In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse

Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont un lien important entre le système immunitaire inné et adaptatif. Comme antigène présentant des cellules (CPA), ils peuvent communiquer avec via les deux présentation de l’antigène, les lymphocytes et cytokine release^1,2,3. Cependant, comme les phagocytes professionnels, leur fonction principale est de clairement pathogènes, cellules âgées et les débris cellulaires^1,4. Suite à une blessure de la moelle épinière (SCI), des quantités considérables de débris de la myéline est généré à partir des oligodendrocytes mourants, le type de cellule responsable de la CNS axon myélinisation⁵. Nous et autres avons montré que dégagement des débris de la myéline est avant tout la responsabilité d’infiltration de BMDMs^5,6,7. Toutefois, au sein de la moelle épinière engouffrement de sites des débris de la myéline a été suggéré de transférer ces cellules normalement anti-inflammatoires vers un état pro-inflammatoire^5,8,9. Comme des médiateurs clés de la neuro-inflammation de la moelle épinière lésée, BMDMs sont des objectifs cliniques importants.

Afin d’étudier l’influence de BMDMs dans la moelle épinière lésée, nous avons développé un modèle in vitro pour étudier directement comment BMDMs répondre aux débris de la myéline. Afin d’améliorer la pertinence biologique, tant primaires BMDMs murins et les débris de la myéline fraîchement isolées sont utilisées dans ces enquêtes. Par conséquent, les méthodes présentées ici également détaillent l’isolement et la culture de BMDMs murins primaires et une technique de dégradé mis à jour le saccharose utilisée pour isoler les CNS murin dérivé myéline débris^10,11,12. Débris de la myéline peut porter facilement avec un colorant fluorescent, carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE), pour suivre que son internalisation par CFSE BMDMs. est bien adaptée pour cette application, car il est non cytotoxiques et son permis étroit spectre de fluorescence multiplexage avec autre fluorescent sondes^13,14. Après la phagocytose, la myéline débris lipides sont transportés à travers les lysosomes et empaquetées comme les lipides neutres dans les gouttelettes de lipides intracellulaires⁵. Afin de quantifier cette accumulation de lipides intracellulaires, nous présentons un O huile de rouge (ORO) coloration méthode optimisée pour l’analyse quantitative d’image. Cette méthode de coloration simple produit des résultats reproductibles robustes et¹⁵de la quantification. Ces méthodes facilitent l’étude de la myéline débris phagocytose et lipides rétention de matériel spécialisé limitée.

Les méthodes décrites ici et à l’article 2 ont été approuvés par la Florida State University institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) et suit les lignes directrices énoncées dans le Guide du pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire, 8^ème édition . Tous les animaux utilisés dans le présent dans le présent protocole sont maison dans une animalerie de laboratoire dédié jusqu'à utilisation. Aucune expérimentation in vivo a été réalisé avant de sacrifier. Nombre d’animaux axées sur les besoins expérimentaux utilisant la moyenne des cellules et des collections de la myéline comme guide afin de minimiser la consommation.

Remarque : Ce protocole décrit la génération des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) (Section 1), la préparation des débris de myéline d’encéphales fluorescent étiquetés (Section 2), la procédure générale pour analyser la phagocytose de débris de la myéline (Section 3), et procédure générale d’analyse de l’accumulation de lipides débris de myéline (Section 4). Préparation du réactif, cellule récolte et manipulation, collection de la myéline et étiquetage et performances du test devraient être achevés dans un flux d’air laminaire biosafety armoire.

1. génération des Macrophages primaires de moelle osseuse

1. Préparation du milieu de culture de macrophage complet (CMCM)
   Remarque : génération de macrophages de la moelle osseuse nécessite l’utilisation d’and macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). Cette préparation utilise L929 médias de fibroblastes murins conditionné comme source de M-CSF.
   1. Générer des médias des fibroblastes murins conditionné L929 par culture de cellules dans les plats de 145 mm avec 50 mL de forte concentration de glucose (4 500 mg/L, L-glucose) Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de sérum de veau né le nouveau 5 % (NCS) et pénicilline/streptomycine pendant 7 jours.
   2. Recueillir des médias provenant de cultures dans des tubes à centrifuger coniques 50 mL et centrifuger pendant 30 minutes à 3500 x g, 4 ° C.
   3. Filtrer les surnageants sur un filtre de seringue 0,2 µm dans un tube à centrifuger conique 50 mL nouveau. Milieux conditionnés peut être stockées à-80 ° C pendant 6 mois.
   4. À forte concentration de glucose DMEM, ajouter 5 % vol/vol NCS, 15 % vol/vol L929 fibroblastes murins conditionné DMEM et 1 % la pénicilline/streptomycine. Médias peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 à 3 mois. Chaud à 37 ° C avant utilisation.
2. Collection de cellules de moelle primaire et induction macrophage
   Remarque : L’utilisation de cette un souris protocole générera environ 20 millions macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs).
   1. Euthanasier le nombre désiré de 8 à 10 semaine vieilles souris en utilisant les directives standard CO₂ asphyxie suivies par dislocation cervicale.
   2. Désinfectez l’animal à l’aide de 70 % (vol/vol) éthanol : H₂O, saturant la fourrure.
   3. Coupez une petite ouverture dans l’abdomen et tirez délicatement la peau pour révéler les tissus sous-jacents. Prenez soin de ne pas perforer la cavité péritonéale.
   4. Enlever les deux pattes arrière à partir de la hanche et se terminant à la cheville. Place les tissus prélevés dans un 100 mm boîte de Pétri contenant du phosphate stérile 5-10 mL solution saline tamponnée (PBS) additionnée de 1 % la pénicilline/streptomycine.
      Remarque : Lorsque plusieurs animaux de traitement Assurez-vous garder la vaisselle sur la glace pour limiter la dégradation des tissus.
   5. Retirer les muscles et du tissu conjonctif de l’os à l’aide d’un scalpel. Seulement le fémur et le tibia sont utilisés pour le prélèvement de cellules, le péroné peut être mis au rebut.
   6. Exposer la cavité de la moelle des os prélevés en taillant une petite section de chaque extrémité avec un scalpel.
   7. À l’aide d’une aiguille 25g, rincer les cavités de la moelle osseuse avec CMCM dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Les os apparaîtront blancs une fois qu’ils ont été suffisamment rincées.
   8. Une fois que la collection soit effectuée, agiter ponction avec une aiguille 18g pour 30-90 s à généré une suspension monocellulaire.
      Remarque : Une étape de lyse facultatif des globules rouges (RBC) peut être effectuée à ce stade. Récemment, il a été suggéré que la teneur en fer intracellulaire peut influencer les effets des débris de la myéline à macrophage polarisation¹⁶. Pour plus d’informations au sujet de l’inclusion d’une étape de lyse RBC veux parler Trouplin et al. ¹⁷.
   9. Filtrer la suspension à travers un tamis de cellule stérile 70 µm dans un nouveau tube à centrifuger conique 50 mL.
   10. Graines prélevées des cellules uniformément dans les récipients de culture de cellules de 145 mm contenant 15 à 20 mL CMCM. Utilisez environ trois récipients de culture par souris sacrifiées. Incuber les cultures à 37 ° C, 5 % de CO₂.
   11. Après 72 heures laver les plaques une fois avec du PBS stérile pour enlever les cellules non adhérentes, puis ajouter 15 à 20mL CMCM fraîche. Incuber les cultures pour une période supplémentaire de 4 jours à 37 ° C, 5 % de CO₂. Après 7 jours de culture totale, les cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse isolées au départ sera matures BMDMs (Figure 1).

2. génération de débris fluorescent étiquetés encéphales myéline

Remarque : Tous les réactifs peuvent être stockés à 4 ° C pendant environ 1 mois.

1. Préparation des réactifs de la myéline débris collection
   1. Préparer Tris· Solution tampon de cl.
      1. Pour 800mL distillée désionisée H₂O (ddiH₂O) ajouter 20 mL de 1 M Tris· CL, pH 7,45 (concentration finale de 20 mM) et 20 mL de 100 mM Na₂EDTA (concentration finale de 2 mM).
      2. Ajuster le pH à 7,45. Régler le volume à 1 000 mL avec de le ddiH₂solution O. filtre à travers une unité de filtration 0,2 µm.
   2. Préparer une solution de saccharose 1 M.
      1. Dans 100 mL de Tris· CL solution tampon, ajouter 68,46 g de saccharose. Régler le volume à 200 mL avec Tris· Solution tampon de cl. Filtrer la solution à travers une unité de filtration de 0,2 µm.
   3. Préparer 200 mL de solution de saccharose de 0,32 M en diluant la solution 1 M avec la Tris· CL 0.83:0.16 de solution tampon (vol/vol).
   4. Préparer 150 mL de solution de saccharose de 0,83 M en diluant la solution 1 M avec la Tris· CL 0.83:0.16 de solution tampon (vol/vol).
2. Collecte des débris de la myéline brut encéphales
   Remarque : La méthode de collection décrite ici est pour l’isolement des débris de la myéline brut.
   1. Euthanasier 10-12 souris 8-10 semaines d’âge à l’aide de directives standard CO₂ asphyxie suivies par dislocation cervicale.
   2. Disséquer les cerveaux et les placer dans un plat de 100 mm contenant 10 mL de solution de saccharose de 0,32 M.

3. la myéline débris phagocytose Assay

Remarque : Voici la méthode de base pour l’observation de phagocytose des débris de la myéline fluorescent étiquetés. Ajout d’autres traitements et conditions expérimentales devra être optimisé par l’enquêteur.

1. Préparation des plaques de traitement
   1. Pour chaque plaque 145 mm, recueillir des matures BMDMs dans un tube à centrifuger conique 15 mL à l’aide de 5 à 6 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 10 mM dans une solution saline de Dulbecco tamponnée au phosphate (SPD) (pH 7,4).
      Remarque : Ne pas utiliser la trypsine car il peut modifier l’état d’activation des cellules¹⁸.
   2. Ajouter un volume égal de CMCM préchauffé dans chaque tube de cellules recueillies.
   3. Centrifuger à 180 x g pendant 8 min à 20 ° C. Jeter le surnageant.
   4. Remettre en suspension les cellules CMCM et comte.
   5. Ajouter à chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits, 1 x 10⁵ cellules dans 1 mL de la CMCM.
   6. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
2. Analyse et traitement de débris de la myéline
   1. Ajouter 10 µL de 100 mg/mL CFSE étiqueté les débris de la myéline dans chaque cupule (concentration finale de 1 mg/mL).
   2. Incuber pendant 1 à 3 heures à 37 ° C, 5 % de CO₂.
   3. Laver la plaque 3 fois avec du PBS stérile pour enlever les débris de la myéline non englouti.
   4. Ajouter 400 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.
   5. Laver la plaque 2 fois avec du PBS stérile.
   6. Ajouter 400 µL de solution de Hoechst 33258 dans chaque puits. Incuber pendant 5 min à l’abri de la lumière de RT.
   7. Laver les plaques 2 fois avec du PBS stérile.
   8. Ajouter 200 µL de Fluoro-gel avec tampon Tris dans chaque puits pour réduire le photoblanchiment.
   9. Cellules d’image à l’aide d’un microscope inversé à epi-fluorescente capable.
      Remarque : Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de CFSE sont 494 nm et 521 nm, respectivement.
   10. Divisez le nombre de cellules positives CFSE par le nombre de noyaux afin de déterminer l’absorption relative de la myéline débris.
   11. Avant l’imagerie, maintiennent les plateaux jusqu'à 7 jours à 4 ° C, abri de la lumière.

4. quantification des lipides intracellulaires par une coloration rouge-O huile

Remarque : Voici la méthode de base pour l’observation des lipides intracellulaires de la myéline-débris-dérivé.L’utilisation de CFSE étiqueté les débris de la myéline n’est pas recommandée pour quantification fluorescente de ORO coloration en raison du chevauchement spectrale. Ajout d’autres traitements et conditions expérimentales devra être optimisé par l’enquêteur.

1. Préparation de solutions de coloration
   1. Préparer la solution colorante de 0,5 % huile rouge-O (ORO).
      1. Ajouter lentement 100 mL de 100 % propylène glycol (1, 2-Propanediol) à 0,5 g d’ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) tout en remuant.
      2. Chauffer la solution à 95 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que toutes les grosses particules sont dissolvent.
         NOTE: ne pas chauffer à plus de 100 ° C.
      3. Filtrer la solution à travers un morceau de papier filtre quand elles sont encore tièdes dans un nouveau conteneur.
      4. Laisser la solution refroidir jusqu’au lendemain à RT. Solution peut être conservée pendant 1 an à température ambiante.
   2. Préparer la solution de propylène glycol 85 %.
      1. Ajouter 85 mL de 100 % propylène glycol dans 15 mL de ddiH₂O. remuer jusqu'à ce que le mélange. Solution peut être conservée pendant 1 an à température ambiante.
2. Préparation des plaques de traitement
   1. Préparer une plaque 24 puits suivant la méthode décrite à la Section 3.
   2. Incuber à 37 ° C, 5 % de CO₂ pendant 24 h.
3. Traitement de débris de la myéline
   1. Ajouter 10 µL de débris de myéline de 100 mg/mL dans chaque cupule (concentration finale de 1 mg/mL).
   2. Incuber pendant 1-3 h à 37 ° C, 5 % de CO₂.
   3. Laver la plaque 3 fois avec du PBS stérile pour enlever les débris non digérés de la myéline.
      Remarque : À ce stade, plaques peuvent subir la fixation immédiate ou CMCM frais peut être ajouté et cellules retournées pour une incubation de points dans le temps additionnel.
   4. Ajouter 400 µL de paraformaldéhyde à 4 % dans chaque puits. Incuber 30 min à température ambiante.
   5. Laver la plaque 2 fois avec stérile PBS puis rencontrée aux taches.
4. Coloration de ORO et analyse
   1. Laver la plaque fixe 3 fois avec ddiH₂O.
   2. Ajouter 400 µL de 100 % propylène glycol dans chaque puits et incuber pendant 5 min à température ambiante.
      NOTE: cela va réduire les reports de ddiH₂O.
   3. Aspirer le propylène glycol et ajouter 400 µL de solution ORO dans chaque puits.
   4. Incuber pendant 8 min à 60 ° C.
   5. Aspirer la solution ORO. Ensuite, ajouter 400 µL de 85 % de propylène glycol dans chaque puits et incuber pendant 5 minumintes à température ambiante.
   6. Laver la plaque 3 fois avec ddiH₂O.
   7. Ajouter 400 µL de solution de Hoechst 33258 dans chaque puits. Incuber 5 min à ta, abri de la lumière.
   8. Laver les plaques 2 fois avec du PBS stérile.
   9. Ajouter 200 µL de Fluoro-gel avec tampon Tris dans chaque puits.
   10. Cellules d’image à l’aide d’un microscope inversé à epi-fluorescente capable. ORO peut être photographiée à l’aide d’un ensemble standard de filtre Texas Red ou DsRed.
   11. Quantifier la rétention relative de lipides en déterminant la zone positive de ORO dans chaque champ de l’image et en divisant par le nombre de noyaux.
   12. Maintenir les plaques pendant 7 jours à 4 ° C abri de la lumière.

Traitement des BMDMs avec CFSE étiqueté les débris de la myéline devrait produire une internalisation claire (Figure 2). Un temps de 3 heures interaction est suffisant pour BMDMs à phagocyter assez débris de myéline supplémentaire pour la détection en aval robuste, accumulation intracellulaire peut être observée avec aussi peu que 1 heure d’interaction. Cependant, quelques débris de la myéline peut toujours être présent à la surface des cellules après le lavage. Ceci peut être dû lavage insuffisant, ou n’étant ne pas pleinement intégrés durant les premiers stades de la phagocytose de particules.

Tandis que BMDMs peut rapidement assimiler les débris de la myéline, traitement lysosomale est nécessaire avant la forme de gouttelettes lipidiques colorables ORO. Pour démontrer, BMDMs ont été incubées avec des débris de la myéline pendant 90 minutes, lavés et mis en culture pour des montants supplémentaires avant la fixation et coloration (Figure 3). La figure 4 montre qu'il y a un délai entre le début du traitement et l’aspect de lipides neutres. Il est à noter également que la rétention de lipides n’est pas stable au cours de la culture. BMDMs commencera à métaboliser les lipides accumulés peu après la formation de gouttelettes. À ce titre, nous recommandons d’attente ne dépasse pas les 24 heures entre les débris loin non englouti la myéline de lavage et de la fixation.

Quantification de ORO teinté zone montre le taux de métabolisme lipidique de la myéline dans BMDMs (Figure 5). Après une période d’interaction de 90 minutes, les cellules ont été retournés à incubation dans le CMCM fraîche. Au cours de la période de chasse au début dans un milieu frais, les BMDMs métabolisent le composant lipidique de myéline phagocytés débris dans les lipides colorables ORO neutres. Une augmentation constante de la zone positive de ORO est typique dans les heures qui suivent l’interaction. Après 24 heures, les BMDMs auront est ou métabolisé une partie importante des lipides intracellulaires.

Figure 1 : Représentant BMDM Cultures. Quelques cellules adhérentes seront initialement observées. Le jour 3, toutes les cellules non adhérentes sont supprimés. Jour 7, matures macrophages dérivés de la moelle osseuse sont observées. Scale = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dosage des Images représentant des débris de la myéline BMDM phagocytose. Les cellules ont été traitées avec 1mg/mL CFSE étiqueté les débris de la myéline pendant 1 heure avant le lavage et la fixation avec 4 % PFA. Débris de myéline intériorisée peut être visualisée à l’aide de jeux de filtres standard GFP sur un microscope capable de l’épi-fluorescence. Scale = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Diagramme de conception expérimentale de l’huile rouge O (ORO). BMDM sont traités avec des débris de la myéline de 1mg/mL (dilution 1 : 100) pendant 90 minutes, suivie de lavage et de la culture dans un milieu frais avant la fixation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : ORO coloration de BMDM suite à la myéline débris phagocytose. Après fixation avec 4 % PFA à temps-points indiqués, BMDMs ont été colorées avec ORO et Hoechst 33258. Des images représentatives pour chaque point de temps sont affichés. Scale = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse d’Image quantitative de ORO coloration. Pour la quantification d’ORO coloration, 3 puits ont été projetés à 20 X avec 5 images par puits. Tous les paramètres d’acquisition image étaient identiques. Barres d’erreur = SEM (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont aucune divulgation.