Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

Résumé

Ce protocole sert un régime pour la mise en place d’un système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses et leur utilisation ultérieure, en particulier pour étudier le rôle des protéines de culture cellulaire tumorale dans le recrutement des monocytes/macrophages pour le microenvironnement tumoral.

Résumé

siARN et médiation shARN démantelez méthodes (KD) de régulation de l’expression des gènes sont des outils précieux pour comprendre la fonction de gènes et des protéines. Toutefois, dans le cas que le KD de la protéine d’intérêt a un effet létal sur les cellules ou les effets anticipés de la KD sont dépendante du temps, inconditionnels des méthodes KD ne conviennent pas. Conditionnelles systèmes conviennent mieux dans ces cas et ont fait l’objet de beaucoup d’intérêt. Il s’agit de systèmes de surexpression inductible par l’Ecdysone, Cytochrome P-450 induction système¹, et la tétracycline régulé systèmes d’expression de gène.

Le système d’expression de gène tétracycline réglementé permet contrôle réversible surexpression de la protéine par induction de l’expression de shARN en présence de tétracycline. Dans ce protocole, nous présentons un modèle expérimental à l’aide de système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines conditionnelle règlement d’expression de gène. Ensuite, nous montrent l’utilisation de ce système dans l’étude de l’interaction cellule-monocyte tumeur.

Introduction

Macrophages (EAPV) de la tumeur associée contribuent au développement de la tumeur en favorisant la croissance des tumeurs, métastases et régulation de la réponse immunitaire². Monocytes inflammatoire recrue, qui infiltrent la tumeur et se différencient en pro-tumorigènes TAMs³en cellules cancéreuses. Infiltration de la tumeur avec TAMs est en corrélation avec des résultats cliniques pauvres et a été liée au rôle immunosuppresseur sur les macrophages^4,5. Cependant, les mécanismes du recrutement de macrophages à la tumeur ne sont pas bien explorés et une meilleure....

Protocole

La section protocole qui utilise des monocytes humains obtenus à partir des volontaires en bonne santé suit les directives de hôpital Los Angeles Human Research Ethics Committee l’HME et a été approuvée par l’Institutional Review Board sous le matériel humain Numéro de protocole : CCI 08-00208.

1. préparation des lignées de cellules cancéreuses avec réglé par la tétracycline shARN Expression

1. Clonage de shARN PAI-1 en vecteur de Tet-pLKO-puro ^{8 , 9}
   1. Concevoir des oligomères de shARN qui contiennent l' âgedu site EcoRI clivage et j’a....

Résultats

Trois séquences de shARN ont été testés pour le KD plus efficace de PAI-1. Pour ce faire, séquences de shARN contre PAI-1 et brouillés (tableau 1) ont été clonées dans le vecteur d’expression de Tet-pLKO-puro suivant le protocole décrit ci-dessus. La lignée de cellules HT-1080 Fibrosarcome a été transfectée stablement avec constructions générées et les cellules ont été traitées avec la doxycycline pendant 3 jours. L’expression du PAI-1 a été vérifiée par Western Blot

Discussion

Composé d’une variété de types de cellules, le TME est crucial pour le développement du cancer. Afin de déterminer les conditions optimales de croissance, les cellules cancéreuses attirent les monocytes par sécrétion de facteurs chimiotactiques. Nous présentons ici un protocole pour l’étude du mécanisme de recrutement de monocytes par des cellules tumorales in vitro. À cette fin, une combinaison de système d’expression de gène inductible, purification des monocytes humains primaires et à titre d’exemple d’un tes.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vecteur lentiviral Tet-pLKO-puro	Addgene	21915
FBS (sans tétracycline)	Omega Scientific	FB-15
Histopaque	Sigma	10771-500ML
EasySep Kit d’enrichissement de monocytes humains	StemCell	19059
EasySep Magnet	StemCell	18002
EcoRI HF	NEB	R3101S
AgeI HF	NEB	R3552S
Cut Smart buffer	NEB	B7200S
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System	PROMEGA	A9281
psPAX vector	Addgene	12260
pMD2.G vector	Addgene	12259
One Shot Stbl3 Chimiquement compétent E. coli	Thermo Fisher Scientific	C737303
Hema 3 kit de coloration pour protocole de coloration Wright-Giemsa		123-869
cellules HEK293	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
Enzyme de restriction XhoI	NEB	R0146S
Ligase	NEB	M0202S
Tampon Ligase	NEB	M0202S
EDTA 0,5 M solution	Thermo Fisher Scientific	R1021
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
The Big Easy" EasySep	Magnet Stem Cell	18001
0,1 % Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Acétate	de sodium Sigma-Aldrich	S7670
Butyrate de sodium	Sigma-Aldrich	B5887
0.45 &mu ; Filtres à seringue M	VWR International	28145-479
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881-500g
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)	Invitrogen	15504-020
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653-5 kg
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266-100g
dithioérythritol (DTE)	Sigma-Aldrich	B8255-5g
éthanol (EtOH)	Sigma-Aldrich	792780
tryptone	Amresco	J859-500g
extrait de levure	Fluka	70161-500g
Bacto	agar BD	214010
ampicilline	Sigma-Aldrich	A9393-5g
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Corning	21-031-CV
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
puromycine	Sigma-Aldrich	P9620
Hyclate de doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Corning	10-040-CV
0,5 M EDTA pH 8,0	Thermo Fisher Scientific	R1021
Falcon Support perméable pour plaque à 24 puits avec 8,0&mu ; m Membrane PET Transparente	Becton Dickinson	353097
Albumine Sérique Bovine	Sigma-Aldrich	A7906
Applicateur à pointe de coton  ;	Medline	MDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack  ;	Fisher Scientific Company	123-869
Huile d’immersion Resolve, haute viscosité	Richard Allan Scientific	M4004
Pénicilline Streptomycine	Gibco	15140122