L’essai de Reconstitution organoïde (ORA) pour l’analyse fonctionnelle des souches intestinales et des cellules de Niche

Résumé

Les cultures organoïde intestinale sont établis de cryptes ensemble et ne permettent pas l’analyse de l’auto-renouvellement et différenciation de façon spécifique des cellules. Ce protocole décrit la reconstitution de tige triée (Lgr5⁺) et les cellules (Paneth), donnant lieu à organoïdes, tout en permettant leur préalable modifications biochimiques et génétiques et l’analyse fonctionnelle de niche.

Résumé

L’épithélium intestinal se caractérise par un taux de rotation extrêmement rapide. Chez les mammifères, le revêtement épithélial entière est renouvelé dans les 4-5 jours. Les cellules souches adultes intestinaux se trouvent au fond des cryptes de Lieberkühn, sont affectés par l’expression du gène Lgr5 et préserver l’homéostasie grâce à leur caractéristique fort taux proliférative¹. Tout au long de l’intestin grêle, Lgr5⁺ cellules souches s’entremêlent avec les cellules sécrétrices spécialisées appelées cellules de Paneth. Les cellules de Paneth sécrètent des composés antibactériens (c.-à-d., lysozyme et cryptdins/défensines) et exercent un rôle dominant sur la flore intestinale. Plus récemment, une nouvelle fonction a été découvert pour les cellules de Paneth, à savoir leur capacité à fournir un soutien de niche de cellules souches Lgr5⁺ à travers plusieurs ligands principaux au Wnt3, EGF et Dll1².

Lorsque isolés ex vivo et cultivées en présence de facteurs de croissance spécifiques et des constituants de la matrice extracellulaire, des cryptes intestinales ensemble donnent lieu à longue durée de vie et renouvellement des structures 3D appelé organoïdes qui ressemblent fortement à la crypte-villosités architecture épithéliale de l' intestin grêle adulte³. Organoïde cultures, lors de toute cryptes, permettent l’étude de l’auto-renouvellement et la différenciation de la niche de cellules souches intestinales, sans toutefois aborder la contribution de ses composants, à savoir le Lgr5⁺ et Cellules de Paneth.

Ici, les auteurs décrivent une nouvelle approche à l’analyse d’organoïde qui tire parti de la capacité de Paneth et des cellules de Lgr5⁺ pour associer et former les organoïdes lorsque conjointement mis en culture. Cette approche, ici dénommée « essai de reconstitution organoïde » (ORA), permet la modification génétique et biochimique de Paneth ou Lgr5⁺ des cellules souches, suivis de la reconstitution dans organoïdes. À ce titre, elle permet l’analyse fonctionnelle des deux principales composantes de la niche de cellules souches intestinales.

Introduction

L’épithélium intestinal est le tissu autorenouvellement plus rapidement dans l’organisme chez les mammifères et, à ce titre, a fait l’objet d’une pléthore d’études visant à l’identification et la caractérisation fonctionnelle des cellules souches adultes résidant au fond de la crypte de Lieberkühn, affectée par l’expression du gène Lgr5 et fonction canonique Wnt signaux¹. Notamment, Lgr5⁺ des cellules souches sont flanqués et pris en charge par des cellules spécialisées de créneau, c'est-à-dire des cellules de Paneth, qui dépendent aussi de signalisation Wnt pour leur maturation². Ensemble, ces deux types de cellules sous-tendent l’auto-renouvellement de la muqueuse épithéliale intestinale et préservation de l’équilibre homéostatique quotidienne : Lgr5⁺ cellules souches rapidement diviser et donner lieu à des progéniteurs et plus spécialisée intestinales épithéliales cellules ; Les cellules de Paneth fournissent des facteurs essentiels de niche (p. ex., Dll1, Wnt3, EGF) à Lgr5^{+ 2}les cellules souches. La capacité des cryptes intestinales lorsque plaqué ex vivo pour former des structures organisées et autorenouvellement appelée organoïdes, ou « mini-tripes », a été exploitée comme un outil expérimental pour donner un aperçu des processus tels que l’auto-renouvellement et différenciation dans des conditions normales et pathologiques, y compris le cancer⁴. Organoïde cultures ont été établis de plusieurs tissus, y compris l’intestin, le pancréas, le foie et le rein, à la fois des souris et des échantillons humains⁴. La méthode d’extraction et les facteurs de croissance employés pour développer ces cultures organoïde sont tissu-spécifique et conçues pour conduire la différenciation des lignées multiples et imiter autant que possible la niche de cellules souches original in vivo. Organoïdes peut avoir des applications potentielles, y compris le traitement des maladies génétiques, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique dans le cancer, l’analyse de la toxicité des médicaments ou l’étude de l’organogenèse in vitro⁵.

Dans l’ensemble, la principale limitation des cultures organoïde lorsque établies à partir d’échantillons de tissus est un manque de spécificité cellulaire. Par exemple, organoïdes intestinales, établis à partir des cryptes intestinales ensemble ne permettent pas l’analyse des différents composants cellulaires englobés dans la source de tissu (par exemple, contiennent des cryptes toute Lgr5⁺, Paneth, et cellules souches).

Nous décrivons ici une nouvelle méthode, dénommée ORA, qui combine les avantages des cultures organoïde intestinale avec l’analyse fonctionnelle de ses éléments plus fondamentaux, à savoir les souches (Lgr5⁺) et les cellules de la niche (Paneth). Ceci est réalisé grâce à la capacité unique de Paneth et des cellules pour associer physiquement à l’autre lorsque co incubés et donner lieu à organoïdes^2,6,10 Lgr5⁺ . Nous avons pris parti de cette fonctionnalité et prétraités individuellement les deux types cellulaires avant leur permettant de reconstituer organoïdes. Ce faisant, chaque composant de la cellule peut être exposé à n’importe quel médicament, facteur de croissance, inhibiteur biochimique, modification génétique ou traitement chimique avant reconstitution et organoïde formation. Par conséquent, essai sur les ORA permettra à la détermination de la question de savoir si un traitement médicamenteux spécifique ou la modification génétique a un effet spécifique sur les cellules souches ou leur homologue de niche.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées selon les directives et lois locales de bien-être animal.

1. préparation des Instruments, les milieux de Culture et plats

1. Ensemble d’autoclave 1 intestinale Ciseaux Ciseaux normaux et pinces dans un flacon stérile.
2. Placer un plat de 96 puits (fond plat) dans un incubateur à 37 ° C.
3. Préparer 10 mL de milieu de culture complet avec les réactifs énumérés dans la table des matières.
4. Incuber le milieu complet à 37 ° C dans un bain d’eau.
5. Décongelez les membrane plasmique basale reconstituée en le plaçant dans un seau à glace. La membrane plasmique basale reconstituée deviendra liquide à 4 ° C.
6. Remplissez 4 boîtes de Pétri avec une solution saline tamponnée au phosphate froide ou abrégé PBS (4 ° C).

2. isolement de petites cryptes intestinales

1. Sacrifier, par inhalation de CO₂ , une Lgr5- eGFP-IRES-CreER^t2 souris sur fond C57BL6/J. Disséquer le péritoine longitudinalement avec une paire de ciseaux.
2. Tenir l’estomac avec la pince et couper transversalement en deux.
3. En utilisant les ciseaux intestinales par la suite, retirer l’intestin et placez-le dans une boîte de Pétri contenant du PBS.
   NOTE : Ciseaux Intestinal ont une forte et une pointe émoussée. L’extrémité arrondie de ces ciseaux est destinée à ne pas endommager l’architecture de la crypte-villosités lors de l’ouverture de l’intestin.
4. Commencez par placer la pointe émoussée dans l’estomac et le pousser doucement à travers le pylore. Aller de l’avant en coupant avec des ciseaux et en tirant avec la pince.
5. Une fois que l’intestin entier est ouverte longitudinalement, lavez-le dans du PBS froid en le tenant avec la pince et le rincer doucement dans la solution de PBS avec des mouvements en forme de U.
6. Une fois que tous les restes de selles sont effacés, procéder pour aplatir l’intestin sur une planche à découper, luminal face vers le haut. La face luminale est facilement reconnaissable par l’absence de vaisseaux sanguins et par son aspect pâle en comparaison avec la partie extérieure.
7. Avec une lame de verre, retirez délicatement les villosités en grattant l’intestin aplatie. Effectuez cette étape deux fois sur toute la longueur du tissu.
8. Couper l’intestin grêle avec une lame chirurgicale stérile en morceaux de 2 à 5 mm.
9. Placer les petits fragments intestinales dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de PBS froid de glace.
10. Nettoyer les fragments tissulaires, enlever toutes les impuretés restantes en pipettant également, les monter et descendre dans le PBS. Jeter le surnageant et répétez cette étape jusqu'à ce que le PBS est tout à fait clair.
11. Ajouter 15 mL de PBS froid, pour porter le volume final total de PBS à 25 mL. Ajouter 2 mM d’acide tétraacétique (EDTA) et incuber pendant 45 min sur un rouleau à 4 ° C.
12. Jeter le PBS/EDTA.
13. Ajouter 10 mL de PBS et détacher les cryptes de pipetage durement les fragments de tissus haut et en bas (au moins trois fois). Recueillir le liquide surnageant.
14. Répétez l’étape 2.13 quatre fois. Ajouter le milieu de culture pour atteindre un volume de 50 mL.
15. Les cellules de granule par centrifugation (300 x g pendant 5 min).
16. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture et les cryptes de granule par centrifugation (80 x g pendant 3 min).

3. seule cellule préparation

1. Jeter le surnageant des cryptes granulés et les remettre en suspension dans 1 mL, comme la trypsine-enzymes avec 50 µL DNAse (50 µg/mL).
2. Incuber les cellules dans un bain d’eau à 32 ° C pendant 2 min.
3. Ajouter 10 mL de milieu de culture. Dissocier les cryptes en cellules individuelles en durement pipetage monte et descend au moins 5 fois.
4. Filtrer la solution à travers un tamis de 40 µm (pour éliminer les touffes et autres impuretés) et les cellules individuelles à 300 x g pendant 5 min à pellets.

4. flow Cytometry et placage

1. Préparer 50 mL de solution saline tamponnée de 1 x Hank ou une solution de sérum (FCS) HBSS/2% vache foetale et Resuspendre le culot dans 1 mL pour chaque 10⁶ cellules
2. Ajouter à la suspension de cellules BV421 Lin^– (CD31, CD45, TER119) à une concentration de 1/100 et CD24-APC et CD117-PE les deux à une concentration de 1/250 anticorps pendant 30 min.
3. Tri Lgr5⁺ des cellules souches et des cellules de Paneth en bas séparés lient des tubes. Pour plus d’informations sur le tri des protocoles pour Lgr5⁺ et des cellules de Paneth, s’il vous plaît voir Roth et al. ⁷ et Schewe et al. ⁶
   1. Centrifuger les cellules triées à 300 g pendant 5 min. remettre en suspension les cellules dans 100 µL de milieu avec les composants décrits comme 1.3 (voir la Table des matières).
4. Traiter (par exemple, par une modification chimique ou génétique) les cellules de Paneth (n = 2000) ou les cellules souches de Lgr5⁺ (n = 2000).
   1. Pour traiter des cellules, utilisez 5 µL de réactif de transfection de liposome-négociée dans un volume total de 100 µL de milieu culture et petits ARN interférents (siARN) à une concentration de 100 nM. Incuber 30 min à 37 ° C pour les siARN ou pour la durée nécessaire à la modification choisie.
5. Laver les cellules deux fois en 500 µL de milieu de culture.
6. Centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes et remettre en suspension les cellules de 10 µL de milieu de culture.
7. Mettre en commun les deux composants cellulaires (Paneth ou Lgr5⁺ cellules) dans un 20 µl volume total et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
8. Incuber conjointement le Paneth et des cellules de Lgr5⁺ pendant 10 min à température ambiante.
9. Enlever 10 µL du liquide surnageant et laisser un ménisque du liquide bien sûr pour ne pas aspirer le culot cellulaire.
10. Ajouter 30 µL de membrane plasmique basale reconstituée dans les cellules pour un volume total de 40 µL, remettre les cellules en suspension et la plaque dans une assiette bien 96 préchauffé. Après 10 min, ajouter 200 µL de milieu complet (voir la Table des matières). Moyen de changer toutes les 48 h.
11. Multiplicité de comte organoïde au jour 5.

Résultats

L’essai de reconstitution organoïde permet l’analyse fonctionnelle séparée des composants essentiels de niche et de cellules souches de l’épithélium intestinal, témoigne ici de petits ARN interférents (siARN) du gène Apc .

Pour atteindre cet objectif, nous avons utilisé tout d’abord fluorescent cellulaire activé triant (FACS) pour séparer les cellules Lgr5⁺ 8000 et 6000 cellules de Paneth consanguine...

Discussion

L’ORA permet l’analyse fonctionnelle raffinée des deux composantes essentielles de la niche de cellules souches intestinales, à savoir Lgr5⁺ et cellules de Paneth. Cette approche a été utilisée précédemment par nous et d’autres avec de légères modifications^6,10,11. Nous présentons ici la procédure ORA comme un protocole de laboratoire standardisée et reproductible. En outre, nous rapportons sur les effets de ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Advanced DMEM F12 *	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Glutamax *	Thermo Fisher Scientific	35050061	Concentration finale : 10 mM
Pénicilline/streptomycine *	Thermo Fisher Scientific	15140122	Concentration finale : 1 %
Hepes *Thermo	Fisher Scientific	15630080	Concentration finale : 10 mM
Souris recombinante EGF *	Thermo Fisher Scientific	PMG8041	Concentration finale : 50 ng/ml
Souris recombinante Noggin *	Peprotech	250-38	Concentration finale : 100 ng/ml
y27632 *	Sigma	Y0503	Concentration finale : 10 µ ; M
Jagged-1 *	Anaspec Bio	AS-61298	Concentration finale : 1 µ ; M
R-spondine murine recombinante *	R& D systems	3474-RS-050	Concentration finale : 1 mg/ml
Flexitube Gene solution siRNA APC	Qiagen	GS11789	Concentration finale : 100 nM
Lipofectamine 2000 Thermo	Fisher Scientific	11668019
CD24 APC	Biolegend	101814
c-kit PE	Biolegend	105808
BV 421 CD31	Biolegend
BV 421 CD45	Biolegend	103134
BV421 TER119	Biolegend	116234
HBSS	Thermo Fisher Scientific	14180046
B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J	Jackson Laboratories	008875
Tubes à faible liaison	Eppendorf	Z666548-250EA
Matrigel	Corning	356230
* La combinaison de ces réactifs constitue le milieu

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