Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

Summary

L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée du protocole pour le dosage de métastase pulmonaire (PuMA). Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier la croissance des cellules dans les tissus pulmonaires à l’aide d’une fluorescence widefield ou microscope confocal à balayage laser ostéosarcome métastatique (OS).

Abstract

L’essai de métastase pulmonaire (PuMA) est une ex vivo explant de poumon et le système de culture de cellules fermées qui permet aux chercheurs d’étudier la biologie de la colonisation de poumon dans l’ostéosarcome (OS) par microscopie à fluorescence. Cet article fournit une description détaillée du protocole et traite des exemples d’obtenir des données d’image sur la croissance métastatique à l’aide de widefield ou plateformes de microscopie confocal fluorescence. La souplesse du modèle PuMA permet des chercheurs d’étudier non seulement la croissance des cellules d’OS dans le microenvironnement de poumon, mais aussi pour évaluer les effets de la thérapeutique anti-métastatique au fil du temps. La microscopie confocale permet l’imagerie haute résolution, sans précédent des interactions cellulaires OS avec le parenchyme pulmonaire. En outre, le modèle PuMA est associé à des colorants fluorescents ou reporters génétique de la protéine fluorescente, les chercheurs peuvent étudier le microenvironnement de poumon, les structures cellulaires et subcellulaires, la fonction du gène et l’activité de promoteur dans les cellules d’OS métastatiques. Le modèle PuMA offre un nouvel outil pour les chercheurs d’ostéosarcome à découvrir la nouvelle biologie de métastase et évaluer l’activité de nouveaux traitements anti-métastatiques et ciblées.

Introduction

Amélioration des résultats pour les patients pédiatriques atteints d’ostéosarcome métastatique (OS) reste encore une critique comblés clinique ¹. Cela souligne l’importance de développer des nouvelles thérapies moléculaires ciblées. Des agents chimiothérapeutiques classiques que la prolifération des cellules tumorales cible n’ont pas été prouvées pour être efficace dans le traitement de la maladie métastatique et donc de nouvelles stratégies doivent cibler le processus métastatique lui-même ². L’actuel article porte sur les aspects pratiques d’un type relativement nouveau de ex vivo le modèle métastase pulmonaire, le dosage de métastase pulmonaire (PuMA) développé par Mendoza et ses collègues³, qui fournit un outil utile pour découvrir de nouveaux conducteurs moléculaires dans la progression de métastases pulmonaires en OS ^4,5. Toutefois, avant de poursuivre, il serait prudent d’aborder brièvement plusieurs modèles actuels de métastases et comment le modèle PuMA offre plusieurs avantages sur conventionnelles in vitro tests.

Des modèles plus expérimentaux utilisés pour étudier les métastases comprennent des systèmes in vitro et in vivo de récapitulent une étape spécifique ou plusieurs étapes de la cascade métastatique. Ces étapes incluent : émigrer loin de la tumeur primitive, l’intravasation 2) dans des navires voisins (sanguin ou lymphatique) et transport en commun au sein de la circulation, des cellules de tumeur 1) 3) arrêter au site secondaire, extravasation 4) et la survie du site secondaire, formation de 5) des micrométastases et 6) la croissance des métastases vascularisés (Figure 1). Les modèles in vitro de la métastase peuvent inclure 2 dimensions migration (2D) et 3 Dimensions (3D) analyses d’invasion Matrigel qui sont examinés en détaillent ailleurs ⁶. Pour les modèles in vivo , les deux systèmes de modèles couramment utilisés comprennent : 1) le modèle de métastase spontanée est où des cellules tumorales sont orthotopically injecté dans un type spécifique de tissu pour former une tumeur locale qui apporte spontanément des cellules métastatiques à des endroits éloignés ; 2) le modèle expérimental de métastase est où les cellules tumorales sont injectés dans le vaisseaux sanguins en amont de l’organe cible. Par exemple, une queue injection dans la veine des résultats de cellules de tumeur dans le développement du poumon métastases^5,7,8. Autres modèles expérimentaux métastase comprennent l’injection de cellules tumorales dans la rate ou de la veine mésentérique qui se traduit par le développement des métastases hépatiques^9,10. Des considérations pratiques de ces modèles in vivo sont examinées en détail par Welch ¹¹. Un autre modèle in vivo utilisé pour étudier des métastases dans les sarcomes pédiatriques est le modèle d’implantation sous-capsulaire tumeur rénale rein qui provoque la formation de tumeurs locales et métastase spontanée aux poumons ^12,13. Une technique plus techniquement exigeante comme vidéomicroscopie intravitale peut visualiser directement, en temps réel, interactions entre les cellules de cancer métastatique et la microcirculation d’un site métastatique (ie. poumon ou du foie) tel que décrit par MacDonald¹⁴ et Entenberg,¹⁵, ou cancer cell extravasation dans la membrane chorio-tel que décrit par Kim, ¹⁶.

Le modèle de PuMA est une ex vivo, l’explant tissu pulmonaire, système de culture fermée où la croissance des cellules tumorales fluorescent peut être longitudinalement observée par microscopie de fluorescence au cours d’une période d’un mois (voir la Figure 2 a). Ce modèle récapitule les étapes initiales de la colonisation de poumon (étapes 3 à 5) dans la cascade métastatique. Quelques grands avantages du modèle PuMA par rapport aux modèles classiques in vitro sont : 1) elle offre la possibilité de mesurer la croissance des cellules cancéreuses métastatiques dans un micro-environnement 3D qui conserve de nombreuses caractéristiques du microenvironnement poumon longitudinalement dans vivo ³; 2) puMA permet au chercheur de déterminer si la précipitation d’un traitement de gène ou médicament candidat a une activité anti-métastatique dans le contexte d’un micro-environnement poumon 3D ; 3) le modèle PuMA est souple avec une multitude de plateformes de microscopie de fluorescence (Figure 2 b) comme la microscopie de fluorescence widefield ou microscopie confocale à balayage laser, des exemples de chacun sont montrés dans la Figure 2 -D, respectivement. Cet article discute comment utiliser le modèle PuMA pour obtenir des données d’imagerie longitudinales sur la croissance métastatique de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP)-exprimer, les cellules humaines ostéosarcome métastatique haute et basse (MNNG et HOS cellules, respectivement) à l’aide faible grossissement widefield fluorescence. Exemples d’imagerie un colorant fluorescent qui étiquète le parenchyme pulmonaire et une protéine fluorescente rouge journaliste génétique qui étiquète mitochondries dans les OS des cellules dans le modèle de PuMA à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser sont également discutés.

Protocol

Tous les protocoles d’animaux d'où proviennent les données d’imagerie ont été effectués avec l’approbation de l’animalier et du Comité d’urbanisme de l’Institut National du Cancer, de la National Institutes of Health. Tous les protocoles animales examiné et décrit dans l’article vidéo ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université de la Colombie-Britannique.

1. préparation des cellules tumorales pour injection et matériaux pour le modèle de PuMA

Remarque : La quantité de cellules et de la solutions sera suffisant pour 1 souris. Intensifier selon les besoins si plus de souris sont utilisées dans l’étude. Pour les recettes des médias, se reporter au tableau 1 et tableau 2.

1. Réchauffez 5 mL de A-Media dans un tube conique de 15 mL dans un bain-marie à 37 ^oC.
2. Faire fondre la 1,2 % basse fusion agarose solution (dans de l’eau stérile) utilisant le micro-ondes de laboratoire.
3. Transférer 5 mL de l’agarose fondu dans un tube conique de 15 mL et garder au chaud dans un bain-marie à 37 ^oC. Assurez-vous que l’agarose fondu est à 37 ^oC et liquide avant l’étape d’insufflation pulmonaire.
4. Pré refroidissement éolien 30 mL de grade de culture cellulaire PBS additionné de 1 X stylo/strep dans un bac à glaçons.
5. Dans un puits d’une plaque 6 puits, pré-tremper une éponge de gélatine dans 1,5 mL de B-médias. L’éponge sera le point d’ancrage de soutien pour les tranches de poumon.
6. S’assurer que les cellules d’OS sont environ 70-90 % confluentes sur le jour de l’intervention. Ne pas utiliser de cellules qui sont trop anastomosé ou si le support est orange à jaune car les cellules sont habituellement stressées et ont diminué de viabilité à ce stade. Pour les lignées cellulaires d’ostéosarcome, MNNG et HOS, 5 x 10,⁵ , dans un volume de 100 μL serviront à injecter dans la veine caudale de 1 souris. Haut de gamme en conséquence si plus de souris sont utilisées pour l’étude.
7. Récolter les cellules tumorales à l’aide de 0,25 % de trypsine-EDTA (3 mL pour une fiole T75 ou 2 mL dans une boîte de Petri de 10 cm). Lorsque les cellules commencent à décoller de la plaque, neutraliser la trypsine-EDTA avec support complet. Faites tourner les cellules et rincez une fois avec la classe de culture cellulaire PBS. Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS.
8. Effectuez un comptage cellulaire par des méthodes normalisées. Il est préférable que la suspension de cellules plus que ce qui est réellement nécessaire car perte de suspension cellulaire souvent se produit pendant l’aiguille rédiger et injection tentatives infructueuses.
9. Effectuez un test d’Exclusion-le bleu Trypan sur un échantillon de la suspension cellulaire afin d’évaluer la viabilité des cellules. Avoir lieu que si la cellule Voir la viabilité de 90 % ou plus.
10. Injecter 5 x 10⁵ cellules dans un volume de 100 μL. Pour préparer un excès de 2 X de cette somme, 1 x 10⁶ cellules devraient être tournés vers le bas et resuspendues dans 0,2 mL de HBSS.
11. Placez la suspension cellulaire dans un seau à glace tout en préparant les souris pour injection.

2. Injection dans la veine et Lung Insufflation de queue

Remarque : La quantité de solutions et de cellules dans cette section sera suffisant pour 1 souris. Intensifier selon les besoins si plus de souris sont utilisées dans l’étude. Pour obtenir la liste des équipements, matériaux et instruments chirurgicaux utilisés dans les étapes suivantes, se reporter au tableau 3 et tableau 4.

1. Réchauffer une souris femelle (âge 6-8 semaines) sous une lampe chauffante pendant 5 min afin de rendre leur queue veineuse plus visiblement apparente. Pour des cellules K7M2 ou K12, utiliser la souris Balb/c ; pour des cellules humaines, MG63.3, MG63, MNNG et HOS, utiliser la souris de déficit immunitaire combiné sévère.
2. Assurez-vous que la suspension cellulaire est uniforme en agitant doucement le tube. Dresser soigneusement la suspension cellulaire dans la seringue de 1 mL sans l’aiguille. Aiguille de calibre Cap la seringue avec un 27. Assurez-vous que le biseau de l’aiguille est sur le même côté que les marques de volume sur l’aiguille.
3. Placez votre souris dans la drisse et tamponner la queue avec un imbibé d’alcool.
4. Passez à effectuer une injection dans la veine queue et injecter le 100 μl de la suspension cellulaire. 5 min après l’injection, placez la souris dans une chambre de CO₂ et commencer le mode opératoire normalisé euthanasie (comme le contour de votre Comité de protection des animaux institutionnelle). Dislocation cervicale ne devrait pas servir de moyen d’euthanasie car la procédure risque d’endommager la trachée.
5. Une fois que la souris est euthanasiée, débutez la préparation de la hotte à flux laminaire pour l’insufflation du poumon souris avec la solution d’agarose/A-media. Dans la hotte à flux laminaire, mis en place un espace de travail avec votre tampon stérile. Sur cette touche, vous placerez vos instruments stérilisés, cathéter IV, IV extension ensemble et appareil de perfusion de gravité (voir la Figure 1).
6. Placez votre souris en recumbancy dorsale. Avec des ciseaux stériles de petit, disséquer attentivement sur le sternum pour exposer la cavité thoracique. Prenez soin de ne pas perforer le poumon car une solution d’agarose/A-media sera utilisée pour insuffler du poumon.
7. Lorsque la dissection sur le sternum, disséquer passé l’entrée thoracique sur les deux côtés la trachée. Exposer la trachée en disséquant loin des tissus mous environnants.
8. Canule dans la trachée avec un cathéter IV de 20 calibre. Vaguement un nœud chirurgicale avec suture catgut stérile autour de la trachée canulée.
9. Attacher une extension IV la seringue de 10 mL de l’appareil de perfusion de gravité la valeur de la trachée cathétérisée.
10. Combiner le pré chauffé 37 ^oC agarose (5 mL) et A-media (5 mL) dans un mélange 1:1. Verser la solution de gel d’agarose/A-media liquide dans la seringue de 10 mL de l’appareil de perfusion gravité. Avant insufflation des poumons avec une solution d’agarose/A-media, veiller à ce que toute la longueur de l’ensemble de l’extension a été amorcée avec l’agarose/A-media, niant ainsi l’insufflation accidentelle des échantillons pulmonaires à l’air.
11. Remplir le poumon l’agarose/A-media solution jusqu'à ce que le poumon est entièrement insufflé.
12. Une fois que le poumon est entièrement insufflé, retirer la canule et attacher fermement le noeud chirurgical pour éviter les fuites de la solution de l’agarase/A-media dans la trachée.
13. Passez à disséquer sur le courage (trachée, coeur et poumon) de la cavité thoracique. Faites attention à pas de perforation ou d’endommager la surface du poumon.
14. Place le pluck (dans aucune orientation particulière) à l’avance réfrigérée 30 mL de PBS additionné de 1 X stylo/strep et permettre l’agarose/A-media solidifier pendant 20 min.
15. À l’aide des ciseaux et pince à épiler, couper de petits morceaux du poumon (3 x 1,5 mm) comme le montre la Figure 1 a. Petites tranches de poumon peuvent être facilement photographiées à l’aide d’un objectif X 2,5. Plusieurs sections peuvent être coupées par les conditions expérimentales, généralement de 4 à 10 tranches par groupe.
    Remarque : Pour chaque groupe expérimental, déposer les tranches de poumon dans un puits distinct (plaque 6 puits) contenant une éponge de gélatine de 2 x 2 cm préalablement trempée dans B-médias. Le montant des médias / puits devrait être de 1,5 mL. Modifier les médias tous les 2-3 jours. Pour les études de médicaments, la fréquence de l’évolution des médias/médicament est utilisateur déterminé.

3. Widefield Fluorescence Imaging de tranches de poumon et d’analyse

Remarque : Pour widefield fluorescence imaging, petites tranches sont coupés (3 x 1,5 x 1 mm) afin d’intégrer la section poumon 1 image en utilisant un objectif X 2,5.

Acquisition d’images sur un microscope à fluorescence widefield :

1. Tranches de poumon sont généralement imagés à 0, 3, 7 et 14 jours après injection. Dans l’environnement stérile du cabinet biologique, transvaser avec soin les tranches de poumon de la gélatine, éponges à un fond en verre stérile 35 mm rond plat. Prenez soin de dab hors du liquide excédentaire dans la tranche de poumon comme l’excès de liquide va agir comme un miroir et réfléchissent la lumière fluorescente venant de cellules tumorales.
2. Disposer les tranches de poumon de façon similaire, représentée dans la Figure 1 a. Chaque colonne représente une condition expérimentale différente. Prenez soin de ne pas la contamination croisée des poumons avec la pince à épiler. Rincer avec de l’éthanol à 70 % et sécher avant de manipuler des tranches de poumon d’un autre groupe expérimental.
3. Optimiser les paramètres d’imagerie (ie. gain, décalage, l’exposition le temps, binning) qui offre le meilleur contraste entre les cellules tumorales fluorescent et le tissu pulmonaire arrière-plan du contrôle (véhicule non traitée) groupe. Utilisez les mêmes paramètres appartenant au groupe témoin afin d’imager les groupes expérimentaux. Enregistrer en tant que format d’image tiff.
4. Pour une référence de l’échelle, prenez une photo numérique d’un micromètre le même objectif.
5. Puisque le poumon auto-fluorescence change au fil du temps, les paramètres d’imagerie doivent être ajustés aux poumons contrôle chaque séance d’imagerie. Les paramètres d’imagerie pour une session ne peuvent pas nécessairement être optimales pour les sessions ultérieures d’imagerie.

Analyse d’images :
Remarque : Les étapes de traitement image suivants sont effectués avec ImageJ 1,51 h software package ¹⁷.

1. Ouvrir un fichier image dans ImageJ (Figure 3 a).
2. Soustraire le fond : processus > soustraire fond > rayon de Rolling ball (Commencez par 50 pixels), décochez la case « Lumière de fond » (Figure 3 b).
3. Convertir image en 8 bits format : Image > Type > 8 - bit (Figure 3).
4. Valeur des unités de pixels : Image > Enter « Pixels » dans l’unité de longueur, entrez 1 dans « Largeur en pixels », « Hauteur en pixels », « Voxel profondeur ». Case « Global » à appliquer aux images suivantes.
5. À l’aide de l’outil de sélection polygone, esquisser la forme de la tranche de l’ensemble du poumon et de déterminer la zone (pixel²) de la tranche totale des poumons. Cette valeur servira à calculer la charge de pourcentage tumeur du poumon.
6. Image de seuil : Image > réglage > seuil > souligner « Par défaut » et « B & W » > Utilisez le curseur seuil l’image telle que la majorité des cellules tumorales est correctement mis en évidence. En appuyant sur « Appliquer » se traduira par une image noir et blanc où le poumon est tout noir, et les lésions fluorescentes sont blanches (Figure 3D). Une seconde pression sur « Apply » va inverser l’image où toutes les structures fluorescents sont maintenant des formes noires (Figure 3E).
7. Quantification du nombre et la forme de lésions :
   Analyser > définir les mesures > Vérifier la « Zone ». Décochez toutes les autres cases.
   Analyser les particules > taille (pixels²) : 0-infini représente la plage de formes qui énumère ImageJ. Empiriquement déterminer la plus petite lésion qui est réputée pour être une cellule tumorale unique en images de véhicule jour 0. Utilisez la zone de cette cellule tumorale unique comme la limite inférieure pour les images restantes dans le jeu de données. Pour le travail présenté dans cet article, 11 pixel² est définie comme la limite inférieure. Pour le œuvre présentée dans l’exemple de vidéo, 24 pixel² est définie comme la limite inférieure. Gamme « Circularité » laissez 0-1. « Show » peut être définie sur « Nothing ». Par ailleurs, si le « Show » et « Contours » est sélectionné, un dessin de toutes les formes décrites est généré. Consultez « Affichage des résultats » pour une fenêtre séparée des mesures pour faire apparaître. Éventuellement, après avoir « Ajouter au manager » case cochée sauvera toutes les formes quantifiées à un responsable du ROI, qui peut être enregistré pour référence ultérieure. Après avoir appuyé sur OK, une fenêtre de « Résultats » apparaîtra contenant toutes les formes énumérées et les mesures de surface (Figure 3F).
8. Copiez et collez les données dans la fenêtre « Résultats » dans une feuille de calcul. Utiliser la fonction mathématique de somme dans Excel pour la somme de toutes les zones des lésions métastatiques pour cette tranche particulière de poumon. Pour évaluer la charge de tumeur de poumon pourcentage de tranche de poumon, diviser la somme des superficies des lésions métastatiques de la superficie totale de la tranche du poumon. Ce paramètre est également connu sous le nom de fraction de zone (un_A) qui est décrite plus loin par Underwood ¹⁸.
   Charge de tumeur pulmonaire = somme de domaine domaines/total lésion métastatique de la tranche de poumon
9. Calculer la charge tumorale pour le reste des sections pulmonaires dans le groupe témoin et autres groupes. Tracer le fardeau de tumeur pulmonaire moyenne par groupe 0, 3, 7 et 14 jours. Représentant widefield images fluorescentes de haute et basse métastatiques cellules OS humains de plus en plus dans le modèle de PuMA aux moments progressive s’affichent (Figure 4 a). Un ligne graphique montrant le pli-changement (normalisé à jour 0) fardeau de la tumeur métastatique pourcentage au fil du temps s’affiche (Figure 4 b).

4. confocal Fluorescence Imaging du modèle PuMA

NOTE : Pour l’imagerie confocale, traitement de tissu est similaire à celle de la section précédente sauf que les plus grandes tranches de poumon sont coupés (coupes transversales complets, 1-2 mm d’épaisseur) afin de permettre plus de ROIs à être photographié.

Étiquetage du parenchyme pulmonaire avec DAR4M :

1. Plonger les tranches de poumon en 10 μμM de DAR4M (dans HBSS) pendant 45 min à 37 ° C. DAR4M étiquettes espèces réactives d’azote dans les cellules du poumon.
2. Après 45 min d’incubation, rincer les tranches de poumon avec frais HBSS.
3. Placer la tranche de poumon dans un fond en verre 35 mm rond plat et l’image sur la microscopie confocale.
4. Les paramètres d’imagerie pour les images de l’exemple illustrés à la Figure 5 sont répertoriés dans le tableau 5.
5. Acquérir une Z-pile pour une région d’intérêt. Utilisez l’épaisseur de tranche Z suggérée pour l’échantillonnage de Nyquist. Un film représentatif d’un empilement 3D montrant des cellules d’OS fluorescentes vertes dans le tissu pulmonaire marqué DAR4M est fourni dans Movie 1 et supplémentaire 1 film.

Pour les images confocales d’exemple, illustrés à la Figure 5, la séance d’imagerie a été terminale. Si l’imagerie longitudinale est nécessaire, l’utilisation d’un 2-photon ou multiphotonique équipée LSM microscope confocal pour l’imagerie est conseillée car il est moins photovieillissement à vie tissus^19,20.
L’imagerie mito-DP MG63 cellules exprimant dans le modèle de PuMA :

1. Effectuer le protocole PuMA comme contour dans étape 1 et 2 avec l’aide de MG63 cellules exprimant la construction mito-DP.
2. Placer la tranche de poumon dans un fond en verre 35 mm rond plat et l’image sur la microscopie confocale.
3. Les paramètres d’imagerie pour les images de l’exemple illustrés à la Figure 6 sont répertoriés dans le tableau 6. Un film représentatif d’un empilement 3D montrant les cellules fluorescentes vertes de OS rouge fluorescents mitochondries est fourni dans le film 2 et 2 film supplémentaire.

Results

Microscopie de fluorescence faible grossissement widefield

Pour la microscopie de fluorescence widefield de tranches de poumon de PuMA, images représentatives et des données de quantification sont indiquées dans la Figure 2et la Figure 4 a et B. Les propensions métastatiques des lignées de cellules métastatiques haute et basse ...

Discussion

L’article technique suivant décrit certains aspects pratiques du modèle PuMA dans l’étude de colonisation de poumon dans les OS. Certaines étapes critiques du protocole où les chercheurs devraient prendre des précautions supplémentaires sont les suivantes :

un) canulation de la trachée. La trachée peut être facilement endommagée en disséquant les muscles environnants et le tissu conjonctif. En outre, l’aiguille du cathéter peut facilement être poussé à travers la trachée. Porter une attention ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tableau 2
Réactifs de culture cellulaire pour milieux A, B et milieux complets
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	lignée cellulaire de SG hautement métastatique
HOS	ATCC	CRL-1543	lignée cellulaire de SG faiblement métastatique
MG63.3	Laboratoire Amy LeBlanc (NCI)	N/A	lignée cellulaire OS hautement métastatique
MG63	ATCC	CRL-1427	lignée cellulaire OS faiblement métastatique
10X M199 milieu	Thermofisher	11825015	Milieu de base pour A-média et milieu B
Eau distillée (stérilisée)	Thermofisher	15230-147	Composant du média A & B-media
7,5	Thermofisher	25080094	Composant de A-media & B-media
Hydrocortizone	Sigma-Alrich	H6909	Composant de A-media & B-media
Acétate de rétinol soluble dans l’eau	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Composant de A-media & B-media
Pénicilline/Streptomycine 10X solution concentrée (10000 U/ml)	Thermofisher	15140122	Composant de A-media & B-media, média complet.
Solution d’insuline bovine (10mg/ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Composant des A-media & Milieu B
DMEM, Thermofisher à haute teneur en glucose		11965092	Milieu de base du milieu complet
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher	25030081	composant du milieu complet
Sérum fœtal bovin	Thermofisher	16000044	composant du milieu complet
Dulbecco' s Thermofisher salin tamponné au phosphate		14190144	utilisé en culture cellulaire.
Hank' s Solution de sels tamponnés, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol	Thermofisher	14175095	Utilisé pour remettre en suspension les pastilles cellulaires avant l’injection
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Thermofisher	25200114	Utilisé en culture cellulaire.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Utilisé pour marquer le parenchyme pulmonaire.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 LSM confocaux	Zeiss	N/A	Microscope confocal LSM inversé
Souris SCID	River	N/A	NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, femelle, 6-8 semaines
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Utilisé comme support pour les coupes de tissu pulmonaire.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Utilisé lors de l’insufflation du poumon.
Seringue de 1 ml avec aiguille de calibre 27	Fisherscientific	14-826-87	Utilisée pour l’injection dans la veine de la queue.
Seringue de 10 ml	BD	309604	Utilisée pour l’insufflation du poumon.
Cathéter de calibre 20	Terumo	SR-OX2032CA	Utilisé lors de l’insufflation du poumon.
Kit d’extension Abbott IV (30", stérile)	Medisca	8342	Utilisé lors de l’insufflation du poumon.
Tampons imbibés d’alcool	BD	326895	Pour essuyer la veine de la queue avant l’injection
Gants chirurgicaux stériles	Fisherscientific	Varie selon la taille	Manipulation asceptique des poumons de souris Règle de
30 cm	Agrafes Utilisées		pour l’insufflation du poumon.
Support pour règle	Pipette.com	HS29022A	Utilisé pour l’insufflation du poumon.
Boîte de culture à fond de verre de 35 mm	Ibidi	81158	Utilisée lors de l’imagerie de coupes pulmonaires
Sous-couches absorbantes avec barrière étanche contre l’humidité	VWR	56617-014	Utilisée pour tapisser la zone de travail stérile dans la hotte biologique.
Catgut Plain Absorbable Suture	Braun	N/A	Utilisé pour attacher la trachée canulée.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Table 4
Instruments chirurgicaux pour PuMA
Micro Dissecting Ciseaux 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	Pour couper des sections pulmonaires
4" (10 cm) Longue Dentelée Droite Extra Délicate Pointe de 0,5 mm	Roboz	RS-5132	Pour manipuler/tenir des sections pulmonaires.
4 pouces (10 cm) Longue Dentelée Légère Courbe 0.8mm Pointe	Roboz	RS5135	Pour manipuler/tenir des sections pulmonaires.
pince à pansement pour le pouce ; Dentelé; Délicat; 4,5" Longueur ; Largeur de pointe de 1,3 mm	Roboz	RS-8120	Pour la dissection générale.
Pince à pansement pour pouce 4,5" dentelée 2,2 mm Largeur de l’embout	Roboz	RS-8100	Pour la dissection générale.
Ciseaux de dissection micro fins extra fins 3,5" Sharp / Sharp, lame de 20 mm	Roboz	RS-5880	Pour la dissection générale.
Ciseaux Knapp ; Droit; Tranchant-émoussé ; Longueur de lame de 27 mm ; Longueur totale de 4 "	Roboz	RS-5960	pour la dissection générale.