Nous présentons des méthodes pour évaluer la capacité phagocytaire des primaires macrophages dérivés de la moelle osseuse murines utilisant des débris de la myéline fluorescent étiquetés et coloration de gouttelettes de lipides intracellulaires.
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Article de méthode
In Vitro Phagocytose des débris de la myéline par les Macrophages dérivés de la moelle osseuse
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont des leucocytes matures qui servent un rôle physiologique essentiel comme les phagocytes professionnels capable d’effacer une variété de particules. Normalement, les BMDMs sont restreints de système nerveux central (CNS), mais suite à une blessure, ils peuvent facilement s’infiltrer. Une fois dans le tissu lésé de CNS, BMDMs sont le type de cellules primaires responsable de l’apurement des débris cellulaires dérivées de blessures, y compris de grandes quantités de débris de myéline riche de lipides. Les ramifications neuropathologiques de l’infiltration et la myéline phagocytose de débris BMDM dans le système nerveux central sont complexes et pas bien compris. Les protocoles décrits ici, permettent l’étude directe in vitro de BMDMs dans le contexte des blessures de la CNS. Nous couvrons murin BMDM isolement et culture, préparation de débris de la myéline et tests pour évaluer la phagocytose de débris BMDM la myéline. Ces techniques produisent des résultats quantifiables robustes sans le besoin d’équipement spécialisé significatif ou matériaux, mais peuvent être facilement personnalisés pour répondre aux besoins des chercheurs.
Introduction
Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) sont un lien important entre le système immunitaire inné et adaptatif. Comme antigène présentant des cellules (CPA), ils peuvent communiquer avec via les deux présentation de l’antigène, les lymphocytes et cytokine release1,2,3. Cependant, comme les phagocytes professionnels, leur fonction principale est de clairement pathogènes, cellules âgées et les débris cellulaires1,4. Suite à une blessure de la moelle épinière (SCI), des quantités considérables de débris de la....
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Protocole
Les méthodes décrites ici et à l’article 2 ont été approuvés par la Florida State University institutionnels animalier et utilisation Comité (IACUC) et suit les lignes directrices énoncées dans le Guide du pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire, 8ème édition . Tous les animaux utilisés dans le présent dans le présent protocole sont maison dans une animalerie de laboratoire dédié jusqu'à utilisation. Aucune expérimentation in vivo a été réalisé avant de sacrifier. Nombre d’animaux axées sur les besoins expérimentaux utilisant la moyenne des cellules et des collections de la myéline comme guide afin de minimiser la consomma....
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Résultats
Traitement des BMDMs avec CFSE étiqueté les débris de la myéline devrait produire une internalisation claire (Figure 2). Un temps de 3 heures interaction est suffisant pour BMDMs à phagocyter assez débris de myéline supplémentaire pour la détection en aval robuste, accumulation intracellulaire peut être observée avec aussi peu que 1 heure d’interaction. Cependant, quelques débris de la myéline peut toujours être présent à la surface des cellules après le lavage. Ceci peut être dû lavage insu.......
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Discussion
Les procédures décrites ici utilisent des fraîchement isolées débris de myéline CNS brut ou les macrophages primaires de moelle osseuse. Pour réduire les dépenses de l’animales, il est recommandé que les deux cerveaux et les cellules de la moelle osseuse être cueillie dans chacune des souris au moment du sacrifice. Deux chercheurs travaillant ensemble peuvent préparer ces deux matériaux en même temps. Alternativement, les cerveaux peut être stockées à-80 ° C dans du PBS additionné d’antibiotiques avant l’isolement de déb.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucune divulgation.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Glenn Sanger-Hodgson, spécialiste des médias à la faculté de médecine de l’ex-URSS pour tout son travail dans la production vidéo, l’édition et Voice-over.
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01GM100474 et R01GM072611).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | Glycémie élevée avec L-glutamine, pyruvate de sodium |
| Pénicilline-Streptomycine Solution | Corning | 30-002-CI | 100X |
| Solution Sérum de veau nouveau-né (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM États-Unis | |
| Origine NCTC clone 929 [Cellule L, L-929, dérivé de la souche L] ; | ATCC | CCL-1 | L929 Lignée cellulaire de préparation de milieux conditionnés Plaques |
| de culture cellulaire à 24 puits | VWR | 10062-896 ; | |
| Plat de culture cellulaire | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Kit de prolifération cellulaire | Thermo Fisher | C34570 | DMSO pour la constitution |
| Fluoro-gel fourni avec tampon Tris ; | Microscopie électronique Sciences | 17985-11 | |
| Huile Rouge O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Matériaux | Company | Numéro de catalogue | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, polypropylène, 38,5 ml, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Rotor ultracentrifuge | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, godet oscillant, |
| homogénéisateur rotatif portatif | Fisher Science | 08-451-71 |
Références
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M.
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Réimpressions et autorisations
