Considérations d’ordre pratiques dans l’étude de la colonisation poumon métastatique dans l’ostéosarcome, essai sur les métastases pulmonaires

Summary

L’objectif de cet article est de fournir une description détaillée du protocole pour le dosage de métastase pulmonaire (PuMA). Ce modèle permet aux chercheurs d’étudier la croissance des cellules dans les tissus pulmonaires à l’aide d’une fluorescence widefield ou microscope confocal à balayage laser ostéosarcome métastatique (OS).

Abstract

L’essai de métastase pulmonaire (PuMA) est une ex vivo explant de poumon et le système de culture de cellules fermées qui permet aux chercheurs d’étudier la biologie de la colonisation de poumon dans l’ostéosarcome (OS) par microscopie à fluorescence. Cet article fournit une description détaillée du protocole et traite des exemples d’obtenir des données d’image sur la croissance métastatique à l’aide de widefield ou plateformes de microscopie confocal fluorescence. La souplesse du modèle PuMA permet des chercheurs d’étudier non seulement la croissance des cellules d’OS dans le microenvironnement de poumon, mais aussi pour évaluer les effets de la thérapeutique anti-métastatique au fil du temps. La microscopie confocale permet l’imagerie haute résolution, sans précédent des interactions cellulaires OS avec le parenchyme pulmonaire. En outre, le modèle PuMA est associé à des colorants fluorescents ou reporters génétique de la protéine fluorescente, les chercheurs peuvent étudier le microenvironnement de poumon, les structures cellulaires et subcellulaires, la fonction du gène et l’activité de promoteur dans les cellules d’OS métastatiques. Le modèle PuMA offre un nouvel outil pour les chercheurs d’ostéosarcome à découvrir la nouvelle biologie de métastase et évaluer l’activité de nouveaux traitements anti-métastatiques et ciblées.

Introduction

Amélioration des résultats pour les patients pédiatriques atteints d’ostéosarcome métastatique (OS) reste encore une critique comblés clinique ¹. Cela souligne l’importance de développer des nouvelles thérapies moléculaires ciblées. Des agents chimiothérapeutiques classiques que la prolifération des cellules tumorales cible n’ont pas été prouvées pour être efficace dans le traitement de la maladie métastatique et donc de nouvelles stratégies doivent cibler le processus métastatique lui-même ². L’actuel article porte sur les aspects pratiques d’un type relativement nouveau de ex vivo le modèle métastase pulmonair....

Protocol

Tous les protocoles d’animaux d'où proviennent les données d’imagerie ont été effectués avec l’approbation de l’animalier et du Comité d’urbanisme de l’Institut National du Cancer, de la National Institutes of Health. Tous les protocoles animales examiné et décrit dans l’article vidéo ont été approuvés par le Comité de protection des animaux de l’Université de la Colombie-Britannique.

1. préparation des cellules tumorales pour injection et matériaux pour le modèle de PuMA

Remarque : La quantité de cellules et de la solutions sera suffisant pour 1 souris. Intensifier selon les besoins si plus de souris sont utilisée....

Results

Microscopie de fluorescence faible grossissement widefield

Pour la microscopie de fluorescence widefield de tranches de poumon de PuMA, images représentatives et des données de quantification sont indiquées dans la Figure 2et la Figure 4 a et B. Les propensions métastatiques des lignées de cellules métastatiques haute et basse .......

Discussion

L’article technique suivant décrit certains aspects pratiques du modèle PuMA dans l’étude de colonisation de poumon dans les OS. Certaines étapes critiques du protocole où les chercheurs devraient prendre des précautions supplémentaires sont les suivantes :

un) canulation de la trachée. La trachée peut être facilement endommagée en disséquant les muscles environnants et le tissu conjonctif. En outre, l’aiguille du cathéter peut facilement être poussé à travers la trachée. Porter une attention .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tableau 2
Réactifs de culture cellulaire pour milieux A, B et milieux complets
MNNG-HOS	ATCC	CRL-1547	lignée cellulaire de SG hautement métastatique
HOS	ATCC	CRL-1543	lignée cellulaire de SG faiblement métastatique
MG63.3	Laboratoire Amy LeBlanc (NCI)	N/A	lignée cellulaire OS hautement métastatique
MG63	ATCC	CRL-1427	lignée cellulaire OS faiblement métastatique
10X M199 milieu	Thermofisher	11825015	Milieu de base pour A-média et milieu B
Eau distillée (stérilisée)	Thermofisher	15230-147	Composant du média A & B-media
7,5	Thermofisher	25080094	Composant de A-media & B-media
Hydrocortizone	Sigma-Alrich	H6909	Composant de A-media & B-media
Acétate de rétinol soluble dans l’eau	Sigma-Alrich	R0635-5MG	Composant de A-media & B-media
Pénicilline/Streptomycine 10X solution concentrée (10000 U/ml)	Thermofisher	15140122	Composant de A-media & B-media, média complet.
Solution d’insuline bovine (10mg/ml)	Sigma-Alrich	I0516-5ML	Composant des A-media & Milieu B
DMEM, Thermofisher à haute teneur en glucose		11965092	Milieu de base du milieu complet
L-Glutamine (200 mM)	Thermofisher	25030081	composant du milieu complet
Sérum fœtal bovin	Thermofisher	16000044	composant du milieu complet
Dulbecco' s Thermofisher salin tamponné au phosphate		14190144	utilisé en culture cellulaire.
Hank' s Solution de sels tamponnés, sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol	Thermofisher	14175095	Utilisé pour remettre en suspension les pastilles cellulaires avant l’injection
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Thermofisher	25200114	Utilisé en culture cellulaire.
DAR4M	Enzo	ALX-620-069-M001	Utilisé pour marquer le parenchyme pulmonaire.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 3
Materials for PuMA
Zeiss 710 Confocal LSM	Zeiss	N/A	Upright LSM confocal microscope
Zeiss 780 LSM confocaux	Zeiss	N/A	Microscope confocal LSM inversé
Souris SCID	River	N/A	NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl, femelle, 6-8 semaines
GelFoam	Harvard Apparatus	59-9863	Utilisé comme support pour les coupes de tissu pulmonaire.
SeaPlaque Agarose	Lonza	50100	Utilisé lors de l’insufflation du poumon.
Seringue de 1 ml avec aiguille de calibre 27	Fisherscientific	14-826-87	Utilisée pour l’injection dans la veine de la queue.
Seringue de 10 ml	BD	309604	Utilisée pour l’insufflation du poumon.
Cathéter de calibre 20	Terumo	SR-OX2032CA	Utilisé lors de l’insufflation du poumon.
Kit d’extension Abbott IV (30", stérile)	Medisca	8342	Utilisé lors de l’insufflation du poumon.
Tampons imbibés d’alcool	BD	326895	Pour essuyer la veine de la queue avant l’injection
Gants chirurgicaux stériles	Fisherscientific	Varie selon la taille	Manipulation asceptique des poumons de souris Règle de
30 cm	Agrafes Utilisées		pour l’insufflation du poumon.
Support pour règle	Pipette.com	HS29022A	Utilisé pour l’insufflation du poumon.
Boîte de culture à fond de verre de 35 mm	Ibidi	81158	Utilisée lors de l’imagerie de coupes pulmonaires
Sous-couches absorbantes avec barrière étanche contre l’humidité	VWR	56617-014	Utilisée pour tapisser la zone de travail stérile dans la hotte biologique.
Catgut Plain Absorbable Suture	Braun	N/A	Utilisé pour attacher la trachée canulée.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Table 4
Instruments chirurgicaux pour PuMA
Micro Dissecting Ciseaux 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	Pour couper des sections pulmonaires
4" (10 cm) Longue Dentelée Droite Extra Délicate Pointe de 0,5 mm	Roboz	RS-5132	Pour manipuler/tenir des sections pulmonaires.
4 pouces (10 cm) Longue Dentelée Légère Courbe 0.8mm Pointe	Roboz	RS5135	Pour manipuler/tenir des sections pulmonaires.
pince à pansement pour le pouce ; Dentelé; Délicat; 4,5" Longueur ; Largeur de pointe de 1,3 mm	Roboz	RS-8120	Pour la dissection générale.
Pince à pansement pour pouce 4,5" dentelée 2,2 mm Largeur de l’embout	Roboz	RS-8100	Pour la dissection générale.
Ciseaux de dissection micro fins extra fins 3,5" Sharp / Sharp, lame de 20 mm	Roboz	RS-5880	Pour la dissection générale.
Ciseaux Knapp ; Droit; Tranchant-émoussé ; Longueur de lame de 27 mm ; Longueur totale de 4 "	Roboz	RS-5960	pour la dissection générale.