Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

In Vitro et In Vivo la détection des Mitophagy dans les cellules humaines, C. Eleganset la souris

17.4K vues

⸱

DOI :

10.3791/56301

⸱

22 novembre 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

Dans cet article

Résumé

Mitophagy, le processus de compensation endommagée mitochondries, est nécessaire au maintien de l’homéostasie et de la santé mitochondriale. Cet article présente certaines de la mitophagy dernière méthodes de détection dans les cellules humaines, Caenorhabditis eleganset la souris.

Résumé

Les mitochondries sont les puissances des cellules et produisent de l’énergie cellulaire sous forme d’ATP. Dysfonctionnement mitochondrial contribue au vieillissement biologique et une grande variété de troubles y compris les maladies métaboliques, maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma) et la maladie de Parkinson (MP) et les syndromes de vieillissement prématuré. Maintien d’une santé mitochondriale dépend de la biogenèse mitochondriale et le déminage efficace de dysfonctionnels mitochondries par l’intermédiaire de mitophagy. Des méthodes expérimentales pour détecter avec précision l’autophagie/mitophagy, en particulier dans des modèles animaux, ont été difficiles à développer. Les progrès récents vers la compréhension des mécanismes moléculaires de mitophagy a permis le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Ici, nous présentons plusieurs techniques polyvalents pour surveiller les mitophagy dans les cellules humaines, Caenorhabditis elegans (p. ex., Rosella et souches DCT-1 / LGG-1) et les souris (mt-Keima). Une combinaison de ces techniques de détection de mitophagy, y compris l’évaluation interspécifique, améliorera la précision des mesures mitophagy et conduire à une meilleure compréhension du rôle de mitophagy dans la santé et la maladie.

Introduction

Mitophagy est essentiel pour fonctionnement mitochondrial. Les mitochondries croisent de multiples voies de signalisation de cellulaire et sont des organites subcellulaires universels responsables de la production d’énergie cellulaire et métabolisme cellulaire calcium homeostasis1,2,3, 4. mitochondries constamment expérience défis provenant de sources endogènes et exogènes, tels que les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et substances toxiques mitochondriales, respectivement, qui conduisent à la génération des « âgés » et dysfonctionnels mitochondries. Diminue l’efficacité de la production d’ATP tout en augmentant la quantité de ROS nuisibles accumulation des mitochondries endommagés et a été liée à des maladies liées au vieillissement telles que les maladies métaboliques, AD et PD1,5,6 . Pour éviter tout dysfonctionnement cellulaire induite par les mitochondries, cellules nécessité de reconnaître spécifiquement endommagé les mitochondries et leur enlever efficacement grâce à un processus cellulaire appelé autophagie mitochondriale (mitophagy). Cela démontre l’importance des mitophagy en santé et maladie illustre la nécessité de méthodes précises et efficaces détecter les mitophagy in vitro et in vivo.

Mitophagy est un processus de plusieurs étapes impliquant de nombreuses protéines et protéines complexes5,7,8. En bref, une mitochondrie endommagée est tout d’abord reconnue et engloutie par une double membrane phagophore, qui peut provenir de la membrane plasmique, réticulum endoplasmique, appareil de Golgi, noyau ou mitochondrie lui-même9,10. Le phagophore sphérique s’allonge et finalement scelle les mitochondries à l’intérieur, qui constitue l’autophagosome mitochondriale (mitophagosome). Le mitophagosome fusionne alors avec le lysosome pour dégradation, formant un autolysosome dans lequel la mitochondrie endommagée est dégradée et recyclé7,8. Principales protéines autophagiques également impliqués dans mitophagy comprennent : Autophagy Related 7 (ATG7) et Beclin1 (initiation), protéine Microtubule-Associated 1 a/1 b-Light Chain 3 (LC3-II) (LGG-1 s elegan c.) et p62 (composants de phagophore), et glycoprotéine de la membrane lysosomale associés à 2 (LAMP2)6,7. En outre, il y a plusieurs protéines essentielles propres à mitophagy, y compris induite par le gène PTEN putatif Kinase 1 (rose-1), Parkin1, Dot nucléoprotéines 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 Interacting Protein 3 comme (NIX/BNIP3L) (DCT-1 chez c. elegans), entre autres5,6,11.

Une méthode courante pour détecter des changements dans les niveaux de l’autophagie est par le ratio du LC3-II/LC3-I ou LC3-II/actine. Toutefois, cette méthode est non spécifique, comme une augmentation de ce ratio peut refléter une ouverture accrue ou une fusion avec facultés affaiblies de mitophagosome au lysosome12. Une autre méthode consiste à évaluer la colocalisation entre un marqueur d’autophagie (p. ex., LC3) et une protéine mitochondriale (p. ex., Translocase of externe mitochondriale Membrane 20 (TOMM20, qui peuvent être dégradés par protéasomes)). Cependant, ceci peuvent seulement indiquer les changements dans les niveaux de mitophagy total et ne peut pas distinguer les étapes à laquelle blocage se produit. Cela peut être clarifié en utilisant des inhibiteurs lysosomales (p. ex., E64d + pepstatine A, appelés EP) en parallèle pour causer l’accumulation de mitophagosomes. La différence entre le nombre de mitophagosomes au départ et le nombre de mitophagosomes après un traitement avec l’EP peut indiquer mitophagy. Ces limitations ont incité le développement de techniques de détection de nouveaux mitophagy. Compte tenu de l’importance croissante des mitophagy dans un large éventail de maladies humaines, nous présentons plusieurs techniques de détection de mitophagy robuste qui peuvent être utiles pour les chercheurs. Nous couvrir les techniques in vitro et in vivo et recommandons de combiner plusieurs techniques pour vérifier les changements de mitophagy.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Animaux (souris mâles et femelles) est nés et élevés dans une animalerie accrédité, conformément et approbation de la Commission de l’emploi et de NIH animalier. Méthodes d’euthanasie doivent être conformes à toutes les réglementations nationales et institutionnelles.

1. détection de Mitophagy dans les cellules humaines

  1. Détection de mitophagy à l’aide de plasmide mt-Keima
    Remarque : La protéine Keima, fusionnée à un signal de cible des mitochondries, simplifié en mt-Keima, s’est avérée utile pour la détection in vivo mitophagy. MT-Keima est une protéine fluorescente ratiométrique sensibles au pH, qui présente une fluorescence verte (excitation 458 nm) dans des conditions de base ou neutres et fluorescence rouge (excitation 561 nm) dans des conditions acides. Des mitochondries saines se développent dans des conditions de base ou neutres (pH 7-8) et sont indiqués par une fluorescence verte lorsque transfectées avec mt-Keima. Lorsque les mitochondries subissent mitophagy et fusionnent avec les lysosomes acides, le pH descend à 4,5 et mitochondries contenant mt-Keima présentent une fluorescence rouge6,13,14. Ce qui est important, mt-Keima est résistante aux protéases lysosomales, permettant l’évaluation des mitophagy sur de longues périodes. Le protocole ci-dessous est conçu pour les plaques 6 puits.
    1. Jour 1 : Utiliser des cellules humaines primaires (par exemple, les fibroblastes) ou immortalisé les cellules humaines (par exemple, les cellules Hela ou U2OS cellules). Graines environ 0,3 à 1 × 106 cellules/puits (selon le taux de croissance de cellules pour permettre aux cellules d’atteindre 70 % confluence le lendemain) dans une plaque 6 puits. Maintenir les cellules dans un milieu de culture cellulaire complet (Eagle modifié (DMEM) additionné de Dulbecco avec 10 % SVF et 1 % solution de pénicilline-streptomycine mixte) et incuber dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C (20 % O2, 5 % CO2 ). Ajouter 1 mL, milieu de culture cellulaire complet/puits dans une plaque 6 puits.
      Remarque : Gène surexpression/knockdown ou médicaments traitements peuvent s’effectuer à ce stade6.
    2. Jour 2 : Mélanger de l’ADN plasmidique mt-Keima6 et réactif de transfection d’ADN (le mélange pour un puits d’une plaque de 6 puits).
      1. Diluer 15 µL d’un réactif de transfection d’ADN avec 150 µL de milieu sans sérum selon le protocole du fabricant.
      2. Diluez 2 à 5 µg d’ADN plasmidique mt-Keima avec 150 µL de milieu sans sérum.
      3. Ajouter dilué mt-Keima plasmide de réactif dilué de transfection des ADN, Vortexer pendant 10 s et incuber pendant 10 min à température ambiante.
        Remarque : L’optimisation des conditions de la transfection d’ADN peut être nécessaire en fonction de la taille de la plaque (voir protocoles de la manufacturers' pour plus de détails).
      4. Ajouter le mélange réactif ADN/transfection goutte aux cellules, puis secouez les plaques doucement pendant 5-10 s jusqu'à ce que la solution est complètement mélangée.
    3. Jour 3 : Changer les médias en remplaçant le milieu de réactif contenant de l’ADN transfection avec milieu de culture cellulaire complet frais (1 mL/puits).
    4. Jour 4 : Image les cellules à l’aide de la microscopie confocale6. Utiliser les deux canaux d’imagerie : canal vert (excitation 458 nm, émission 570-695 nm) pour visualiser les mitochondries normales et canal rouge (excitation 561 nm, émission 570-695 nm) pour visualiser les mitochondries qui sont en cours de mitophagy. L’image au hasard 20 zones sous un grossissement de x 40 pour un montant total de 100-200 cellules dans chaque cupule.
    5. Effectuer l’analyse des données. Calculer l’indice de « mitophagy » (pourcentage des mitochondries en cours de mitophagy), à l’aide de logiciels d’analyse image de quantifier la quantité de fluorescence dans les canaux rouges et verts : prendre le ratio de la fluorescence rouge à fluorescence rouge + vert, et multiplier par 1006.
      NOTE : Solutions de rechange de transfection incluent l’utilisation de lignes mt-Keima stablement exprimé aux cellules HeLa14. Étant donné que les cellules HeLa n’expriment pas de Parkin, Parkin doit être exprimé stablement Etudier mitophagy Parkin-dépendante dans cette lignée cellulaire.
  2. Détection de mitophagy à l’aide de la colocalisation entre sous-unité d’oxydase du Cytochrome C II (restriction) et LAMP2
    Remarque : La restriction est une protéine de la membrane interne mitochondriale génome encodé. Le « indice de mitophagy » égale le rapport entre la restriction colocalisée avec LAMP2 exprimée en pourcentage du montant total de la restriction.
    1. Les cellules HeLa (ou autres cellules d’intérêt mentionnée à l’étape 1.1.1) de graines dans une lame de 4 puits chambre (1-5 × 10,4 cellules dans 1 mL, milieu de culture cellulaire complet/puits) dans une cellule culture incubateur à 37 ° C (20 % O2, 5 % de CO2) pendant la nuit.
    2. Ajouter 3,0 µL de carbonyle 10 mM - 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) de cyanure et incuber dans l’incubateur de culture cellulaire (étape 1.2.1) pendant 3 h.
      Remarque : Autres médicaments affectant les mitophagy peuvent être utilisés.
    3. Enlever le milieu de culture à l’aide d’une pipette 1 mL, laver les cellules deux fois avec 1 mL/bien du froid (0-4 ° C) 1 x PBS. Laisser la solution reposer 10-30 s avant le prochain lavage. Puis ajouter 0,5 mL de paraformaldéhyde à 3,7 % (PFA) en solution 1 PBS x dans chaque puits et incuber pendant 10 minutes sur la glace pour fixer les cellules.
      ATTENTION : PFA est la toxine. Travailler sous une hotte lorsque vous utilisez PFA.
    4. Jeter la solution de la PFA à l’aide d’une pipette 1 mL, laver les cellules deux fois avec froid 1 X PBS (1 mL/puits ; laissez la solution reposer pendant 10 s avant le prochain lavage) et permeabilize les cellules avec 1 mL/puits de 0,25 % de détergent (dans du PBS 1 x) pendant 10 minutes sur la glace.
    5. Jeter le tampon perméabilisant, laver délicatement les cellules deux fois avec froid 1 x PBS et jeter (laissez la solution reposer pendant 10 s entre les lavages). Bloquer les cellules avec 1 mL/puits de 5 % FBS dans du PBS 1 x nuit à 4 ° C. Couvrir les chambres afin d’éviter la perte d’humidité.
    6. Préparer les 0,5 mL/puits d’une solution d’anticorps mixte d’anticorps de restriction (souris, dilution de 1/250) et anticorps LAMP2 (lapin, dilution 01:20-01:50) dans du PBS 1 x 5 % FBS, et le magasin sur la glace pour 0,5 à 1 h.
    7. Retirez la lame de 4 puits chambre de la chambre froide et jeter la solution de saturation avec une pipette de 1 mL. Laver délicatement les cellules deux fois avec 1 mL/puits de froid 1 x PBS et jeter (laissez la solution reposer pendant 10 s entre les lavages), puis ajouter 0,5 mL/ainsi de solution mixte d’anticorps. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure sur un agitateur à faible vitesse.
    8. Jeter la première solution d’anticorps à l’aide d’une pipette 1 mL et délicatement laver les cellules trois fois avec 1 mL/puits de PBS 1 x contre le rhume et la jeter. Laissez la solution se trouve pour 10 s avant le prochain lavage. Ajouter 1 mL/puits des anticorps secondaires fluorescents (p. ex., anti-lapin de chèvre avec nm de longueur d’onde 568 de la protéine fluorescente rouge (DP) pour LAMP2 ; et chèvre anti-souris avec nm de longueur d’onde 488 de la protéine fluorescente verte (GFP) pour restriction) en dilution de 1/250 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x. Recouvrir la lame de 4 puits chambre avec du papier aluminium et incuber à 37 ° C pendant 1 heure sur un agitateur à faible vitesse.
    9. Jeter la deuxième solution d’anticorps avec une pipette de 1 mL. Laver délicatement les cellules six fois avec 1 mL/puits de PBS 1 x contre le rhume. Laisser la solution pendant 1 min avant le prochain lavage.
    10. Monter les cellules avec 50 µL/puits de milieu de montage antifade au DAPI et ajoutez les lamelles.
    11. Les cellules sous un microscope confocal avec 66 x huile d’immersion et de grossissement d’image (tuile scanne / mosaïques peuvent être utilisés pour augmenter le nombre de cellules par le logiciel). Utiliser les mêmes paramètres tels que la durée de l’exposition de canal, gain numérique, offset numérique, etc. tout au long de l’imagerie tout processus (voir instructions de logiciel pour plus de détails)15.
    12. Logiciel d’analyse de colocalisation utilisation d’analyser quantitativement au moins 20 images aléatoires de 100 cellules15. Utilisez la fonction « Bézier fermée » pour sélectionner des cellules individuelles ensemble. Comparer le coefficient de colocalisation de la Pearson de GFP de DP, pondéré ou non pondéré, pour déterminer les niveaux de mitophagy dans les cellules analysées. Maintenir les valeurs de réticule horizontal et vertical du logiciel d’analyse colocalisation tout au long de l’analyse. Pour définir correctement ces réticules, préparer deux séries supplémentaires de cellules et étiqueter une restriction et les autres LAMP2. Ensuite, affectez à réticule directement au-dessus de la distribution des pixels pour chaque canal15 (voir les instructions du logiciel pour plus de détails).
  3. Un haut débit d’imagerie de mesure pour le dépistage de la mitophagy
    Remarque : Effectuer des écrans à haut débit de composés induisant mitophagy ou inhibant la mitophagy de grandes bibliothèques composés est techniquement difficile. Une technique d’imagerie basée sur la co-localisation des mitochondries avec autophagosomes est une alternative plus simple, mais très sensible pour mitophagy16de dépistage.
    1. Jour 1 : Semences de cellules (par exemple, les fibroblastes humains primaires à 5 000 cellules/100 mL cell culture media/puits) dans une plaque à 96 puits (voir étape 1.1.1).
    2. Jour 2 : Traiter les cellules dès le deuxième jour avec FCCP ou autres composés d’intérêt pour les temps d’incubation désigné (voir étape 1.2.2).
    3. Suivez les étapes 1.2.2-1.2.9 utilisant les anticorps primaires de restriction (souris, dilution de 1/250 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x) et LC3B (lapin, 1/100-dilution de 1 : 200 avec 5 % FBS dans du PBS 1 x). Par ailleurs, les anticorps primaires pour restriction et LAMP2 peuvent être utilisés.
    4. Les cellules à l’aide d’un lecteur de fluorescence16de l’image. Recueillir les images dans les champs placés au hasard et avec un minimum 500 cellules/puits.
    5. Analyser les données à l’aide d’une cellule analyseur personnalisé protocole16.

2. détection des Mitophagy chez c. elegans

Remarque : Le nématode c. elegans fournit une plate-forme pour doser mitophagy au niveau de l’organisme. Deux souches peuvent être utilisés pour surveiller mitophagy : Rosella (1) les mitochondries ciblées (mtRosella) ou mitophagy (2) récepteurs DCT-1 fusionnée à la GFP avec marqueur autophagosomal LGG-1 fusionné avec Acropora SP. protéine fluorescente rouge (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy surveillance d’un biocapteur Rosella
    NOTE : Rosella est un biocapteur moléculaire qui combine un pH insensible DsRed fusionnée à une variante GFP sensibles au pH. Le biocapteur Rosella tire parti des différences entre le lysosome acide (pH ~ 4,5) et d’autres compartiments cellulaires pH. Ce biocapteur a été utilisé pour contrôler avec succès mitophagy dans Saccharomyces cerevisiae et de plusieurs lignées cellulaires de mammifères, tels que HeLa HEK293 et HCT11618,19. Nous adapté ce journaliste polyvalent de double-fluorescentes et généré transgéniques c. elegans nématodes exprimant axés sur les mitochondries Rosella (mtRosella) dans les cellules musculaires paroi corporelle. Induction de Mitophagy est indiquée par un ratio GFP/DsRed réduit de fluorescence de la mtRosella.
    1. Jour 1 : Pick L4 larves vers exprimant axés sur les mitochondries Rosella (mtRosella) dans les cellules musculaires paroi corporelle sur une plaque de croissance de nématode Media (NGM) ensemencée avec e. coli (OP50) à l’aide d’un microscope de dissection5. Placer les vers/plaque de 10-20 au moins trois plaques de 3,5 cm. Incuber les nématodes à la température standard de 20 ° C5.
      Remarque : Voir la référence pour l’anatomie du ver, y compris l’identification des larves de L420et la façon de faire un choix qui permet de transférer vers d’un endroit à un autre21.
    2. Jour 5 : Synchroniser les nématodes en sélectionnant 15-20 larves transgéniques de L4 et leur transfert sur frais OP50 boutonnée plaque NGM. Utiliser au moins cinq plaques par condition expérimentale.
    3. Jour 7 : Préparer les plaques des véhicules pour les médicaments qui affectent le mitophagy des intérêts ou des témoins positifs.
      1. Tuer les bactéries e. coli (OP50) ensemencées en exposant des plaques NGM pendant 15 min avec 222 µW/cm2 (intensité) de la lumière UV pour s’assurer que les composés induisant la mitophagy ne sont pas métabolisés par les bactéries. Plaques doivent être exposés avec 2 000 J/m2.
        NOTE : Secondes d’exposition nécessaire = 2 000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Ajouter des composés d’intérêt vers le haut des plaques NGM ensemencés. Ajouter une quantité équivalente de véhicule composé (solvant utilisé pour dissoudre les composés, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO)) sur la plaque du véhicule comme témoin négatif. Pour un contrôle positif de l’induction de la mitophagy, une substance toxique mitochondriale, le paraquat (concentration finale de 8 mM) a été utilisé. Ajouter une solution contenant 10 µL de stock de paraquat de 8 M avec 190 µL de ddH2O sur le dessus de la gélose pour le groupe de traitement. Pour le groupe de véhicule, ajouter une solution contenant 10 µL de DMSO avec 190 µL de ddH2O sur le dessus de la gélose.
        NOTE : La solution de travail du paraquat peut se conserver pendant 1 mois à 4 ° C.
      3. Agiter doucement les plaques jusqu'à ce que la drogue ou véhicule recouvre toute la surface. Laisser les plaques à sécher avec le couvercle fermé à température ambiante pendant au moins 1 h avant de transférer les vers.
        NOTE : Plaques de drogue peuvent également être préparés en ajoutant des médicaments dans le liquide NGM avant elle se solidifie.
    4. Jour 7 : Transfert de 10-20 d’âgés de 2 jours adultes animaux transgéniques préparées à l’étape 2.1.2 aux plaques contenant soit le paraquat, composés des intérêts, ou d’un véhicule (DMSO). Incuber les animaux transgéniques à 20 ° C pendant 2 jours.
    5. Jour 9 : Préparer 2 % d’agarose tampons (voir Documents supplémentaires). Puis ajoutez une goutte (10 µL) de 20 mM levamisole en M9 par pad. Immobiliser les animaux transgéniques pour l’imagerie, en les plaçant dans la chute de M9-levamisole. Placez délicatement une lamelle sur le dessus.
    6. Capturer des animaux transgéniques à l’aide d’une caméra attachée à un microscope à épifluorescence. Acquisition d’images fluorescentes de nématodes ensemble transgéniques exprimant des mtRosella dans les cellules musculaires paroi corporelle de grossissement 10 X5. Enregistrer les images recueillies.
    7. Traiter les images acquises avec les logiciels ImageJ. Analyser les cellules de muscle de paroi corporelle situés dans la tête du ver pour éviter l’autofluorescence dans les tissus intestinaux. Mesurer la moyenne intensité valeur et total zone de pixels pour chaque image fluorescente seulement de la région céphalique de chaque animal. Pour analyser la zone d’intérêt :
      1. Sélectionnez « split canal » sous le menu déroulant « image » et « color » de convertir des images.
      2. Utiliser l’outil « sélection à main levée » pour capturer la zone fluorescente d’intérêt.
      3. Sélectionnez la commande « mesure » dans le menu déroulant « analyser » et effectuer une analyse d’intensité pixel.
      4. Intensité de pixels doit être normalisée en divisant l’intensité de la superficie totale analysée. Après normalisation, calculer la GFP DsRed ratio22.
    8. Utiliser l’analyse statistique logiciel soit conduite de student t-test (comparaison entre les deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique p < 0,05 comme significatives5,17 .
  2. Évaluation de mitophagy à l’aide de co-localisation entre DCT-1 et 1-LGG
    Remarque : Le DCT-1 est une protéine de la membrane mitochondriale externe qui agit comme un récepteur de mitophagy en réponse au stress des conditions, semblables à ses orthologues putatif BNIP3 et NIX/BNIP3L mammifères5. Ainsi, mitophagy initiation évalue la co-localisation entre mitophagy du récepteur et autophagosomal protéine membranaire DCT-1 LGG-1 (homologue de la LC3 chez les mammifères).
    1. Jour 1 : Pick L4 larves d’animaux transgéniques exprimant la DCT-1::GFP et DsRed::LGG-1 dans la paroi corporelle muscle cellules5 sur un OP50 ensemencé plaque NGM. Placer 5 à 10 vers/3.5 cm plaque et utiliser au moins trois besants. Incuber les nématodes à 20 ° C.
      Remarque : Les transgènes sont situés sur des plasmides distincts et ils ne sont pas intégrés dans le génome. Ramasser les nématodes, les rol-6(su1006) et pmyo-2 marqueurs de contransformation GFP. Seulement vers transgéniques avec les deux marqueurs contransformation expriment la DCT-1::GFP et DsRed::LGG-1 dans les cellules musculaires paroi corporelle.
    2. Suivez les étapes de 2.1.2-2.1.5.
    3. Image simple paroi corporelle les cellules musculaires à l’aide d’une caméra attachée à un microscope confocal5,23. Détecter les bordures de cellules de muscle de toute paroi corporelle et z-pile de prendre des images moins 63 x grossissement. Un grossissement supérieur peut également être utilisé.
    4. Ouvrir et traiter les images obtenues avec le logiciel confocal. Ouverture de mitophagy est indiqué par la co-localisation des récepteurs mitophagy (DCT-1::GFP) jusqu'à la borne autophagosomal (DsRed::LGG-1). Manuellement mesurer les événements de colocalisation dans chaque pile de paroi corporelle muscle cellule5. Il est essentiel pour assurer la cohérence tout au long des expériences de tous les paramètres de microscope et caméra (lentille et loupe, filtres, durée d’exposition, résolution, intensité du laser, gain, etc.). A noter tous les réglages.
    5. Utiliser l’analyse statistique logiciel soit conduite de student t-test (comparaison entre les deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique p < 0,05 comme significatives5,17 . Usage de comparaisons bidirectionnelles de la Student t-test (p < 0,05 est considérée comme significative). Pour les comparaisons multiples utilisez l’analyse de variance simple facteur (ANOVA), corrigé par le test post hoc de Bonferroni. Nous vous recommandons d’analyser au moins 50-70 animaux ou des cellules de muscle de paroi corporelle de 30 à 50 pour chaque condition expérimentale. Réitérer l’expérience au moins trois fois.

3. détection des Mitophagy chez la souris

NOTE : Des méthodes précédentes pour détecter les mitophagy chez les souris étaient encombrantes, insensible et difficile à quantifier. Un modèle de souris transgénique exprimant la forme mitochondriale ciblée du reporter fluorescent Keima (mt-Keima) peut maintenant être utilisé afin d’évaluer les niveaux de mitophagy dans un large éventail de conditions physiologiques et physiopathologiques.

  1. Euthanasier la souris à l’aide d’un protocole approuvé par l' animalier institutionnel et Comité d’utilisation14.
  2. Fixez la souris (face ventrale vers le haut) à la plate-forme de travail à l’aide de goupilles dans les membres. Faites une incision dans le bas ventre à l’aide de ciseaux de microchirurgie et forceps pour exposer le foie24. Couper un morceau de foie (par exemple, un morceau de lobe droit à 1 × 1 × 1 cm) à l’aide de ciseaux de microchirurgie et de forceps.
    NOTE : Détection de mitophagy chez la souris est complexe et nécessite des connaissances sur l’anatomie de souris et de manipulation de la souris très habile et de chirurgie de la souris. Ce protocole prévoit des étapes fondamentales, clés sur cette méthode et une méthode plus détaillée est disponible24.
  3. Placer l’échantillon du foie sur une plaque métallique sur la glace pour refroidir rapidement les tissus. Garder le tissu sur la plaque de métal froide et traiter le plus rapidement possible. Idéalement, utilisez moins de 1 h de la dissection.
  4. Soulevez l’échantillon du foie avec une pincette courbée et rincer avec 5 mL de PBS glacée 1 x.
  5. Transférer le foie dans une boîte de Pétri (Ø 100 mm) sur la glace à l’aide de l’extrémité de la cuillère d’une spatule.
  6. Couper l’échantillon du foie à la main dans 0,5 à 1 coupes mm d’épaisseur à l’aide de lames seul bord.
  7. Transvaser avec soin les sections de tissu pour un plat de dessous de verre avec une pincette de microchirurgie.
  8. Poser soigneusement la section du foie avec une pince pour l’aplatir sur le fond.
  9. Couvrir le foie en tranches de 3-5 gouttes de PBS 1 x contre le rhume.
    NOTE : La coloration DAPI est recommandée pour identifier la zone d’intérêt dans certains tissus (p. ex., cerveau)24. Pour valider la co-localisation du signal rouge TM-Keima avec le lysosome, lysosomales colorants, comme le dextran cascade bleu et lysosensor, peuvent être utilisé24.
  10. Les sections de tissu sous microscopie confocale, par l’intermédiaire de deux excitations séquentielle24de l’image. Set de deux canaux d’imagerie : « vert » canal mt-Keima (excitation 458 nm, émission 570-695 nm estimés) et « rouge » mt-Keima (excitation 561 nm, émission 570-695 nm estimés). Gérer des paramètres d’imagerie entre des conditions expérimentales. Pour l’imagerie plus efficace, analyser deux animaux en même temps.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Détection des Mitophagy dans les cellules humaines :

À l’aide de la procédure présentée ici, l’humains cellules HeLa ont été transfectées avec mt-Keima plasmide. Cellules saines ont démontré un réseau bien organisé mitochondrial (GFP, 488 nm) avec une incidence peu de mitophagy (DP, 561 nm). Cependant, les cellules prétraitées avec un découpleur mitochondrial FCCP (30 µM pour 3 h) présentaient une augmentation profonde incidence mi...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Une mesure précise de mitophagy est techniquement difficile. Ici, nous présentons plusieurs techniques robustes qui permettent les deux détection qualitative des mitophagy et quantification des niveaux mitophagy dans les modèles expérimentaux de laboratoire courantes.

Acquisition de données réplicables, un modèle expérimental au moins trois répétitions biologiques est nécessaire. Tous les chercheurs impliqués dans l’expérimentation et l’analyse doivent être aveugle aux identités de groupe expé...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Le laboratoire de Bohr a CRADA accords avec ChromaDex et GlaxoSmithKline.

Remerciements

Nous remercions m. Atsushi Miyawaki et Dr. Richard J. Youle partage le plasmide Keima-mt et mt-Keima intégré les cellules Hela. Nous remercions Raghavendra A. Shamanna et Dr. Deborah L. Croteau de la lecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par le programme de recherche intra-muros de la NIH (VAB), l’Institut National sur le vieillissement, mais aussi un 2014-2015 et 2016-2017 NIA intra-laboratoire accordent (FEP, VAB). EFF a été pris en charge par HELSE DORS-OST RHF (projet No : 2017056) et le Conseil norvégien de la recherche (projet No : 262175).

CONTRIBUTIONS DE L’AUTEUR :

EFF conçu le manuscrit et préparé l’ébauche ; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH et ED a écrit des différentes sections du document ; NT, JP, HN et VAB révisé le manuscrit et a fourni son expertise.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
souris mt-KeimaJackson Laboratory
Lipofectamine 2000 réactif de transfection d’ADNThermofisher#11668027
Opti-MEM medium (Gibco)Thermofisher#31985062milieu sans sérum
mtKemia plasmide : pCHAC-mt-mKeimaaddgene#72342
Anticorps COXII (souris)abcam#ab110258
Anticorps LAMP2 (lapin)NOVUS
chèvre-anti-lapin avec longueur d’onde 568 nm de protéine fluorescente rouge (RFP)Thermofisher#Z25306colorant Alexa Fluor 568
chèvre-anti-souris avec longueur d’onde 488 nm de protéine fluorescente verte (GFP)Thermofisher#Z25002Alexa Fluor 488
prolonge l’anti-décoloration dorée avec DAPIInvitrogen#P36931
Plaque 6 puitsSIGMA
Corning Costar		#CLS3516
Lame à 4 puitsTHermofisher, Nunc Lab-Tek#171080
Nunc F Plaque 96 puitsThermofisher#152038
LC3B anticorps de lapinNOVUS#NB100-2220
Anticorps ADNProgen Biotechnik#anti-DNA souris monoclonale, AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306milieu de montage anti-évanouissement avec DAPI
IN Analyseur de cellules (lecteur fluorescentGE Healthcare Life Sciences#IN Analyseur de cellules 2200
Eclipse TE-2000e Microscope confocalNikon#TE-2000e
Logiciel de colocalisationVolocity#Volocity 6.3alternative Logiciel Zeiss ZEN 2012
IN Cell Investigator SoftwareGE Healthcare Life Sciences#28408974
milieu de culture cellulaireThermofisher#DMEM&ndash ; Dulbecco’s Modified Eagle Medium
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermofisher#15140122
Sérum de veau fœtalSigma-Aldrich#12003C-1000ML
Incubateur de culture cellulaireThermofisher#Thermo Forma 3110 Incubateur
Microscope à épifluorescenceZeissZeiss Axio Imager Z2
appareil photoOlympusOlympus DP71
microscope confocalZeissZeiss Axio Observer Z1
logiciel confocalZeissZEN 2012
d’imagesImage Janalyse de colocalisation, etchttps://imagej.nih.gov/ij/
logiciel d’analyse statistiqueGraphPad Software Inc., San Diego, États-UnisGraphPad Prism progiciel
matériel pour fabriquer un pic à vis sans finSurepure Chemetals#4655Le pic est fait de fil de fer de calibre 30 90 % platine 10 % iridium
IR : N2 ; Ex[pmyo-3 TOMM-20 ::Rosella]Demande matérielle à Tavernarakis NektariosMaintenir les animaux transgéniques à 20 ° ; C
IR : N2 ; Ex[pdct-1 DCT-1 ::GFP ; pmyo-3 DsRed ::LGG-1]Enquête matérielle à Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20 ::RosellaEnquête matérielle à Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1 ::GFPEnquête matérielle à Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed :: LGG-1Enquête matérielle à la solution de paraquat Tavernarakis Nektarios
voir données supplémentaires pour la préparation
Tampon M9voir données supplémentaires pour la préparation
Tampon M9-lévamisolevoir données supplémentaires pour la préparation
Lames de microscope en verre et lamellesFisher Scientific#B9992000
Pince chirurgicaleSTERIS Animal Health19 pièces Canine Spay Pack Economy
Ciseaux chirurgicauxSTERIS Animal Health19 pièces Canine Spay Pack Economy
1x PBSThermofisher#AM962510x PBS doit être dilué à 1x PBS à l’aide d’un agitateur ddH2O
Fisher Scientific#11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package Un
tampon d’agarose à 2 %,voir les données supplémentaires pour la préparation
Lames VibrosliceWorld precision instruments#BLADES-2lame unique
à tranchant MSC#788039880,012 po d’épaisseur x 6 po de largeur x 12 po de longueur, tôle d’acier inoxydable 430
Triton X-100détergent
Dichlorure de méthyl viologène hydrateSigma-Aldrich#856177paraquat
Incubateur pour nématodesAQUALYTICIncubateur pour maintenir 20 ° ; C
Stéréomicroscope à dissectionOlympusSMZ645
Microscope confocalZeissAxioObserver Z1Pour nématodes (étape 2)
microscope à épifluorescenceZeissAxioImager Z2Pour nématodes (étape 2)
Réticulant UVVilber LourmatBIO-LINK &ndash ; Source de lumière UV BLX-E365; 356 nm
#CD107b colorant )à enveloppe d’eau CO2logiciel d’analyse . plaque métallique à

Références

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397(2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

D tection de la mitophagiesant mitochondrialemicroscopie confocaleplasmide Mito Keimasouches de C eleganscellules HeLa humainestissu h patique de souristraitement au paraquatd coupleur FCCPcolocalisation LAMP2 COXII
In Vitro et In Vivo la détection des Mitophagy dans les cellules humaines, C. Eleganset la souris
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.