In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse

Summary

Nous présentons des méthodes pour évaluer la capacité phagocytaire des primaires macrophages dérivés de la moelle osseuse murines utilisant des débris de la myéline fluorescent étiquetés et coloration de gouttelettes de lipides intracellulaires.

Abstract

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont des leucocytes matures qui servent un rôle physiologique essentiel comme les phagocytes professionnels capable d’effacer une variété de particules. Normalement, les BMDMs sont restreints de système nerveux central (CNS), mais suite à une blessure, ils peuvent facilement s’infiltrer. Une fois dans le tissu lésé de CNS, BMDMs sont le type de cellules primaires responsable de l’apurement des débris cellulaires dérivées de blessures, y compris de grandes quantités de débris de myéline riche de lipides. Les ramifications neuropathologiques de l’infiltration et la myéline phagocytose de débris BMDM dans le système nerveux central sont complexes et pas bien compris. Les protocoles décrits ici, permettent l’étude directe in vitro de BMDMs dans le contexte des blessures de la CNS. Nous couvrons murin BMDM isolement et culture, préparation de débris de la myéline et tests pour évaluer la phagocytose de débris BMDM la myéline. Ces techniques produisent des résultats quantifiables robustes sans le besoin d’équipement spécialisé significatif ou matériaux, mais peuvent être facilement personnalisés pour répondre aux besoins des chercheurs.

Introduction

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont un lien important entre le système immunitaire inné et adaptatif. Comme antigène présentant des cellules (CPA), ils peuvent communiquer avec via les deux présentation de l’antigène, les lymphocytes et cytokine release^1,2,3. Cependant, comme les phagocytes professionnels, leur fonction principale est de clairement pathogènes, cellules âgées et les débris cellulaires^1,4. Suite à une blessure de la moelle épinière (SCI), des quantités considérables de débris de la....

Protocol

Les méthodes décrites ici et à l’article 2 ont été approuvés par la Florida State University institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) et suit les lignes directrices énoncées dans le Guide du pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire, 8^ème édition . Tous les animaux utilisés dans le présent dans le présent protocole sont maison dans une animalerie de laboratoire dédié jusqu'à utilisation. Aucune expérimentation in vivo a été réalisé avant de sacrifier. Nombre d’animaux axées sur les besoins expérimentaux utilisant la moyenne des cellules et des collections de la myéline comme guide afin de minimiser la consomma....

Results

Traitement des BMDMs avec CFSE étiqueté les débris de la myéline devrait produire une internalisation claire (Figure 2). Un temps de 3 heures interaction est suffisant pour BMDMs à phagocyter assez débris de myéline supplémentaire pour la détection en aval robuste, accumulation intracellulaire peut être observée avec aussi peu que 1 heure d’interaction. Cependant, quelques débris de la myéline peut toujours être présent à la surface des cellules après le lavage. Ceci peut être dû lavage insu.......

Discussion

Les procédures décrites ici utilisent des fraîchement isolées débris de myéline CNS brut ou les macrophages primaires de moelle osseuse. Pour réduire les dépenses de l’animales, il est recommandé que les deux cerveaux et les cellules de la moelle osseuse être cueillie dans chacune des souris au moment du sacrifice. Deux chercheurs travaillant ensemble peuvent préparer ces deux matériaux en même temps. Alternativement, les cerveaux peut être stockées à-80 ° C dans du PBS additionné d’antibiotiques avant l’isolement de déb.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01	Glycémie élevée avec L-glutamine, pyruvate de sodium
Pénicilline-Streptomycine Solution	Corning	30-002-CI	100X
Solution Sérum de veau nouveau-né (NCS)	Rocky Mountain Biologics	NBS-BBT-5XM États-Unis
Origine NCTC clone 929 [Cellule L, L-929, dérivé de la souche L]  ;	ATCC	CCL-1	L929 Lignée cellulaire de préparation de milieux conditionnés Plaques
de culture cellulaire à 24 puits	VWR	10062-896  ;
Plat de culture cellulaire	Greiner Bio-One	639960	Polystyrine, 145/20mm
CFSE Kit de prolifération cellulaire	Thermo Fisher	C34570	DMSO pour la constitution
Fluoro-gel fourni avec tampon Tris  ;	Microscopie électronique Sciences	17985-11
Huile Rouge O	Sigma Aldrich	O0625
Matériaux	Company	Numéro de catalogue	Comments
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823	Thinwall, polypropylène, 38,5 ml, 25 x 89 mm
SW 32 Ti Rotor ultracentrifuge	Beckman Coulter	369650	SW 32 Ti Rotor, godet oscillant,
homogénéisateur rotatif portatif	Fisher Science	08-451-71