Détection de potentiel de Membrane des mitochondries pour étudier CLIC4 HN4 induite par le Knockdown cellule Apoptosis In Vitro

Résumé

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’application de la rhodamine 123 pour identifier le potentiel de membrane mitochondrial (MMP) et étudier CLIC4 induite par le knockdown HN4 cellulaire, l’apoptose in vitro. Sous le microscope à fluorescence commun et microscope à fluorescence laser confocale, le changement en temps réel de la MMP a été enregistré.

Résumé

Diminution du potentiel membranaire mitochondrial (MMP, ΔΨm) est considéré comme le premier événement dans la cascade apoptotic. Il arrive même devant les caractéristiques de l’apoptose nucléaire, y compris la condensation de la chromatine et la rupture de l’ADN. Une fois que les effondrements MMP, l’apoptose cellulaire entamera irréversiblement. Une série de colorants cationiques lipophiles peut traverser la membrane de la cellule et agréger à l’intérieur de la matrice de la mitochondrie et servir de marqueur de fluorescence pour évaluer le changement MMP. Comme l’un des six membres de la Cl^– famille canal intracellulaire (CLIC), CLIC4 participe dans le processus d’apoptose cellulaire principalement par le biais de la voie mitochondriale. Nous décrivons ici un protocole détaillé permettant de mesurer les MMP via la fluctuation de la fluorescence de la Rhodamine 123 (Rh123), à travers lequel, nous étudions l’apoptose induite par CLIC4 knockdown de surveillance. Nous examinons les avantages et les limites de l’application de confocale à balayage laser et microscope à fluorescence normale en détail et aussi le comparer avec d’autres méthodes.

Introduction

Rh123 est un colorant cationique fluorescence, qui sert d’indicateur pour le potentiel transmembranaire. Rh123 est capable de pénétrer la membrane cellulaire et entrer dans la matrice mitochondriale selon la différence de potentiel à l’intérieur et à l’extérieur de la membrane¹. Apoptosis mène aux dommages de l’intégrité de la membrane mitochondriale. Le pore de transition de perméabilité de mitochondrie (MPTP) ouvrira et conduire à l’effondrement de la MMP, qui à son tour entraîne la libération de Rh123 à l’extérieur de la mitochondrie. Enfin, un signal de fluorescence verte sera détecté sous microscope à fluorescence. Il est bien documenté qu....

Protocole

1. Culture et Transfection des cellules

1. Culture cellulaire
   Remarque : HN4, une lignée de cellules HNSCC, provenaient de patients atteints de HNSCC¹⁴.
   1. La culture HN4 cellule de Dulbecco modifiée milieu Eagle (DMEM, 4,5 g/L de glucose) additionné de sérum de veau fœtal 10 % et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO₂.
2. Transfection de cellules
   1. Un jour avant la transfection, plaque 5 x 10⁵ cellules dans 2 mL/puits de milieu de culture sans antibiotiques en pl....

Résultats

Dans la présente étude, Rh123 a été appliqué pour détecter la MMP. Au départ, a cultivé des cellules HN4 pour la fluorescence suivante des expériences de coloration. Pince à épiler servaient à mettre des lamelles circulaires sur le fond des plaques 6 puits (Figure 1A). Les lamelles ont été enduits avec polylysine pendant 5 min, puis la polylysine supprimé à l’aide (Figure 1B). Puis HN4 cellules é.......

Discussion

Il est bien documenté que Cl⁻ canaux est essentielles pour maintenir l’hémostase de l’environnement interne et joue un rôle important dans la prolifération cellulaire et l’apoptose^15,16. Comprendre la relation entre l’intervention d’axés sur le canal d’ion et de l’apoptose est donc de grande nécessité et l’importance de trouver une meilleure approche thérapeutique pour divers cancers¹⁷. Mitochondries maintiennent l’état biologiq.......

Matériaux

Les humaine CLIC4

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
cellules HNSCC	ATCC	CRL-3241
Polylysine	Thermo Fisher Scientific	P4981
Des siRNA spécifiques pour la	biomique	NM_013943	(numéros d’accession, NM_013943 ; correspondant à la séquence d’ADNc 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) et des siRNA brouillés (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) ont été conçus et obtenus auprès de la société
BiomicsRéactif de transfection Lipofectamine 2000  ;	Thermo Fisher Scientific	L3000-015
Opti-MEM I Sérum Réduit, GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure grede	Thermo Fisher Scientific	R22420
Dulbecco' Eagle medium modifié (DMEM, 4,5 g/L de glucose)	Gibco	11965-084
Sérum de veau fœtal, qualifié, Australie Origine	Gibco	10099141
Trypsine-EDTA Solution	Beyotime	C0201
Antibiotique-Antimycosique, 100X	Gibco	15240062
Microscopie confocale à balayage laser	Leica Microsystems GmbH	LEICA. SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Microscope inversé	Nikon	N/A
Metaflour, V7.5.0.0	Universal Imaging Corporation	N/A
Suite d’applications Leica, v2.6.0.7266	Leica Microsystems GmbH	N/A
Microsoft office Excel 2007	Microsoft	N/A
Sigma Plot 12.5	Systat Software	N/A
Chambre cellulaire Attofluor	Thermo Fisher Scientific	A7816