gélose NGM
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich	71687-500G	Utilisé pour le blanchiment
Pluronic-F127	Sigma-Aldrich	P2443-1KG	Utilisé en imagerie
Hypochlorite de sodium (NaClO)	Sigma-Aldrich	1.05614.2500	Utilisé pour le blanchiment LB
Broth	Invitrogen	12780052	Utilisé pour la culture de bactéries
Adadvanced TC 6 cm Plaques de culture tissulaire	Greiner Bio-One	628960	Plaques pour durée de vie
CellStar 10cm Plaques de culture tissulaire	Greiner Bio-One	664160	Plaques pour l’imagerie
Low Retention P200 pointes	Brandt	732832	Conseils pour la manipulation des vers dans l’Agar liquide
Agar	BD	214510	Agar pour plaques NGM, ARNi et NSC
Bacto-peptone	BD	211820	Peptone pour plaques NGM, ARNi et NSC