Article de méthode

Génération d’un gène-perturbé Streptococcus mutans souche sans gène clonage

DOI :

10.3791/56319

⸱

23 octobre 2017

 ,  ,  , 
1Department of Translational Research, Tsurumi University School of Dental Medicine, 2Endowed Department of International Oral Health Science (affiliated with Department of Translational Research), Tsurumi University School of Dental Medicine, 3Cariology and Operative Dentistry, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons une méthode facile, rapide et relativement peu coûteuse pour la génération de gène-perturbé Streptococcus mutans souches ; Cette technique peut être adaptée pour la production de souches de gène-perturbée de diverses espèces.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Méthodes typiques pour l’élucidation de la fonction d’un gène particulier comportent des analyses comparatives et phénotypiques de la souche sauvage et une souche dont le gène d’intérêt a été perturbé. Une construction d’ADN gène-perturbation contenant un gène marqueur de résistance aux antibiotiques appropriés est utile pour la génération des souches perturbé de gène dans les bactéries. Cependant, les méthodes de construction classiques, qui nécessitent des mesures clonage de gènes, axée sur des protocoles complexes et fastidieuses. Ici, une méthode relativement facile, rapide et rentable pour la rupture du gène ciblé chez Streptococcus mutans est décrite. La méthode utilise une fusion 2-étape chaîne par polymérase (PCR) pour générer la perturbation construct et électroporation pour transformation génétique. Cette méthode ne nécessite pas une réaction enzymatique, autres que les PCR et offre en outre une plus grande flexibilité en ce qui concerne la conception de la construction de la perturbation. Emploi d’électroporation facilite la préparation des cellules compétentes et améliore l’efficacité de la transformation. La présente méthode peut être adaptée pour la production de souches de gène-perturbée de diverses espèces.

Introduction

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Analyse de la fonction génique implique généralement une comparaison phénotypique entre une souche sauvage et une déformation dans laquelle un gène d’intérêt a été perturbé. Cette technique de gène-perturbation a été utilisée pour les analyses de la fonction du gène dans un large ensemble de taxons, des bactéries aux mammifères. Une construction de gène-perturbation est nécessaire pour la génération de la souche de gène-perturbé ; Cette construction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) comprend le gène marqueur de résistance aux antibiotiques fusionné à l’amont et l’aval des régions flanquantes du gène ciblé et est incorporée dans le génome par recombinaison homologue. La souche perturbé de gène peut être isolée en utilisant des milieux sélectifs contenant l’antibiotique. La méthode classique utilisée pour la construction de la souche de gène-perturbée nécessite des étapes complexes, telles que l’amplification du gène cible par polymerase chain reaction (PCR), ligature du gène dans un plasmide approprié, digestion avec restriction enzymes et RELIGACIÓN pour insérer le gène marqueur de résistance aux antibiotiques. Ce processus prend du temps, prenant plusieurs jours à plusieurs semaines, selon le succès de chaque étape. En outre, la conception de constructions de perturbation repose sur les sites de l’enzyme de restriction du gène cible. Pour résoudre ces problèmes, basées sur la PCR ADN épissage méthodes1,2 pour la conception de gène-perturbé des mutants de Dictyostelium discoideum3 et Synechocystis SP. PCC68034 ont été rapportés. Dans la présente étude, il a développé une méthode pour générer une souche de streptocoque gène-perturbé de façon relativement rapide, facile et peu coûteuse, en utilisant une méthode de PCR-based modifiée (désignée 2-step fusion PCR) pour la construction de la perturbation construction et électroporation pour transformation génétique.

La fusion de 2 étapes que PCR nécessite quatre paires d’ADN génomique et le gène marqueur de résistance aux antibiotiques comme modèle PCR convenablement conçu des amorces oligonucléotidiques. Dans la première étape (1st PCR), une région de flanquement 1 kb en amont du gène cible, une région de flanquement 1 kb en aval de la cible génétique et le gène marqueur de résistance aux antibiotiques sont amplifiés par PCR. Les régions 5' de l’apprêt inversée et l’amorce vers l’avant, pour l’amplification de l’amont et en aval les régions flanquantes, respectivement, incluent 15 bases complémentaires jusqu’aux extrémités du gène marqueur. Les régions 5' d’amorces avant et arrière pour l’amplification du gène marqueur de même incluent 15 bases complémentaires à l’extrémité inférieure de la région d’accompagnement en amont du gène cible et l’extrémité supérieure de la région de flanquement en aval du gène cible, respectivement. Par conséquent, les trois fragments amplifiés contiennent des régions de 30-nucléotide qui se chevauchent sur le site de fusion. Dans la deuxième étape (2nd PCR), PCR est réalisée avec des amorces PCR imbriqués à l’aide de trois fragments amplifiés par le 1st PCR en tant que modèles. Les régions complémentaires des modèles sont en outre reliées entre eux par l’intermédiaire de la 2ème PCR. Enfin, la construction de la recombinaison homologue est introduite à la souche sauvage par électroporation. Perturbation du gène réussie peut être vérifiée par PCR avec des amorces spécifiques. Bien que la construction de la perturbation est amplifiée utilisant haute fidélité ADN polymérase, les réactions enzymatiques supplémentaires, tels que la ligature d’ADN ou de la digestion de l’ADN, ne sont pas nécessaires pour générer la construction. En outre, une région supprimée ou conservée sur le génome peut être avec souplesse choisie selon la conception d’amorce.

Dans le présent travail, suppression de toute la région codante du gène gtfC , qui encode glucosyltransférase chez Streptococcus mutans, a été réalisée pour illustrer la méthode de perturbation rapide et facile des gènes dans une espèce de streptocoque. En outre, un gtfB-souche perturbée provenait de la même manière. La glycosyltransférase codé par gtfC et gtfB contribue à cariogènes biofilm dentaire développement5,6. Les capacités de formation de biofilm de la souche sauvage de la souche (S. mutans WT), gtfC-perturbé la souche (S. mutans ΔgtfC) et gtfB-souche perturbée (S. mutans ΔgtfB) ont été évalués pour les analyses phénotypiques comparatives. Ce protocole étend l’application d’une méthode en deux étapes pour la rupture du gène d’autres espèces et peut-être être modifié pour l’étude de la fonction des gènes dans un plus grand nombre de taxons.

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Protocole

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1. conception d’amorce

  1. préparer des amorces pour 2-step fusion PCR et la vérification d’une perturbation gène.
    Remarque : Le tableau 1 indique les séquences d’amorces utilisées dans le présent protocole. la figure 1 montre une illustration schématique de la méthode PCR de 2 étapes de fusion utilisée pour générer de S. mutans Δ gtfC.
    1. Des amorces de conception pour le remplacement de la région de cible dans le génome avec la résistance à la spectinomycine gène (spc r) 7. Le présent protocole remplace toute la région codante du gène gtfC avec spc, r.
    2. Inclure 15 bases complémentaires aux extrémités supérieures et inférieures de spc r 5 ' régions de haut-inverse et bas-forward amorces, respectivement. De même, comprend 15 bases complémentaires à l’extrémité inférieure des régions adjacentes en amont du gtfC et l’extrémité supérieure des régions adjacentes en aval du gtfC du 5 ' régions de spc r-avant et spc r -inverser les amorces, respectivement ( Figure 1 a).
      Remarque : Les séquences des haut-inverse, vers le bas en avant, spc r - vers l’avant et spc r - inverser amorces sont déterminés automatiquement selon le site d’incorporation de la construction de la perturbation.
    3. Concevoir les amorces up-marche avant et en bas-arrière comprendre > 1 kb en amont et en aval des régions flanquantes du gène gtfC, respectivement. Régler la température de fusion (T m) de haut-vers l’avant et vers le bas-arrière amorces selon la température de fusion des amorces inverse vers le haut et vers le bas en avant, respectivement ( Figure 1 a).
      Remarque : Se référer à la formule suivante pour déterminer T m : T m (° C) = 2 (* NA + * NT) + 4 (* NC + * NG) - 5, où * N représente le nombre de nucléotides amorce avec l’identité spécifiée (A, T, C ou G).
    4. Concevoir des amorces imbriquées (N_up-marche avant et N_up-arrière) pour la 2 ème PCR ( Figure 1 b).
      Remarque : Bien que la paire d’amorces ultrapériphériques (up-marche avant et en bas-arrière) peut être utilisée comme amorces pour la 2 ème PCR, amorces imbriquées (N_up-forward et reverse-N_up) ont été conçus dans le présent protocole. Amorces imbriquées sont souvent requis pour la 2 ème PCR, comme il est indiqué dans les Résultats de représentant.
    5. Des amorces de conception spécifiques pour spc r. Les amorces sont utilisés pour la PCR sur colonie pour dépister les perturbations gtfC.
      6. Perturbation
    6. des amorces de conception pour la vérification de gtfC.
      Remarque : Les produits PCR amplifiés à l’aide de ces amorces chevauchent la frontière entre gtfC ou spc r et en amont ou en aval des régions flanquantes du gtfC. Amorces ' gtfC haut-vers l’avant et gtfC haut-inverse ' et ' gtfC vers le bas en avant et gtfC bas-reverse ' sont spécifiques pour gtfC, et ' gtfC haut-vers l’avant et spc r 2 -inverse ' et ' spc r 2-vers l’avant et gtfC bas-reverse ' sont spécifiques pour la spc, r.

2. L’Extraction d’ADN génomique de S. mutans

  1. stock Streak S. mutan s UA159 sur une gélose au cerveau coeur infusion (BHI). Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.
  2. Ramasser une seule colonie à l’aide d’un cure-dents stérilisé et il inoculer dans 5 mL de bouillon BHI. Incuber la culture de s S. mutan pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.
  3. Centrifugeuse la culture de cellules bactériennes pendant 15 min à 2 000 × g. Resuspendre le culot dans 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  4. Centrifuger pendant 15 min à 2 000 × g. Resuspendre le culot dans 200 µL de PBS.
  5. Extrait l’ADN génomique de la suspension à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique perle-battement-base conformément aux instructions fournies par le fabricant.
    1. Transfert la suspension d’un échantillon de 2,0 mL tube contenant des billes de verre (inclus dans le kit). Ajouter 750 µL de solution de lyse (incluse dans le kit) pour obtenir la suspension cellulaire.
    2. Boucher hermétiquement et placer les tubes symétriquement dans le porte-tube de l’appareil de perturbation perle-battant. Processus à la vitesse maximale pendant 5 min. Échantillons de Centrifuger la perle-battu PDT 1 min à 10 000 × g. transférer le liquide surnageant au filtre essorage (inclus dans le kit) dans un tube de prélèvement de 2,0 mL et centrifuger pendant 1 min à 7 000 × g .
      3. Tampon
    3. Ajouter 1 200 µL de fixation à l’ADN (inclus dans le kit) au filtrat. Transférer 800 µL du mélange de la colonne (inclus dans le kit) dans un tube de prélèvement de 2,0 mL et centrifuger pendant 1 min à 10 000 × g.
    4. Jeter le cheminement, ajouter 200 µL de tampon de prélavage (inclus dans le kit) à la colonne de la matrice colonne de lavage et centrifuger pendant 1 min à 10 000 × g. jeter le cheminement, ajouter 500 µL de tampon de lavage (inclus dans le kit) à l’essorage colonne de la matrice colonne de lavage, centrifuger pendant 1 min à 10 000 × g.
    5. Placer la colonne dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL et ajouter 100 µL de tampon d’élution (inclus dans le kit) à la matrice colonne.
    6. Centrifuger pendant 30 s à 10 000 × g pour éluer l’ADN génomique. Estimer la concentration d’ADN et de la pureté en mesurant l’absorbance à 260 nm et 280 nmusing un spectrophotomètre et confirmer que le A/a 260 280 ratio est supérieur à 1,8.

3. L’Amplification par PCR

  1. effectuer le 1 st PCR avec le génome de S. mutan s WT et le gène synthétique spc r en tant que modèles PCR (voir tableau 1). Amplifier la région accompagnement en amont du gène gtfC, dans la région de flanquement en aval du gène gtfC et le gène de la spc r en utilisant les trois ensembles d’amorces décrites ci-dessus ( Figure 1 a), comme par Tableau 2 et tableau 3.
    NOTE : Amorces PCR, réactifs et cycles d’amplification sont résumées dans le tableau 1, tableau 2 et tableau 3, respectivement.
  2. Fractionner chaque produit PCR sur un gel d’agarose à 1 % et les bandes correspondants à l’aide d’un cutter de bande de gel de l’accise.
  3. Purifier chaque produit d’ADN amplifié de gels à l’aide d’un kit d’extraction de gel à base de membranes à colonne et silice spin.
    1. Transfert les tranches de gel à une micro-centrifugeuse propre tube et mélangent avec 500 µL de tampon (inclus dans le kit) de liaison. Incuber le mélange à 55 ° C pendant 15 min jusqu'à ce que les tranches de gel sont complètement dissous.
    2. Placer la colonne à centrifuger (incluse dans le kit) dans un tube de prélèvement (inclus dans le kit), charger l’échantillon sur la colonne et centrifuger pendant 30 s à 11 000 × g. Jeter le cheminement, les 600 µL de tampon de lavage (inclus dans le kit) s’ajoute la colonne Spin pour laver la membrane de la silice et centrifuger pendant 30 s à 11 000 × g.
    3. Jeter le cheminement et centrifuger pendant 2 min à 11 000 × g pour sécher la membrane silice.
    4. Placer la colonne dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 50 µL de tampon d’élution (inclus dans le kit) et incuber à température ambiante pendant 2 min.
    5. Centrifuger pendant 2 min à 11 000 × g pour éluer l’ADN amplifié. Estimer la concentration d’ADN et de la pureté en mesurant l’absorbance à 260 nm et 280 nmusing un spectrophotomètre et confirmer que le A/a 260 280 ratio est supérieur à 1,8.
  4. Effectuer le 2 nd PCR de la fusion de 2 étapes PCR à l’aide de trois fragments approximativement équimolaires en tant que modèles PCR, selon les tableau 2 < /stRong > et le tableau 3.
    Remarque : Ces fragments ont été amplifiés et raccordé en utilisant les amorces imbriquées ' N_up-forward et reverse-N_down ' ou les amorces ultrapériphériques ' up-marche avant et en bas-arrière ' ( Figure 1 b). Des amorces PCR, réactifs et cycles d’amplification sont résumées dans le tableau 1, tableau 2 et tableau 3, respectivement.
  5. Charger un dixième du mélange réactionnel PCR (5 µL) sur un gel d’agarose 0,8 % et de comparer la taille de bande amplifié avec la taille de bande attendue pour confirmer la génération de l’amplicon approprié ( Figure 1).
  6. Concentrer le produit final restant de PCR par précipitation à l’éthanol sans purification.
    1. Ajouter 55 µL d’ultra purs pour le reste du mélange PCR pour ajuster le volume total à 100 µL.Add un dixième le volume d’eau 3M d’acétate de sodium (10 µL), pH 5,2, suivie par 2,5 volumes d’éthanol à 100 % (250 µL). Mélanger et geler pendant 30 min à -80 ° C.
    2. Centrifugeuse pendant 20 min à 15 000 × g à 4 ° C, vérifier le culot sur le fond du tube et jeter le surnageant. Laver le culot avec 1 mL d’éthanol à 70 %, centrifuger pendant 5 min à 15 000 × g à 4 ° C et éliminer le surnageant. Sécher le culot pendant environ 30 min et se dissolvent à 10 µL d’eau ultra pure.

4. Préparation de cellules compétentes et des transformations cellulaires

  1. stock Streak S. mutan s UA159 sur une gélose BHI. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.
  2. Ramasser une seule colonie à l’aide d’un cure-dents stérilisé et il inoculer dans 5 mL de bouillon BHI. Incuber la culture de s S. mutan pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.
  3. Transférer 2 mL de la culture de s s. mutan à 50 mL de bouillon BHI et incuber pendant 6 à 8 heures à 37 ° C, à une densité optique à 600 nm (OD 600) de 0,2 à 0,4 en anaérobiose.
  4. Centrifuger les cellules à 2 000 × g à 4 ° C pendant 15 minutes, éliminer le surnageant et laver les cellules deux fois avec 40 mL d’eau glacée, puis 40 mL de glycérol à 10 %.
    NOTE : Des substances résiduelles affectent électroporation ultérieure.
  5. Aspirer le surnageant soigneusement avec une pipette Pasteur comme l’adhérence du culot dans 10 % de glycérol est réduite. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de frais 10 % de glycérol, administrer 50 µL de la suspension dans chaque tube de microtubes de 1,5 mL et stocker à-80 ° C jusqu'à ce que juste avant l’utilisation.
  6. Mélanger l’aliquote de 50 µL de cellules compétentes glacées 5 µl de la construction de la perturbation décrite ci-dessus à la section 3. Ajouter le mélange à cuvettes d’électroporation (avec une distance de 0,2 cm entre les électrodes). Employer le mode de Staphylococcus aureus (1.8 kV, Ω 600, 10 µF 1 impulsion) de l’appareil d’électroporation à electroporate.
  7. Suspendre les cellules de 500 µL de bouillon BHI immédiatement après l’électroporation et ajouter 50 µL de la suspension à la spectinomycine contenant des plaques de gélose BHI.
    Remarque : L’incubation Extra time après que électroporation n’est pas nécessaire. Toutefois, une incubation de 1 à 2 h après électroporation peut améliorer l’efficacité de la transformation.
  8. Incuber la plaque pendant 2 à 6 jours à 37 ° C en anaérobiose.
    Remarque : S. mutans Δ gtfB est construit tel que décrit ci-dessus. Toute la région codante du gène gtfB est remplacée avec le gène de résistance érythromycine 8 dans S. mutans Δ gtfB. Chaque souche de S. mutans est cultivé dans le bouillon BHI à 37 ° C en anaérobiose.

5. Vérification de la perturbation de Gene et stockage

  1. prélever des colonies au hasard et leur inoculer dans le mélange PCR pour effectuer la colonie PCR selon le tableau 2 et tableau 3. Des amorces PCR, réactifs et cycles d’amplification sont résumées dans le tableau 1, tableau 2 et tableau 3, respectivement.
  2. Charger le mélange de réaction PCR sur un gel d’agarose à 1 % pour confirmer la spc r-bande d’ADN spécifique.
  3. Choisir la colonie positive à l’aide d’un cure-dents stérilisé et cellules de sous-culture dans 10 mL BHI spectinomycine contenant du bouillon pendant 2 jours à 37 ° C dans des conditions anaérobies.
  4. Vérifier la génération de S. mutans Δ gtfC.
    1. Divisent la suspension cellulaire également. Extraire l’ADN génomique des cellules décrites ci-dessus (étapes 2.3. à 2.5.5.). Effectuer l’ACP avec l’ADN génomique modèle PCR, utilisant les amorces pour la vérification d’une perturbation gtfC (tableau 1) selon le tableau 2 et tableau 3.
      Remarque : Les amorces PCR, réactifs et cycles d’amplification sont résumées dans le tableau 1, tableau 2 et tableau 3, respectivement.
    2. Le mélange de la PCR sur un gel d’agarose de 2 % de la charge et comparez la taille de bande amplifié avec la taille de bande attendue pour confirmer la génération de l’amplicon approprié .
    3. Centrifuger la suspension cellulaire reste à 2 000 x g pendant 15 minutes à 4 ° C. Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS.
    4. Centrifuger pendant 15 min à 2 000 × g à 4 ° C. remettre en suspension les cellules pellet dans 1,5 mL de bouillon BHI contenant 25 % de glycérol et stocker à-80 ° Cor -20 ° C.

6. L’analyse phénotypique

  1. Streak chaque souche de s S. mutan sur une gélose BHI. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.
  2. Ramasser une seule colonie à l’aide d’un cure-dents stérilisé et il inoculer dans 2 mL de bouillon BHI avec ou sans un antibiotique approprié. Incuber une nuit à 37 ° C en anaérobiose.
  3. Ensemencer 20 µL de la suspension bactérienne pendant la nuit dans 2 mL de bouillon BHI contenant 1 % ou 5 % de saccharose sans antibiotiques dans un tube de verre ; culture de cellules avec le tube à essai dans une position inclinée pendant une nuit à 37 ° C en anaérobiose.
  4. Vortex le verre des tubes à essai pendant 10 s et décanter les suspensions de la culture. Laver les tubes à essai trois fois avec de l’eau distillée. Ajouter 1 mL de 0,25 % Coomassie brillant blue (CBB) pour colorer les biofilms sur la paroi du tube et puis incuber pendant 1 min.
  5. Décanter la solution colorante, laver les tubes à essai trois fois avec de l’eau distillée et sécher les tubes à essai.
  6. Évaluer aussi bien la densité de couleur et extension du CBB teinté-biofilm visuellement pour déterminer la capacité de formation de biofilm dans une analyse phénotypique.

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Résultats

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La figure 2 montre que la taille de chaque produit du 1st PCR, tel qu’observé sur le gel d’agarose à 1 %, est en bon accord avec la taille estimée d’environ 1 kb. La figure 3 montre l’analyse par électrophorèse sur gel des produits de la 2ème PCR. La figure 4 montre des colonies de S. mutans transformés avec la construction de la perturbation et une analyse de l’électro...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans le présent protocole, les amorces pour le 1st PCR doivent être conçus pour amplifier environ 1 Ko en amont et en aval des régions flanquantes de la région cible dans le génome. De telles séquences flanquantes longtemps sont nécessaires pour améliorer l’efficacité de la recombinaison homologue.

Les séquences des amorces (haut-inverse, vers le bas en avant, spc,r-avance et spcr-inverse) dans le présent protocole ont été déterminées automati...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la société japonaise pour la Promotion de la Science [Grant Numbers 16 K 15860 à T.M. et 15 K 15777 à N.H.].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Streptococus mutansStock en laboratoire.Souche de type sauvage (souche UA159)
Kit d’extraction d’ADN génomiqueZymo ResearchD6005
Appareil de perturbation des billesTaitecGM-01
Gènes synthétiquesEurofins Genomicsspectinomycine et à l’érythromycinecommandé sur mesure
ThermocycleurAstecPC-708
Amorces PCREurofins GenomicsCommande sur mesure35 bases d’ADN
polyméraseTakaraR045AADN polymérase haute fidélité
Kit d’extraction de gelNippon GeneticsFG-91202Extraction d’ADN à partir de gel d’agarose
Coupe-bande de gelNippon GeneticsFG-830
SpectrophotomètreBeckman CoulterDU 800
ÉlectroporateurBio-rad1652100
Cuvette d’électroporationBio-rad1652086espace de 0,2 cm
AnaeropackMitsubishi Gas ChemicalA-03Système de culture anaérobie
Cerveau cœur infusion bouillonBecton, Dickinson237500Milieux de culture bactérienne
SpectinomycineWako195-11531Antibiotiques
ÉrythromycineWako057-07151Antibiotiques
SaccharoseWako196-00015Pour le développement du biofilm
CBB R-250Wako031-17922Pour la coloration du biofilm
Gène de résistance à la

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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