Article de méthode

Détection de potentiel de Membrane des mitochondries pour étudier CLIC4 HN4 induite par le Knockdown cellule Apoptosis In Vitro

DOI :

10.3791/56317

⸱

17 juillet 2018

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1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2Department of Orthopedics, Anhui Provincial Hospital, Anhui Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’application de la rhodamine 123 pour identifier le potentiel de membrane mitochondrial (MMP) et étudier CLIC4 induite par le knockdown HN4 cellulaire, l’apoptose in vitro. Sous le microscope à fluorescence commun et microscope à fluorescence laser confocale, le changement en temps réel de la MMP a été enregistré.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diminution du potentiel membranaire mitochondrial (MMP, ΔΨm) est considéré comme le premier événement dans la cascade apoptotic. Il arrive même devant les caractéristiques de l’apoptose nucléaire, y compris la condensation de la chromatine et la rupture de l’ADN. Une fois que les effondrements MMP, l’apoptose cellulaire entamera irréversiblement. Une série de colorants cationiques lipophiles peut traverser la membrane de la cellule et agréger à l’intérieur de la matrice de la mitochondrie et servir de marqueur de fluorescence pour évaluer le changement MMP. Comme l’un des six membres de la Cl– famille canal intracellulaire (CLIC), CLIC4 participe dans le processus d’apoptose cellulaire principalement par le biais de la voie mitochondriale. Nous décrivons ici un protocole détaillé permettant de mesurer les MMP via la fluctuation de la fluorescence de la Rhodamine 123 (Rh123), à travers lequel, nous étudions l’apoptose induite par CLIC4 knockdown de surveillance. Nous examinons les avantages et les limites de l’application de confocale à balayage laser et microscope à fluorescence normale en détail et aussi le comparer avec d’autres méthodes.

Introduction

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Rh123 est un colorant cationique fluorescence, qui sert d’indicateur pour le potentiel transmembranaire. Rh123 est capable de pénétrer la membrane cellulaire et entrer dans la matrice mitochondriale selon la différence de potentiel à l’intérieur et à l’extérieur de la membrane1. Apoptosis mène aux dommages de l’intégrité de la membrane mitochondriale. Le pore de transition de perméabilité de mitochondrie (MPTP) ouvrira et conduire à l’effondrement de la MMP, qui à son tour entraîne la libération de Rh123 à l’extérieur de la mitochondrie. Enfin, un signal de fluorescence verte sera détecté sous microscope à fluorescence. Il est bien documenté que l’appauvrissement de la MMP et perméabilité membranaire élevée sont des signes précoces de l’apoptose de cellules2. Par conséquent, Rh123 peut être appliqué à la détection des changements MMP et l’apparition de l’apoptose cellulaire.

Comme le 6ème carcinome plus courant dans le monde, cancer de la tête et du cou détériore gravement santé3 une personne. Bien que plusieurs approches ont été développées ces dernières années, les résultats cliniques de traitement pour les patients souffrant de la tête et du cou carcinome épidermoïde (HNSCC) sont toujours pas idéal4. Explorer de nouvelles méthodes thérapeutiques peut améliorer le traitement des HNSCC5. Les canaux ioniques impliquant de nombreux processus biologiques affichent un rôle important dans le développement de différents cancers6. Participation partielle ou totale des canaux Cl– sont fortement impliqués dans diverses propriétés de transformation néoplasique, y compris la migration active, un taux élevé de prolifération et son caractère invasif. Dans ce contexte, le CLIC, une famille de la nouvelle protéine, a été inscrit comme une classe prometteuse de cibles thérapeutiques pour le traitement de cancer6,7. Des études récentes ont révélé que localiser les membres de la famille CLIC dont CLIC5, CLIC1 et CLIC4 à cardiaque mitochondriale et le niveau de l’espèce (ROS) réactives de l’oxygène est augmentée par CLIC5, qui indique le rôle fonctionnel des mitochondries situées Cl - canaux dans l’apoptose réponse8. CLIC4, membres de la famille CLIC (également connu sous le nom mtCLIC, P64H1 et RS43), a été plus particulièrement étudié pour ses propriétés de règlement d’apoptose dans les cellules cancéreuses et l’emplacement sous-cellulaire y compris Golgi, le réticulum endoplasmique et mitochondrie chez l’homme kératinocytes7,9,10. Le profil d’expression de CLIC4 était réglementé par le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), P53 et stimulus externe. Surexpression et downregulation de CLIC4 déclenchent une réponse apoptotique principalement par le biais de la voie mitochondriale accompagnée avec le déséquilibre entre les membres de la famille Bcl-2, activation de la caspase cascade et la libération du cytochrome C11, 12 , 13. par conséquent, mesure de MMP est essentielle afin d’explorer l’apoptose CLIC4 liés et Rh123 sert d’indicateur de fluorescence idéale.

La présente étude décrit un protocole détaillé pour la détection des MMP pour étudier CLIC4 l’apoptose induite par précipitation dans les cellules HN4. Rh123 est utilisé comme une sonde de fluorescence pour observer le changement de la MMP. Sous le microscope à fluorescence commun et microscope à fluorescence laser confocale, la fluctuation en temps réel de la MMP peut être résolue. Nous examinons les avantages et les limites de l’application de confocal laser scanning microscope à fluorescence en détail et aussi le comparer avec d’autres méthodes. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres études liées à l’apoptose.

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Protocole

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1. Culture et Transfection des cellules

  1. Culture cellulaire
    Remarque : HN4, une lignée de cellules HNSCC, provenaient de patients atteints de HNSCC14.
    1. La culture HN4 cellule de Dulbecco modifiée milieu Eagle (DMEM, 4,5 g/L de glucose) additionné de sérum de veau fœtal 10 % et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
  2. Transfection de cellules
    1. Un jour avant la transfection, plaque 5 x 105 cellules dans 2 mL/puits de milieu de culture sans antibiotiques en plaques 6 puits.
    2. Diluer 100 pmol CLIC4 siARN ou brouillé SiRNA dans 250 µL de médias de sérum réduit, doucement. Diluer 5 µL de réactif de liposome dans 250 µL de médias de sérum réduit et incuber pendant 5 min. combiner le siARN dilué avec le réactif dilué liposome, mélanger doucement et incuber pendant 20 min à température ambiante.
    3. Ajouter le mélange dans chaque cupule contenant des cellules et le milieu. Mélanger doucement en balançant la plaque arrière-et-vient. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO2 pendant 24 h avant d’effectuer la procédure suivante d’étiquetage Rh123. Remplacez le milieu par milieu de croissance normale 4 h après la transfection.

2. Rh123 d’étiquetage

Remarque : Rh123 a été utilisé pour mesurer la MMP dans HN4 cellules1.

  1. Après traitement de siARN CLIC4 (Section 1), utiliser des cellules de HN4 en plaques 6 puits pour le traitement suivant. La quantité de cellules HN4 dans chacune est bien assez pour répéter l’expérience 10 fois sur lamelles couvre-objet.
  2. Pince à épiler permet de mettre des lamelles circulaires sur fond de nouvelles plaques de 12 puits. Le nombre de plateaux est défini selon le protocole expérimental (Figure 1A).
  3. Placez au centre de chaque lamelle à l’intérieur des plaques de 12 puits 150 µL de 100 µg/mL polylysine et attendez 2 min. faites attention de ne pas mettre polylysine dehors les lamelles couvre-objet. Ensuite enlevez la polylysine par multipipette complètement (Figure 1B).
  4. Supprimez le milieu de culture des cellules à l’intérieur de la capsule HN4 et trypsine 0,25 % 1 mL pour détacher les cellules. Après 6 min, ajouter 2 mL de milieu de culture pour neutraliser la trypsine. Mélanger délicatement les cellules HN4 par pipette pour 5 fois et semences 2-6 x 104 cellules sur les lamelles circulaires. Placer dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 (Figure 1C).
  5. Après 8 h d’incubation, incuber les cellules HN4 avec 2 µmol/L Rh123 pendant 40 min à 37 ° C. Mélanger doucement la moyenne haut en bas plusieurs fois pour assurer une répartition égale de Rh123 dans le milieu (Figure 1D).
  6. Préparer suffisamment solution physiologique normale (PDQ) ; pour faire des PDQ (en mmol/L) : NaCl 140, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, glucose 10 et 5 HEPES, pH 7,4). Préchauffer à 37 ° C dans un bain d’eau.
  7. Utiliser des pinces pour enlever le couvre-objet et lavez le reste liquide via brièvement placer les lamelles dans le tampon NPBS préchauffé (Figure 1E).
  8. Placer les lamelles sur le fond de la chambre en acier inoxydable de 500 µL (voir Table des matières) avec un fond de lamelle de verre remplaçables 25 mm scellés en place par un joint torique. Fixez-le en serrant le couvercle de la chambre (Figure 1E).
  9. Ajouter 450 µL préchauffé tampon brevetés à la chambre d’Assemblée et de mettre la baignoire sous le champ visuel de la microscopie à fluorescence ou confocal laser scanning microscope à fluorescence (Figure 1E).

3. détection de la MMP

  1. Microscope à fluorescence commune
    1. Allumez le microscope de fluorescence, suivant les instructions du fabricant.
      NOTE : Commune microscope à fluorescence a été accomplie avec une source de lumière de fibre optique lampe de mercure, un filtre FITC néc Rh123 (480/40 filtre d’excitation, 505 miroir dichroïque LP et filtre d’émission 535/40) à la température ambiante. Objectif 20 X a été utilisée pour effectuer l’imagerie de cellules vivantes.
    2. Ouvrez le logiciel de système d’imagerie et sélectionnez le bouton « Nouveau » dans la barre de commandes pour commencer une nouvelle expérience (Figure 2A).
    3. Ajuster le champ visuel et l’orientation pour trouver l’emplacement des cellules en lumière blanche.
    4. Éteindre la lumière et appuyez sur le bouton pour fermer la lumière blanche. Cliquez sur le bouton « Focus » de la barre de commandes, puis sélectionnez « Démarrer l’accent » pour basculer sur la fluorescence. Trouver l’emplacement des cellules à nouveau par l’intermédiaire de microscope avec une excitation nm 507 et émission de longue passe 529 nm de longueur d’onde (ensemble avant l’expérience). Ajuster le champ visuel et se concentrer à nouveau si nécessaire (Figure 2B).
    5. Sélectionnez un champ visuel contenant des cellules HN4 séparés de seulement 20 à 30. La modification du signal de fluorescence intracellulaire pour chaque cellule est enregistrée avec précision.
    6. Lorsqu’on atteint un champ visuel clair, cliquez sur « Mise au point rapprochée » de la barre de Focus. Cliquez sur « Acq One » dans la barre de commandes d’acquérir un ensemble d’images. Cliquez sur « Régions » de la barre de commandes, puis cliquez sur le bouton « OK » pour modifier les régions de mesure.
      Remarque : Dans la barre de la région de modifier, de formes différentes région peuvent être utilisés selon l’étude.
    7. Pour s’adapter à différentes formes de cellules individuelles, sélectionnez l’outil « Zone de Trace » et encercler la région d’une seule cellule et double-cliquez lorsque vous avez terminé. Répétez la procédure jusqu'à ce que toutes les cellules sont encerclés (Figure 2C). Cliquez sur « Terminé » et sélectionnez « Enregistrer les Images » pour trouver l’emplacement d’enregistrement.
    8. Cliquez sur « Zeroclock « et pousser rapidement F4 pour commencer à surveiller le changement de l’intensité de la fluorescence. Enregistre le temps réel changement d’intensité de fluorescence, une fois tous les 5 s pendant 5 min (Figure 2D).
    9. Lorsque la ligne de base devienne stable, ajouter 50 µL PDQ mélangé avec 0,5 µL de 100 mmol/L ATP à la chambre à l’aide. N’oubliez pas de ne touchez ne pas la chambre pour éviter de supprimer le champ visuel (Figure 2E).
      Remarque : L’image de fluorescence sera inscrite pendant 20 min et puis l’expérience peut se terminer par l’intermédiaire de fonctionnement manuel. La durée est réglée régulièrement pendant 20 min afin d’observer l’ensemble de la modification de la fluorescence. Cependant, opération manuelle pour arrêter la capture est appliquée lorsque inattendu de facteurs influent sur la stabilité de la courbe ou quand l’ensemble du processus prend moins de 20 min.
  2. Microscope à fluorescence laser confocal
    1. Mettez sur le confocal laser scanning microscope de fluorescence après les instructions du fabricant et ouvrez le logiciel fourni.
      NOTE : Ici, la Rh123 a été excité par un laser à Argon fixé à 488 nm et le signal émis a été enregistré sur la plage de 545 à 700 nm via l’application du filtre TD488/543/633.
    2. Cliquez sur « Objectif » sous le menu « Acquire » pour sélectionner 63 X / 1.4 N.A. huile porte-objectif. Observez le spécimen et trouvez un champ visuel clair sous le champ de lumière.
    3. Poussez le bouton « TL/IL » pour passer au mode de fluorescence et sélectionnez les filtres de fluorescence correct pour trouver l’emplacement de la cellule sous l’obscurité par l’intermédiaire de microscope. Appuyez sur « SHUTTER » pour protéger le spécimen lors de l’observation est terminée.
    4. Sous le menu « Acquérir », régler le canal PMT convenable et cliquez sur « Obtenir » pour activer le chemin optique réglé (Figure 3A). Cliquez sur le menu « Configuration » et choisissez « Laser » pour déterminer le type de laser nécessaire. « Argon » est recommandé pour ce protocole (Figure 3B).
    5. Cliquez sur « Live » pour obtenir l’image en temps réel et de s’assurer que le champ visuel contient des cellules HN4 séparés de seulement 20 à 30. La modification du signal de fluorescence intracellulaire pour chaque cellule est enregistrée avec précision.
    6. Sélectionnez « xyt » en Mode d’Acquisition dans le sous-menu « Acquisition » sous le menu « Acquisition » (Figure 3C). Set 5 s et 20 min d’intervalle de temps et de la durée, respectivement. Cliquez sur » appliquer » lorsque tous les paramètres sont réglées.
    7. Sous le menu « Quantifier », utilisez l’outil « Dessiner polyligne » d’encercler la zone d’enregistrement de chaque cellule. Sélectionnez « Profil de la ligne » et choisissez « Start » pour mener l’observation. Enregistrer la modification en temps réel de l’intensité de la fluorescence pendant 5 min (Figure 3D - E).
    8. Lorsque la ligne de base devienne stable, ajouter 50 µL PDQ mélangé avec 0,5 µL de 100 mmol/L ATP à la chambre à l’aide. N’oubliez pas de ne touchez ne pas la chambre pour éviter de supprimer le champ visuel.
      Remarque : L’image de fluorescence sera inscrite pendant 20 min et puis l’expérience est terminée.

4. analyse statistique

  1. Microscope à fluorescence commune
    1. Allumez le microscope de fluorescence régulièrement suivant le manuel. Ouvrez le logiciel de système d’imagerie et sélectionnez le bouton « Ouvrir » dans la barre de commandes pour ouvrir une expérience enregistrée. Cliquez sur « Régions » de la « barre de commandes » et cliquez sur le bouton « OK » pour modifier les régions de mesure.
    2. Sélectionnez l’outil « Zone de Trace » et encercler la région d’une seule cellule et double-cliquez lorsque terminé. Répétez la procédure jusqu'à ce que toutes les cellules ont été encerclés. Cliquez sur « Done » et sélectionnez le « F4 : vers l’avant » le bouton pour obtenir une trace indiquant l’intensité de la fluorescence.
    3. Une fois terminé, cliquez sur le bouton flèche bas situé sur le coin inférieur droit du graphique et cliquez sur « Afficher les données de graphique » (Figure 2F). Cliquez deux fois sur « OK » et cliquez sur le bouton « Log Data » pour ouvrir l’interface du logiciel de traitement de données. Cliquez de nouveau sur « Données » et de trouver que les enregistrements de fluctuation en temps réel de l’intensité de fluorescence apparaissent sur la feuille de calcul.
      Remarque : Pour chaque cellule, changements de MMP étaient affichées comme le ratio de la fluorescence par rapport à l’intensité avant l’application de l’ATP ou TG (F1/F0). Chaque données d’intensité de fluorescence sont la moyenne de 20 à 30 cellules. Données pour Rh123 sont présentées sous forme de moyenne ± SE. résultats des 2 groupes ont été testées par le test bilatéral indépendant t et la valeur de P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative. Logiciel d’analyse statistique a été appliqué pour procéder à des analyses statistiques dans cette expérience.
  2. Microscope à fluorescence laser confocal
    1. Allumez le microscope confocal laser et ouvrez une session dans le logiciel fourni en suivant les instructions du fabricant.
    2. Sélectionnez « Fire » pour ouvrir une expérience enregistrée.
    3. Sélectionnez l’outil « Profil de la pile » sous le menu « Quantifier », choisissez « All in one » dans « Tableaux de tri par des canaux et des ROIs. »
    4. Utilisez l’outil de « Dessiner un polygone » aux régions de cellule de cercle pour l’observation.
    5. Sélectionnez le menu « Graph » et cliquez sur le bouton droit de la souris et choisissez « Export Excel » pour ajouter les valeurs d’intensité de fluorescence à une feuille de calcul. L’analyse qui suit est compatible avec les microscopes de fluorescence normale (Figure 3-F).

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Résultats

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Dans la présente étude, Rh123 a été appliqué pour détecter la MMP. Au départ, a cultivé des cellules HN4 pour la fluorescence suivante des expériences de coloration. Pince à épiler servaient à mettre des lamelles circulaires sur le fond des plaques 6 puits (Figure 1A). Les lamelles ont été enduits avec polylysine pendant 5 min, puis la polylysine supprimé à l’aide (Figure 1B). Puis HN4 cellules é...

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Discussion

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Il est bien documenté que Cl− canaux est essentielles pour maintenir l’hémostase de l’environnement interne et joue un rôle important dans la prolifération cellulaire et l’apoptose15,16. Comprendre la relation entre l’intervention d’axés sur le canal d’ion et de l’apoptose est donc de grande nécessité et l’importance de trouver une meilleure approche thérapeutique pour divers cancers17. Mitochondries maintiennent l’état biologiq...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions M. Chao Fang culture cellulaire. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Chine (Grant no 81570403, 81371284) ; Anhui Provincial Natural Science Fondation (subvention no 1408085MH158) ; Remarquable jeune chercheur de l’Université de médecine de Anhui ; Soutenir les programme d’excellents jeunes Talents dans les universités de la Province d’Anhui.

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Matériaux

Les humaine CLIC4

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
cellules HNSCCATCCCRL-3241
PolylysineThermo Fisher ScientificP4981
Des siRNA spécifiques pour labiomiqueNM_013943(numéros d’accession, NM_013943 ; correspondant à la séquence d’ADNc
5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3) et des siRNA brouillés (5 ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3) ont été conçus et obtenus auprès de la société
BiomicsRéactif de transfection Lipofectamine 2000  ;Thermo Fisher ScientificL3000-015
Opti-MEM I Sérum Réduit, GlutaMAXThermo Fisher Scientific51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure gredeThermo Fisher ScientificR22420
Dulbecco' Eagle medium modifié (DMEM, 4,5 g/L de glucose)Gibco11965-084
Sérum de veau fœtal, qualifié, Australie OrigineGibco10099141
Trypsine-EDTA SolutionBeyotimeC0201
Antibiotique-Antimycosique, 100XGibco15240062
Microscopie confocale à balayage laserLeica Microsystems GmbHLEICA. SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 Microscope inverséNikonN/A
Metaflour, V7.5.0.0Universal Imaging CorporationN/A
Suite d’applications Leica, v2.6.0.7266Leica Microsystems GmbHN/A
Microsoft office Excel 2007MicrosoftN/A
Sigma Plot 12.5Systat SoftwareN/A
Chambre cellulaire AttofluorThermo Fisher ScientificA7816

Références

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