Grand Volume, éclairage pertinent sur le plan comportemental pour Optogenetics chez les Primates Non humains

Résumé

Un protocole pour construire un illuminateur pénétration tissulaire pour fournir la lumière au-dessus de grands volumes dont le diamètre minimal est présenté.

Résumé

Ce protocole décrit un illuminateur de grand volume, qui a été développé pour des manipulations d’optogenetic dans le cerveau de primate non humain. L’illuminateur est une fibre optique à mis à jour le plastique avec embout gravé, tels que la superficie d’émettant de la lumière est > 100 fois celui d’une fibre conventionnelle. En plus de décrire la construction de l’illuminateur de grand volume, ce protocole détaille l’étalonnage de contrôle de la qualité utilisé pour assurer la distribution même la lumière. De plus, ce protocole décrit des techniques pour insérer et retirer l’illuminateur de grand volume. Les structures superficielles et profondes peuvent être éclairés. Ce projecteur grand volume n’a pas besoin d’être physiquement couplée à une électrode, et parce que l’éclairage est fait de plastique, pas de verre, il se pliera simplement dans des circonstances, lorsque des fibres optiques traditionnelles serait briser. Car cet illuminateur distribue la lumière sur les volumes de tissus pertinents sur le plan comportemental (≈ 10 mm³) sans dommage de pénétration supérieure à une fibre optique conventionnelle, il facilite les études comportementales chez les primates non humains à l’aide d’optogenetics.

Introduction

Optogenetic outils, qui permettent un contrôle neuronal milliseconde-précis et axée sur la lumière sont largement utilisés pour étudier la physiologie fonctionnelle et le comportement des rongeurs et des invertébrés. Toutefois, des défis techniques ont limité l’utilisation d’optogenetics dans le cerveau de primate non humain, qui a un volume ~ 100 x plus grand que le cerveau de rongeurs ¹.

Pour faciliter les études d’optogenetics chez les primates non humains, enlumineur a été conçu pour répondre à deux objectifs contradictoires : illumination de grand volume et dommages de pénétration minimale. Les tentatives précédentes pour relever l’un de ces préoccupations sont venus à la coûteuse de l’autre. Faisceaux de fibres s’allument plus grands volumes mais avec diamètre augmenté et, par conséquent, dommages^2,3. Fibre de verre coniques réduire les dommages de pénétration, mais étroitement mise au point de lumière émettant des surfaces < 100 µm^{2 4,5}. Illumination de cerveau externe à travers une vitre dans la dure-mère contourne le défi des dommages de la pénétration et peut permettre pour l’éclairage de volume important, mais il seulement peut être utilisé pour quelques de zones cérébrales superficielles⁶.

Pour créer un illuminateur de grand volume, petit diamètre (Figure 1 a), la pointe d’un plastique optique fibre est conique de la chaleur et le noyau et le revêtement sont gravés (Figure 1 bc). Contrairement à d’autres fibres coniques qui se concentrent la lumière à un point précis, la gravure permet à la lumière de s’échapper uniformément sur les côtés de la pointe, ainsi, distribuer la lumière largement sur une grande surface (Figure 1 de). Parce que les dommages de pénétration sont proportionnel au diamètre de la pénétration, ce projecteur a aucun dommage de pénétration plus qu’une fibre conventionnelle, pourtant, il a > 100 x la lumière émettant une lumière de zone et livre surface plus large avec 1/100e la puissance lumineuse densité dans un cerveau fantôme (1,75 % d’agarose) (Figure 1e). Un modèle Monte Carlo (Figure 1f) illustre la différence dans la propagation de lumière entre une fibre conventionnelle et l’illuminateur de grand volume lorsqu’ils ont des densités de puissance lumineuse égale comme leur éclairantes. Chaque projecteur est calibré individuellement à l’aide d’une sphère d’Ulbricht (Figure 2 a, b) pour assurer la distribution même la lumière le long de la pointe (Figure 2c).

Ce projecteur grand volume a été validé avec optogenetic manipulation du comportement et de décharge neuronale chez les primates non humains. La longueur de pointe de fibre peut-être être personnalisée à une zone du cerveau et au mappage de champ réceptif individuels de chaque animal. L’illuminateur peut être couplé avec une électrode pénétrante pour les enregistrements neuronales qui s’étendent sur la durée de l’éclairement. En outre, parce que la fibre peut porter n’importe quelle couleur de la lumière visible, il peut être couplé avec n’importe lequel des molécules disponibles optogenetic disponibles.

Protocole

Remarque : toutes les procédures d’animaux étaient selon les directives des NIH et ont été approuvés par le Massachusetts Institute Technology Comité de protection des animaux.

1. illuminateur Fabrication

1. utiliser une paire de ciseaux tranchants pour couper un tronçon de 250 µm de diamètre en plastique fibre optique qui est supérieure à la longueur désirée illuminateur total d’au moins 10 cm.
2. Enlever 15 à 20 cm de gaine de polyéthylène d’une extrémité de la fibre optique en plastique à l’aide d’une pince à dénuder 22 calibre.
3. Secure distale plus 3 à 5 cm de l’extrémité dénudée de la fibre dans une pince étau de table.
4. Tenez l’extrémité chemisée de la fibre tendue d’une main avec une traction constante constante. La fibre doit être parallèle au sol, perpendiculaire à l’étau. Maintenir cette tension constante sur la fibre tout au long de chauffage et de refroidissement (étapes 1.5 et 1.6 ci-dessous) pour que la fibre reste droite et tendue comme il amincit.
5. Au réglage le plus bas d’un pistolet à air chaud température double (570/1 000 ° F), chauffer la partie dénudée de la fibre jusqu'à ce qu’elle est diluée à un diamètre de 60 à 100 μm, ou environ le diamètre d’un cheveu humain.
6. Maintenir une tension constante sur la fibre tout en permettant à la fibre refroidir. Incapacité à maintenir la tension peut provoquer la fibre à friser.
7. Confirmer le diamètre de l’extrémité amincie sous un microscope à dissection. Alternativement, on peut utiliser les étriers à la place.
   1. Si la fibre n’est pas assez mince, répétez les étapes 1.4 à 1.6 si nécessaire pour obtenir le diamètre souhaité.
   2. Facultatif si re-tirer, mettre une petite marque à la partie la plus étroite de la fibre si il sera chauffé à nouveau afin que le centre du pistolet à air chaud vise la partie la plus étroite de la fibre.
   3. Si la fibre est trop mince, recommencer.
8. Une fois que la fibre ait complètement refroidi et le diamètre désiré a été atteint, pincer la fibre 3 cm du point plus étroit de chaque côté. Avec un accès rapide, forte traction dans l’axe de la fibre, séparez les côtés pour créer une pointe effilée.
9. Examiner l’extrémité effilée sous une faible puissance (par exemple, 4 X) microscope de dissection. Si la pointe est fourchue ou ondulée ( Figure 1f), jeter la fibre.
10. Préparer vers etch l’extrémité effilée en plaçant un morceau de ruban de laboratoire près de l’extrémité de la pointe, laissant les derniers 5 mm exposé. La bande protège la fibre de la gravure ci-dessus la longueur désirée de la luminescence. Cette longueur de pointe a été sélectionnée sur l’épaisseur du cortex des primates dans la région cible. Une durée plus longue ou plus courte pourrait être exposée selon la longueur désirée de l’éclairement. Si vous souhaitez une longueur de pointe différents etch, le bord de la bande de laboratoire peut être rapproché à ou plus loin de l’extrémité effilée.
11. Replier un carré petit (~ 1 po x 2 po) de 5 μm feuille rodage de carbure de silicium entre le pouce et l’index. Placer l’extrémité de la fibre entre les deux côtés de la feuille de rodage et etch délicatement la fibre à l’aide de petits mouvements circulaires, comme si un BB de roulement entre le pouce et l’index. Souvent tourner la fibre afin que tous les côtés sont gravées uniformément. L’extrémité de la fibre apparaît “ rugueuse ” à le œil nu dans des zones qui ont été gravés, tandis que les zones non gravées apparaissent généralement lisses.
12. Répéter l’étape 1.11 avec un oxyde d’aluminium de 3 μm rodage feuille.
13. , Apposer un connecteur à l’extrémité de l’illuminateur en face de la pointe gravée. Cela permet l’illuminateur pour se connecter à un câble optique ou laser.
    Remarque : Cette méthode diffère de la méthode préférée pour la fixation de verre / fibres optiques silice dans les bagues. Parce que la virole de métal est plus dur que la fibre optique en plastique, polissage de la fibre et une bague en tant qu’unité après que collage peut endommager la fibre optique en plastique comme de minuscules éclats de métal produit pendant le processus de polissage peut intégrer eux-mêmes en fibre plat clivée.
    1. Retirer environ 5 mm de la gaine de polyéthylène du côté opposé de l’illuminateur à l’aide d’une pince à dénuder 22 calibre.
    2. Couper l’autre extrémité plate avec un couteau chaud pour lisser la surface.
    3. Polonais à l’autre extrémité plate avec rodage successivement plus fines feuilles : 5 µm, 3 μm, 1 μm et 0,3 µm.
    4. Insérer l’appartement en face de l’extrémité dans une virole d’acier inoxydable de diamètre intérieur 260 µm jusqu'à ce qu’il affleure de l’extrémité de la ferrule.
    5. Confirmer visuellement que l’extrémité opposée est facilement et uniformément polie avec un microscope de fibre.
    6. Retirer l’embout de la fibre et l’embout verticalement sur le bord d’une table de bande avec la fibre vers le bas.
    7. Remplir une seringue de 1 mL avec de l’époxy en plastique et fixer une aiguille de 18 calibre émoussé à la seringue.
    8. Utiliser l’aiguille pour enduire vers le bas dans la virole. L’embout se remplir complètement avec de l’époxy.
    9. Insérer l’embout de la fibre.
    10. Essuyer tout excès époxy de surface polie de la fibre avec un chiffon non pelucheux humide avant séchage si nécessaire. Dans le cas contraire, excès époxy peut être enlevé après 12 à 24 h.
    11. Conserver la fibre doucement jusqu'à l’étalonnage et placer un capuchon sur l’embout.

2. Illuminateur d’étalonnage et de contrôle de la qualité

Remarque : ces méthodes pour l’étalonnage évaluer pour la non-linéarité à différentes distances de l’extrémité de la fibre de sortie de lumière. Inégale répartition de la lumière résulte généralement d’un “ bosselé ” ou “ ondulé ” cône.

1. Créer un blindage léger diaphragme pour le haut de la sphère intégrant l’aide absorbant léger grille ( Figure 2).
   Remarque : Portez des gants lorsque manipulation lumière absorbant aluminium pour empêcher la peau huiles de la création de légères taches réfléchissantes.
   1. Pli a 2 ” de 4 ” morceau de lumière absorbant aluminium au-dessus sur lui-même pour former un 2 ” x 2 ” square. une autre méthode consiste à couper un 2 ” x 2 ” carré avec une lumière absorbante côté et un feu qui reflète le côté (c.-à-d. un côté de papier d’aluminium standard) ; Toutefois, la méthode pliable est plus sûre parce qu’il fournit un bord terne pour la manipulation du diaphragme dans la prochaine étape.
   2. plier le ruban de laboratoire ou du ruban isolant sur les bords de la place pour lier les bords non plié. Cela cimente les côtés et protège contre les coupures d’arêtes vives.
   3. Percer un trou dans le centre de la place à l’aide d’une aiguille de 26 calibre.
   4. Supprimer la grosse vis sur le cap de la sphère d’intégration et couvrir l’ouverture avec le diaphragme. Recouvrir le trou au centre. Si la membrane a été créée avec une lumière absorbante et une lumière réfléchie côté, placer la lumière absorbant côté vers le haut et la lumière réfléchie vers le bas, vers l’intérieur de la sphère d’intégration.
      Remarque : Pour empêcher la poussière et les débris de pénétrer dans la sphère d’intégration et pour garder le trou centré, fixer le diaphragme à l’extérieur de la sphère d’intégration avec du ruban adhésif lab.
2. Mesure lumière sortie le long de la pointe par incréments de 500 µm à l’aide d’un micromanipulateur ou un bras et une sphère d’Ulbricht.
   Remarque : Lunettes de protection de la longueur d’onde appropriée devraient être portés à chaque fois que le laser est sur.
   1. Reliez l’autre extrémité de la fibre à un laser ou une lumière source, mais ne déclenchent pas de lumière de sortie encore.
   2. Garantir l’illuminateur à un titulaire stéréotaxique (prefeRahab avec du ruban adhésif lab) avec la pointe 7-10 mm au dessous du fond du support à.
   3. Vis du support stéréotaxique dans l’ARM stéréotaxiques.
   4. Alignez la pointe de l’illuminateur avec le trou dans le centre du diaphragme. Zéro le micromanipulateur lorsque la pointe est au même niveau que le diaphragme exact.
   5. Tourner à éteindre les lumières de la pièce et la sphère d’intégration à zéro.
   6. Déclencher le laser (ou autre source lumineuse) et mesurer la puissance lumineuse totale de sortie à l’aide de la sphère d’intégration.
      Remarque : Utilisez la sortie de lumière le plus bas possible pour les essais d’étalonnage.
   7. Abaisser la fibre 500 µm dans l’intégration sphère et répéter étape 2.2.6.
   8. Continuer à abaisser la fibre dans la sphère d’intégration et puissance lumineuse totale 500 µm par incréments de mesure jusqu'à ce que les niveaux de puissance lumineuse totale OFF.
      Mise en garde : Puissance lumineuse totale doit se stabiliser lorsque la pointe entière est dans le domaine. Ne continuez pas à abaisser la fibre plus de 1-2 mm par rapport à la gravé Astuce longueur. Si la pointe touche la partie inférieure de la sphère d’intégration, il peut faire fondre ou ruiner la sphère d’intégration.
3. Confirmer une fibre uniformément gravée en traçant la puissance lumineuse totale de sortie comme une fonction de dans quelle mesure la fibre a été abaissée dans la sphère d’intégration pour confirmer la linéarité.

3. in Vivo de l’Illumination

Remarque : ici, ces méthodes sont indiquées à l’aide d’un modèle en plastique plutôt qu’un primate non-humain.

1. Implant une chambre d’enregistrement de 25 mm de diamètre a été implantée sur la zone de cerveau d’intérêt avant expérimentation.
2. Exécuter anatomique imagerie de résonance magnétique (IRM) avant l’expérimentation. Placer une grille d’enregistrement personnalisé dans la chambre et le remplir avec un lubrifiant chirurgical stérile permettant de la visualisation de la grille et la détermination du niveau des structures cérébrales dura et cible.
3. Préparer un tour micro-disque avant chaque séance de test.
   1. Affixe serre-un tube de guidage de 25 calibre avec pointe biseautée au milieu et en bas sur le disque. Deux pinces servent à s’assurer que le tube de guidage reste droit. Deux de ces colliers peuvent être déplacés manuellement si vous le souhaitez.
      Remarque : Le tube de guidage peut être époxy ou soudé au bornier.
   2. Fixer l’illuminateur de grand volume dans la bride du haut sur le même lecteur. Cette pince est attachée à la motorisation.
   3. Visser l’illuminateur de grand volume à travers le tube de guidage complétement et confirmer que la pointe de l’illuminateur s’étend au-delà de l’extrémité de la gaine.
      Remarque : La longueur de l’illuminateur qui va passé l’extrémité de la gaine est égale à la distance entre la dure-mère et la marge inférieure de la région cible du cerveau, comme déterminé par MRI.
   4. Faire tremper le tube de guidage et illuminateur dans une solution antiseptique (p. ex., chlorhexidine) pour stériliser.
4. , Placer une grille personnalisée stérilisée à l’intérieur de la chambre propre et attachez une orientation pré-spécifié avec une vis sur le côté de la chambre. La grille ci-contre a espacement 1 mm ; Toutefois, l’espacement peut être personnalisé selon les besoins.
   Remarque : Cela devrait être identique à la grille et l’orientation utilisée dans l’IRM anatomique.
5. Fixer le support de micro-lecteur stéréotaxique sur la chambre d’enregistrement dans une orientation pré-déterminé.
6. Se rétracter l’illuminateur stérilisé de la gaine en tirant l’illuminateur à l’aide de la pince stérile et arrondi. La pointe de l’illuminateur est 5 à 10 mm au-dessus de l’extrémité du tube de guidage.
   Remarque : L’illuminateur incline vers l’extérieur entre le tube de guidage et la bride. Cela n’endommagera pas l’illuminateur flexible.
7. Fixer le micro-drive au titulaire et placer le tube de guidage dans le trou de grille cible.
8. Abaisser la scène micro-lecteur jusqu'à ce que le tube de guidage est juste à travers le niveau de la dure-mère.
   Remarque : Si vous le souhaitez, un second micro-disque avec une électrode peut être placé sur la scène et plongé dans un trou de grille différente. Le champ local potentiel sur cette électrode montrera un artefact léger dépendant de la distance, qui peut être utilisé pour confirmer le placement illuminateur.
9. Essayez la bas l’illuminateur manuellement avec une pince stérile.
   1. Si il n’y a aucune résistance, rétracter l’illuminateur 5 - 10 mm, attendre 10 min pour permettre le tissu pour s’installer, puis réessayez.
   2. S’il y a encore la résistance à la deuxième tentative, rentrer la pointe de l’illuminateur dans le tube-guide, plus bas le guide tube 0,25 mm, puis réessayez.
   3. Répéter jusqu'à ce que la glisse illuminateur à travers le tube de guidage sans aucune résistance.
   4. Abaisser l’illuminateur jusqu'à ce qu’elle est bien tendue.
      Mise en garde : Ne pas pousser l’illuminateur avec force contre résistance. Dans ces cas le tube de guidage généralement n'a pas pénétré la dure-mère entièrement. En poussant la fibre avec force les fera plier sur lui-même, empêchant les fibres de pénétrer dans le cerveau et éventuellement détruire la pointe ( Figure 1 g).
10. Connectez l’embout à l’autre bout de l’illuminateur à l’agrandissement optique mis en place ou le laser.
11. Veiller à ce qu’aucune lumière n’est visible par les primates non humains.
    1. Utiliser occultants blindage ou lumière absorbant aluminium pour entièrement couvrir les tours enregistrement.
    2. Placer toutes les connexions optiques dans des enveloppes blindés faits de la lumière absorbant clinquant.
    3. Protéger tous les câbles de raccordement soit lumière absorbant la feuille ou du ruban isolant noir.
    4. Comme une précaution supplémentaire, placez une banque de diodes électroluminescentes (LED) de leurre de la même couleur de lumière utilisée pour l’expérience derrière le primate non-humain et clignoter les LED en permanence à 2,5 Hz. Cela empêche les yeux de réglage entièrement à l’obscurité. S’il y avait une fuite légère par inadvertance, cette lumière clignotante contribuerait à prévenir la fuite comme un déclencheur comportemental.

Résultats

L’éclairage des volumes de gros cerveau chez les primates non humains permet pour une manipulation optogenetic pertinentes sur le plan comportemental. Acker et al. (2016) utilisé cette illuminateur de grand volume avec le Halorhodopsin décalée vers le rouge, Jaws ⁷ pour étudier la contribution temporelle du champ œil frontal (FEF) pour mémoire guidée par saccades dans deux singes rhésus. Plus précisément, les neurones FEF ont été injectés avec un vecteur viral contenant des mâchoires et p...

Discussion

Alors que les outils d’optogenetic sont largement utilisés pour étudier la maladie et la physiologie chez les rongeurs, le défi technique de volumes de gros cerveau éclairante a limité l’utilisation des optogenetics chez les primates non humains. Pionnier des études chez le singe utilisé des densités de grande puissance lumineuse (~ 100 mW/mm² à 20 L/mm²) pour illuminer de petits volumes, peut-être < 1 mm³et effets comportements modestes rapportés avec excitateurs opsines dans le cort...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fibre optique en plastique	Fibre optique industrielle	SK-10	250 microns de diamètre, ligne Super Eska
Dénudeuse	Klein Tools	11047	Pince
d’étau	Wilton	11104	Pince d’étau générique pour montage sur table
Pistolet thermique à double température	Milwaukee	8975-6	570 / 1 000 ° ; F
Marqueur de laboratoire	VWR	52877
Microscope de dissection	VistaVision	82027-156	Stéréomicroscope avec double lumière incandescente, grossissement 2X/4X, disponible chez VWR
Ruban de laboratoire	VWR	89097-972	Paquet de 4 de couleur violette ; cependant, la couleur du ruban n’a pas d’importance
Feuille de rodage en carbure de silicium	ThorLabs	LF5P	grain de 5 microns, paquet de 10
Feuille de rodage en oxyde d’aluminium	ThorLabs	LF3P	grain 3 microns, paquet de 10
Feuille de rodage en oxyde d’aluminium	ThorLabs	LF1P	grain 1 micron, paquet de 10
Feuille de rodage en alumine calcinée	ThorLabs	LF03P	grain 0,3 micron, paquet de 10
Couteau chaud	Fibre optique industrielle	IF370012	60 Watt, portée
	d’inspection de la fibre robusteThorLabs	FS201	en option
Virole en acier inoxydable	Fibre optique de précision	MM-FER2003SS-265	265 microns de diamètre intérieur
de 1 mL	BD	14-823-30	L’embout Luer-lok est préférable pour réduire le risque de fuite, mais n’est pas strictement nécessaire
Époxy plastique	Fibre optique industrielle	40 0005
Aiguille émoussée de calibre 18	BD	305180	Lingette non pelucheuse de 1,5 pouce
de longueur (KimWipe)	ThorLabs	KW32	disponible auprès de nombreux fournisseurs
Feuille absorbante légère	ThorLabs	BKF12
Ruban isolant	3M	Temflex 1700	En option, peut remplacer d’autres marques / modèles
Aiguille pointue de calibre 26  ;	BD	305111	d’une longueur de 0,5 pouce
Le micromanipulateur	Siskiyou	70750000E	peut remplacer d’autres marques/modèles
Le bras stérétactique	Kopf	1460	peut remplacer d’autres marques/modèles
Lunettes de sécurité laser	KenTeK	KCM-6012	doit être sélectionné en fonction de la couleur du laser utilisé, exemple donné ici
Laser ou autre source lumineuse	vortran	Stradus 473-50	exemple de laser bleu
Sphère d’intégration	ThorLabs	S142C	Capteur de puissance attaché, également disponible chez ThorLabs, article #PM100D
Chambre d’enregistrement Ultem Instrument	Crist entreprise	6-ICO-J0	Personnalisé avec encoche d’alignement
Micro-entraînement tour avec pinces	NAN	DRTBL-CMS
Tube de guidage Personnalisé		N/A	Fabriqué à partir d’une aiguille spinale (BD) de calibre 25 ou d’un tube émoussé
Système d’entraînement NAN	NAN	NANDrive
Conception de grille personnalisée		personnalisés	disponibles sur demande
Pince émoussée	FischerScientific	08-875-8A	Pince émoussée générique en acier inoxydable
Étriers numériques	Neiko	01407A	Disponible sur amazon.com. Sélectionner, s’il y a lieu, un pied à coulisse de résolution plus fine pour des mesures plus précises.
Câble de raccordement	ThorLabs	FG200LCC-custom	Ceci est un exemple de nombreux câbles de raccordement possibles. Tant que le diamètre de la fibre est inférieur ou égal au diamètre de la fibre de l’illuminateur grand volume et tant que les connecteurs s’interfacent, tout câble de raccordement (en verre ou en plastique, acheté par le vendeur ou fabriqué en laboratoire) convient à cette application.
Capuchons anti-poussière en plastique transparent	ThorLabs	CAPF	Paquet de 25
manchons d’accouplement fendus en céramique	Precision Fiber Products, Inc.	SM-CS1140S