Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Techniques pour étudier l’anatomie du système visuel Ant

13.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/56339

⸱

27 novembre 2017

 ,  , 
1Research School of Biology, Australian National University, 2Department of Biological Sciences, Macquarie University

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un ensemble de méthodes en microscopie photonique et électronique pour étudier l’anatomie de le œil interne et externe des insectes. Il s’agit de plusieurs techniques traditionnelles, optimisés pour le travail sur les yeux fourmi, détaillée et dépannage ainsi que des propositions d’optimisation pour les différents spécimens et les régions d’intérêt.

Résumé

Cet article décrit un ensemble de méthodes en microscopie photonique (LM) et la microscopie électronique (EM) qui peut être utilisée pour étudier l’anatomie de le œil interne et externe des insectes. Il s’agit de techniques histologiques traditionnelles optimisé pour le travail sur les yeux de fourmi et adapté pour travailler de concert avec d’autres techniques telles que la microscopie électronique à transmission (TEM) et microscopie électronique à balayage (SEM). Ces techniques, bien que très utile, peuvent être difficiles pour la microscopie de novice, alors l’accent a été placé dans cet article sur le dépannage et l’optimisation pour les différents échantillons. Nous fournir des informations sur les techniques d’imagerie pour l’échantillon entier (photo-microscopie et SEM) et discuter de leurs avantages et leurs inconvénients. Nous mettre en évidence la technique utilisée dans la détermination des diamètres de lentille pour le œil entier et discuter des nouvelles techniques d’amélioration. Enfin, nous discutons techniques intervenant dans la préparation des échantillons pour LM et TEM, coupes, coloration et imagerie de ces échantillons. Nous discutons les obstacles que l'on peut trouver dans quelle préparation des échantillons et la meilleure façon de naviguer autour d’eux.

Introduction

Vision est une modalité sensorielle importante pour la plupart des animaux. Vision est particulièrement cruciale dans le contexte de la navigation pour repérage buts, établissant et adhérant aux liaisons et l’obtention des informations boussole1,2. Détecter des informations visuelles à l’aide d’une paire d’yeux composés des insectes et, dans certains cas, yeux simples placés sur le dos d’un à trois appelés ocelles3,4,5.

Aux yeux des fourmis sont particulièrement intéressants parce que, tandis que les fourmis sont merveilleusement variés, ils conservent certaines caractéristiques clés selon les espèces. Malgré une variation dramatique dans l’anatomie, la taille et l’écologie, la grande majorité des espèces est eusocial et vive en colonies ; ainsi, différentes espèces rencontrent des défis visuels similaires en ce qui concerne la navigation en arrière entre les ressources et une place centrale. Dans l’ensemble de fourmis le même bauplan base oeil peut être observé dans animaux allant de 0,5-26 mm de longueur, d’exclusivement diurne d’espèces strictement nocturnes et de la lente marche souterraine à sauter des prédateurs visuels6,7, 8,9,10. Toutes ces différences stupéfiantes en écologie et comportement donnent lieu à des permutations innombrables des structures oculaires base même en fonction des différents environnements, modes de vie et tailles11,12. Par conséquent, étudier l’écologie visuelle des fourmis fournit une véritable mine d’or de possibilités à l’enquêteur déterminé.

Comprendre le système visuel des insectes est essentielle pour obtenir un aperçu de leurs capacités comportementales. Cela ressort des études intégrées qui combinent joliment anatomie avec l’écologie et le comportement d’un grand succès dans quelques groupes d’insectes (p. ex., références13,14,15,16, 17). bien que le domaine de la navigation de la fourmi et le comportement de la fourmi en général a été très réussi, très peu a insisté sur la vision de la fourmi en dehors de quelques espèces sélectionnées. Ici, nous élaborerons sur les techniques impliquées dans l’enquête sur la conception d’oeil de fourmis. Alors que nous nous concentrerons sur les fourmis, ces techniques peuvent être appliquées, avec de légères modifications, pour les autres insectes, trop.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. préparation de l’échantillon

Remarque : Il faut d’abord comprendre l’emplacement relatif des yeux composés et ocelles les uns aux autres et sur la tête. Ceci peut être réalisé en faisant l’acquisition des images de la vue dorsale de la tête. Pour ce faire, nous vous recommandons d’échantillons de traitement pour la photomicrographie ou en utilisant des techniques de SEM. Ci-dessous les étapes sont impliquées dans ces deux processus.

  1. Prélèvement d’échantillons
    1. Collecter et stocker les échantillons directement dans l’éthanol à 70 %. Recueillir les différentes castes lorsque cela est possible.
    2. Étiqueter les échantillons avec heure, date et de placer ainsi que toutes autres observations pertinentes (p. ex., recueillis lors de recherche de nourriture, agrégation, l’accouplement nichent à l’intérieur d’une brindille, etc.)
    3. Recueillir assez de spécimens pour avoir plusieurs répétitions à chaque traitement.
  2. La photomicrographie et Z d’empilage
    1. Air secs spécimens et montez-les sur les cartes de points triangulaires, à l’aide de la colle soluble dans l’eau, puis sur une insecte broche. Pour plus d’informations, voir référence18.
    2. Image en utilisant un stéréomicroscope de fort grossissement avec une Z-commande de moteur et d’une caméra couleur.
    3. Utilisez un diffuseur pour avoir un éclairage uniform pour les spécimens.
    4. Capturer des images à différents plans focaux et enregistrer des images dans un format de fichier sans perte (comme tiff) et la pile de mise au point eux à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce.
  3. La microscopie électronique à balayage
    NOTE : Nettoyer soigneusement tous les outils et les surfaces de travail avec de l’éthanol pour éviter la contamination de l’échantillon avec la poussière et autres particules.
    1. Déshydrater pendant la nuit les spécimens dans l’éthanol et de l’air sec dans une boîte de Pétri.
    2. Utilisez une lame de rasoir tranchante pour séparer la tête du reste du corps.
    3. Monter la tête à l’angle de vision nécessaire (p. ex., dorsale vers le haut) sur les talons en aluminium à l’aide de ruban de carbone conductrices ou des tabulations. Couper le ruban de carbone en fines lanières et pliez-la pour prendre en charge de la capsule céphalique.
    4. Utilisez une coucheuse par pulvérisation cathodique pour appliquer l’or à la surface de l’échantillon pendant 2 min à 20 mA avec un étage rotatif. Le temps et le courant peuvent devoir être ajustée selon l’instrument.
    5. Transfert des spécimens à un nouveau talon en aluminium avec ruban carbone fraîches ou des tabulations.
      Remarque : Le carbone non revêtu fournira un fond noir mais transférer des spécimens peut endommager le revêtement or.
    6. Vérifiez que l’orientation de l’échantillon est encore correcte à l’aide d’un microscope à dissection et ajustez au besoin avec une paire de pince fine ou un outil similaire. Prendre soin de ne pas pour rayer le revêtement d’or ; poignée en aussi peu que possible.
    7. Charger les échantillons sur le support de talon de SEM, prenant note de la position des talons et des spécimens par rapport à l’autre.
      Remarque : Certains SEMs sont équipés d’une caméra de la scène mais beaucoup ne le sont pas, et il peut être difficile de localiser les petits spécimens à fort grossissement.
    8. Les spécimens de l’image. Utilisez une faible tension d’accélération pour éviter la charge et une petite ouverture pour la bonne profondeur de champ.
      Remarque : Les paramètres sont mieux optimisés en consultation avec un technicien spécialisé dans l’instrument particulier utilisé.

2. quantifier la facette nombre et le diamètre

  1. Répliques de la cornée
    1. Utilisez les fourmis conservés dans de l’éthanol ou monté sur une broche à cet effet (étape 1.1.1).
    2. Monter l’animal sur une insecte broche ou sur la pâte à modeler. Si la tête est relativement importante, les autres parties du corps s’éliminent.
    3. Utilisez une insecte broche ou un cure-dent fin pour ramasser une petite goutte de vernis à ongles incolore-séchage rapide et l’étaler rapidement sur le œil. S’assurer que la goupille ne raye pas le œil. Le vernis à ongles devrait couvrir l’oeil entier et certains de la capsule céphalique environnante.
      Remarque : Il est important que le vernis à ongles soient d’épaisseur relativement uniforme dans l’ensemble de le œil.
    4. Laisser le vernis à ongles pour régler à la température ambiante.
    5. Une fois que c’est entièrement définie, utilisez une épingle insecte pour soulever doucement la réplique de la capsule entourant le œil.
    6. Une belle paire de pinces propres permet de soulever le réplica, saisissez la partie du réplica qui couvre la tête et pas le œil.
    7. Assurer la prise de conscience de l’orientation de l’oeil : la région antérieure, postérieure, dorsale et ventrale.
    8. Déposer la réplique sur une lame de verre. Utilisez une lame de rasoir pour couper la réplique en enlevant soigneusement le matériau excédentaire autour de le œil. Utiliser une aiguille ou une paire de pinces pour empêcher le mouvement de la réplique.
    9. Si le œil est très convexe, utilisez une lame de rasoir pour faire 3-4 fines incisions radiales partielles autour du bord pour aider à « aplatir » la réplique. Si le œil est relativement « plat », il n’y a pas besoin de faire ces incisions.
    10. Placez une lamelle couvre-objet doucement sur le réplica de le œil, veiller à ce que l’orientation de la réplique est connue. N’appliquez pas de pression, car cela permet d’éliminer l’impression cornée sur le vernis à ongles.
    11. Sceller la lamelle à l’aide de vernis à ongles très peu sur les quatre coins. Si le vernis à ongles s’écoule entre la lamelle couvre-objet et les lames de verre, cela endommagera la réplique.
    12. Image de la diapositive sur un microscope composé.
      Remarque : si seulement certaines facettes sont en discussion, cela suggère alors que la réplique de le œil est aplatie pas assez. Jeter et recommencer à l’étape 2.1.3.
    13. Importer l’image dans les programmes librement disponibles comme ImageJ/Fidji, où le nombre des ommatidies et taille de chaque ommatidie peuvent être mesurées.
      NOTE : Cette méthode peut être utilisée pour préparer des répliques des ocelles, trop. Puisque c’est une lentille unique, nous vous recommandons de garder tous les ocelles ensemble dans un réplica.

3. analyse de la Structure de l’oeil

Remarque : Afin d’étudier l’anatomie de l’oeil nécessite dans la plupart des cas deux techniques complémentaires de LM et TEM. Les étapes du traitement initial nécessitent des techniques similaires pour LM et TEM. La différence se pose dès la phase sectionnement. Échantillons de traitement nécessite l’utilisation de produits chimiques dangereux qui doivent être manipulés avec soin et mis au rebut de manière responsable. Utiliser les équipements de protection individuelle, travailler sous une hotte, toujours lire les sheets(SDS) de données de sécurité et procéder à l’évaluation des risques avant de commencer.

  1. Dissection
    1. Anesthésier les spécimens en refroidissant ou par l’exposition aux gaz CO2.
      1. CO2 anesthésie est très rapide (généralement moins de 1 min) et il faut éviter une surexposition car cela peut entraîner la mort du spécimen. Si vous utilisez des pellets de glace (solide CO2) éviter tout contact direct avec des spécimens car cela peut causer des brûlures de froids.
      2. L’anesthésie froid est plus lente ; 4 ° C est suffisante, et des températures plus froides sont déconseillées. Établir un temps de refroidissement approprié pour l’espèce. Froids ou grandes fourmis résistantes comme les fourmis bull peuvent exiger > 10 min pour devenir complètement immobilisée, tandis que les espèces plus petites n’aurez besoin que 1-2 min. de refroidissement excessif va tuer le spécimen (éviter le contact direct avec de la glace). Spécimens devraient préférablement être contenus dans des récipients en plastique, petits bouchon de mousse et placés dans une glacière où ils peuvent être observés, plutôt que dans un congélateur ou un réfrigérateur électrique.
    2. Placer l’échantillon sur une boîte de Pétri et ajuster pour un affichage sous un microscope à dissection. Travailler rapidement est important pour préserver l’anesthésie et d’éviter la dégénérescence du tissu une fois que les incisions sont faites (ce peut) arriver quelques secondes.
    3. Retirer les antennes avec une pince. Si vous travaillez avec un insecte perçant, il est conseillé d’amputer le gaster tout d’abord pour éviter de se faire piquer.
    4. Enlever les parties de la bouche à l’aide d’une lame de rasoir tranchante ; forceps peut servir à maintenir le spécimen. Couper à travers la partie antérieure de le œil (gros spécimens) ou aussi près des yeux que possible (petites éprouvettes) sans tirant sur le cerveau comme cela peuvent déchirer la rétine.
    5. Se préparer à ouvrir la capsule céphalique. Angle de l’échantillon alors que la première incision est dirigée vers le haut ; Cela peut être fait soit sous le microscope à dissection tout en tenant le spécimen à pinces ou sous contrôle visuel tout en maintenant l’échantillon entre le doigt du pouce et de la fore.
    6. Faire une incision transversale à travers la tête pour enlever la portion ventrale de la tête ; partie de le œil ventrale peut être retiré de grandes espèces afin d’améliorer la fixation et l’infiltration. La tête doit toujours être attachée au corps à ce stade.
    7. Rompre la capsule céphalique de l’organisme en faisant une incision coronale juste en arrière de le œil composé.
    8. Placer la capsule céphalique disséquée avec les yeux composés dans le fixateur froid glace : paraformaldéhyde glutaraldéhyde et 2 % à 2,5 % dans un tampon phosphate (pH 7,2 à 7,5).
      ATTENTION : Le fixateur est corrosif et toxique ; porter une protection appropriée et travailler sous une hotte.
      Remarque : Il est important de travailler rapidement pour arrêter la dégénérescence des tissus nerveux. La dissection doit être rempli en 2 min ou moins (dissection efficace peut exiger certaines pratiques).
      Remarque : Si le œil doit être adaptée aux conditions lumineuses ou sombres, puis exposer d’abord les animaux à l’état lège nécessaire pendant quelques heures. Réaliser la dissection dans les conditions de lumière respectifs. Les dissections peuvent être effectuées sous feux rouges pour simuler des ténèbres.
  2. Traitement des échantillons
    1. Conserver les échantillons dans le fixateur à température ambiante avec motion dans un agitateur orbital, de gros spécimens de 2 h. peuvent exiger plus longs temps de fixation.
    2. Retirez le fixateur et jeter correctement. Laver les spécimens dans un tampon phosphate (3 fois, 5 min chacun) température ambiante sur l’agitateur.
      Remarque : Le tampon de phosphate est composé de 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g Na2HPO4et 0,244 g KH2PO4 dans 1 L de distillée H2O (pH 7,2).
    3. Retirer le tampon phosphate et ajouter 2 % OsO4. Placer le bocal de spécimen sur le vibreur dans la hotte de laboratoire pendant 1-2 h. Il s’agit d’une étape après fixation pour fixer les graisses et aussi offrir un contraste pour TEM.
      NOTE : Temps de fixation d’Osmium sont sous réserve de la taille de l’échantillon ; une règle approximative, calculer 1 h de fixation par 1 mm3.
    4. Enlever la solution de l’osmium et disposer de façon appropriée. Laver les spécimens dans un tampon (3 fois, 5 min chacun) de la température ambiante sur l’agitateur.
    5. Déshydrater les spécimens en les plaçant dans l’augmentation des concentrations d’éthanol ou d’acétone ; par exemple, 50, 70, 80 et 95 % pour 10 min chacun et enfin 100 % (2 fois 15 min chacun). Placer les spécimens sur le vibreur entre les changements de la solution.
      Remarque : Si nécessaire, échantillons peuvent être conservés dans l’éthanol à 70 % du jour au lendemain.
    6. Égoutter l’éthanol et ajouter 100 % acétone. Laissez-le pendant 20 min sur le shaker (sauter cette étape si la déshydratation dans l’acétone). Remplacez l’acétone frais et laissez-le pendant une 20 mn supplémentaire.
    7. S’infiltrer dans les tissus avec la résine en utilisant les ratios suivants d’acétone à résine : 2:1 (3 h), 1:1 (nuit), 1:2 (4 h) et résine pure (la nuit). À chaque étape laisse spécimens sur le vibreur à l’intérieur de la hotte et culot le conteneur pour tous sauf les deux dernières étapes.
      Remarque : La résine est trop visqueuse pour être vidangé pour spécimens doivent être déplacés vers un nouveau conteneur jetable à chaque étape.
    8. Préparer des blocs pour monter les échantillons. Blocs peuvent être personnalisés réalisés par découpe de verre acrylique en petits blocs rectangulaires (1,5 x 0,5 x 0,3 cm). Blocs peuvent également être faites par verser la résine époxyde (il y a beaucoup de kits commerciaux disponibles) dans un moule silicone et guérir puis au four pendant 12-14 h à 60 ° C.
      ATTENTION : Non durci résine (liquide) est cancérigène et doit être retourné au four jusqu'à ce que complètement durci.
    9. Placez le bloc verticalement dans le moule. Soigneusement prendre les spécimens de la résine liquide, permettre des excès de résine drainer et placez l’échantillon sur le dessus du bloc. Une petite quantité de résine supplémentaire peut être utilisée pour lier le spécimen au bloc.
    10. Le bloc de l’étiquette. Imprimer les étiquettes de papier et incorporez-le dans le bloc ou attachez-le à une face du bloc.
    11. Garder le moule avec les blocs incorporés dans le four pendant 12-14 h à 60 ° C.
    12. Stocker le bloc de spécimen dans une enveloppe propre. Cela peut être stocké de cette façon pendant plusieurs mois à années.
    13. Laissez les contenants usagés, des gants sales et autre matériel contaminé dans la hotte de laboratoire pour permettre à l’acétone s’évapore complètement (minimum 12 h).
    14. Résine de cure dans le four avant de jeter des équipements jetables ou grattage résine hors autres éléments tels que des pinces.
  3. Sectionnement
    1. Observer le bloc sous le microscope à dissection pour s’assurer que l’orientation de l’échantillon est appropriée pour le plan de coupe.
    2. Si l’orientation n’est pas appropriée, utiliser la scie de bijoutier pour découper le spécimen et de réorienter l’utilisation de fragments de set résine et résine fraîche pour repositionner le spécimen. La tête peut également être divisée en deux moitiés à l’article les deux yeux séparément. Polymériser la résine à nouveau avant de procéder.
    3. Montez le bloc sur le mandrin amovible microtome. Retirer le mandrin et placer sur le support.
    4. Coupez le bloc de résine à l’aide d’une lame de rasoir sous le microscope à dissection.
      ATTENTION : Ne le faites pas quand le mandrin est monté sur le bras du microtome car il peut secouer le bras et endommager les roulements.
    5. Remonter le mandrin sur le bras du microtome et l’angle de l’échantillon.
    6. Monter le couteau sur le support situé à l’angle approprié (0° pour verre couteaux, voir les instructions du fabricant pour les couteaux diamant).
      NOTE : Verre couteaux peut être faite à un prix avantageux avec un verre de coutelier, mais doit être remplacé périodiquement car ils perdent leur avantage ; couteaux diamant de haute qualité peut être achetés mais est chers, nécessite un soin particulier et ne conviennent pas pour les débutants.
    7. Remplir le bateau de couteau avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue équipée d’un filtre (taille des pores 0,45 µm).
    8. Remplir le bateau jusqu'à ce que le niveau d’eau atteigne le bord du couteau ; le ménisque peut être convexe dans d’autres domaines du bateau.
    9. Vider le bateau jusqu'à ce que le ménisque est très légèrement concave, mais toujours atteint le bord du couteau. Le niveau de l’eau est réglable en un point quelconque, mais toujours loin du bord du couteau.
    10. Soigneusement, mettre le couteau vers le spécimen et aligner le bloc au couteau. C’est mieux fait lentement, régulièrement vérifier la proximité du couteau à travers l’oculaire et de côté.
      Remarque : Consultez le Guide de l’instrument pour obtenir des instructions spécifiques comme instruments varient.
    11. Définir l’épaisseur de la section sur le microtome. Choisir l’épaisseur appropriée sera tributaire de la taille de l’échantillon, région d’intérêt et le genre de couteau utilisé.
    12. Si à l’aide d’un couteau verre sélectionnez un réglage plus élevé (p. ex., 4 µm), si un grand nombre de matériel doit être éliminé avant d’atteindre la zone d’intérêt. Si un couteau diamant est utilisé ou si l’échantillon est très petit, 1-2 µm peut être plus approprié.
    13. Démarrer la « coupe » (démarrage la roue microtome) lorsque le couteau est étroit mais ne pas encore couper dans l’échantillon pour effectuer la dernière partie de l’approche. Sections devraient commencent à apparaître dans quelques rotations ; Si ce n’est pas le cas, arrêter et très soigneusement rapprocher le couteau un peu plus.
    14. Ajuster la section collecte de quelle épaisseur (1 µm pour les sections minces semi) approchant de la région d’intérêt.
    15. Collecter toutes les sections à l’aide d’un outil de cils.
      Remarque : Les outils de cils peuvent être faits avec un cil monté sur un bâton mince avec vernis à ongles.
    16. Si beaucoup de matière à enlever, laisser les sections d’accumuler et de supprimer massivement en enlevant le couteau et en évacuant l’eau. Si vous utilisez un couteau de verre, c’est peut-être le moment de changer pour une nouvelle section du couteau ou un nouveau couteau.
    17. Place une série de petites gouttelettes d’eau distillée dans une diapositive à l’aide d’une pipette Pasteur ou idéalement, le filtre équipé de seringue.
    18. Soigneusement flotter la section recueillie sur les cils sur la goutte d’eau.
    19. Recueillir des mèches comme cela jusqu'à ce qu’il y a lieu de vérifier la profondeur de coupe.
      Remarque : Bien qu’il peut être fastidieux, il est toujours préférable de vérifier souvent.
    20. Placer la lame sur une plaque chauffante réglée à 60 ° C. Permettre à toute l’eau s’évapore et la section d’adhérer à la diapositive.
    21. Teindre des sections avec toluidine bleu pour 10-60 s (temps de coloration varie avec l’épaisseur de coupe). Diluer le colorant avec une seringue équipée d’un filtre (voir ci-dessus).
    22. Déposez une goutte de colorant à une extrémité de la lame et l’étaler à l’aide du côté de l’aiguille sans la toucher ou de gratter les sections. Placer la lame sur la plaque chauffante pendant environ 10-20 s.
    23. Rincer la lame en vaporisant avec de l’eau distillée dans un flacon laveur et placez-le sur la plaque chauffante pour le sécher.
    24. Vérifier au microscope composé et leur image.
    25. Répétez jusqu'à ce que la région d’intérêt est atteint.
    26. Pour les sections ultra-minces : définir l’épaisseur de coupe entre 40 et 60 nm pour recueillir les tronçons TEM.
    27. Coupe de 3 à 5 sections et épaisseur de vérifier à l’aide d’un nuancier de brouillage. Sections devraient refléter gris clair vu sous un angle.
      Remarque : Les vapeurs de chloroforme peuvent être reversés sections pour se détendre tout plis. C’est le plus pertinent pour les utilisateurs expérimentés et les débutants ne doivent pas s’inquiéter. Trop chloroforme sorti trop près de la section peut endommager les sections.
    28. Ramasser une grille sous enduit Formvar, cuivre, qui s’est tenue avec une pince Formvar, face vers le haut. Veillez à ne pas percer le revêtement Formvar.
    29. Tremper la grille dans le bateau latéralement et à l’écart les sections, puis mettre la grille en place parallèlement à la surface sous les sections. Si nécessaire utiliser le CIL pour guider les sections sur la grille.
    30. Tamponnez délicatement autour de la pointe de la pince avec filtre en papier pour absorber l’eau coincée entre les bras. Si ce n’est pas fait, tension de l’eau peut tirer la grille vers le haut entre les branches ou à s’en tenir à l’écart. Cela peut entraîner une contamination ou détérioration mécanique.
    31. Retirer délicatement l’excès d’eau de la grille elle-même par permanent la grille ergot sur papier filtre.
    32. Placer la grille dans un support de grille.
    33. Répétez jusqu'à ce que suffisamment sections ont été collectées.
    34. Sections minces semi peuvent être photographiées directement avec n’importe quel microscope composé équipé d’une caméra. Huile d’immersion peut être placé directement sur les sections. Diapositives doivent être stockés dans une boîte de diapositive pour éviter la décoloration.
  4. Coloration section ultra-mince pour un contraste TEM
    Remarque : Les étapes suivantes devraient effectués sous le couvert comme les colorants sont légères et sensibles de CO2 . En outre, les colorants EM utilisent des métaux lourds pour produire le contraste et sont donc des substances dangereuses. Appropriée il faut lors de la manipulation de ces taches.
    1. Couvrir quelques grandes boîtes de Pétri avec papier d’aluminium pour bloquer la lumière. Travailler sous ces pour les étapes suivantes. Partiellement découvrir afin de laisser un espace de travail, mais remettez les couvercles sur dès que possible.
    2. Couper un morceau de film de cire et placez-la cinq gouttes d’acétate d’uranyle saturée de 6 % à ce sujet à l’aide d’une pipette Pasteur.
      1. Pour préparer la solution, mélange acétate d’uranyle 2 g avec 100 mL de méthanol 50 % dans l’eau distillée et filtrer la solution avant de l’utiliser. La solution ne peut être stockée et convient de frais chaque fois19.
    3. Ramasser soigneusement les grilles TEM avec forceps et balance sur le dessus des gouttelettes de colorant avec le côté de la section vers le bas. Laissez pendant 25 min.
    4. Rincez les grilles individuellement en les plongeant rapidement dans et hors de l’eau distillée ; progrès réalisés par le biais de quatre différents flacons d’eau distillée.
    5. Placez cinq gouttes de citrate de plomb sur une feuille fraîche de film. Organiser quelques pastilles de NaOH autour les gouttes de colorant (cela absorbe atmosphériques de CO2 pour empêcher la précipitation du carbonate de plomb).
      1. Pour rendre la solution de citrate de plomb, préparer l’eau bi-distillée par l’eau distillée bouillante pour 0,5 h. autoriser l’eau refroidir et dans un récipient refermable, ajouter citrate de plomb 0,3 g pour 100 mL de l’eau bi-distillée. Ajouter 1 mL 10 M NaOH, fermer le récipient hermétiquement et secouez jusqu'à dissous19.
    6. Placer les grilles sur les gouttes de teinture comme décrit en 4.3 et couverture. Détachant pendant 5 min.
    7. Rincer à l’eau distillée comme avant en plongeant les grilles dans et hors de l’eau distillée 20 fois. Progrès réalisés par le biais de trois navires de l’eau distillée.
    8. Imprégnez-vous de l’égoutter avec du papier filtre et laisser les grilles sécher dans une maille.
    9. Image dans un TEM à faible tension d’accélération.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Les méthodes décrites ici permettent une étude détaillée des simples et des yeux composés des fourmis. La vue dorsale de la tête à l’aide de techniques de la photomicrographie Z-pile d’imagerie permet d’obtenir un aperçu de la présentation du système visuel (Figure 1). Il s’agit d’une bonne préparation pour les dissections et pour déterminer l’angle de coupe souhaité. Cette technique est également utile pour prendre des mesures telles que la largeur de la têt...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La suite des méthodes décrites ci-dessus permettent une enquête efficace sur le système optique de fourmis et autres insectes. Ces techniques d’informent notre compréhension de la résolution d’échantillonnage, une sensibilité optique et sensibilité potentielle de polarisation de le œil à l’étude. Cette connaissance fournit une base importante pour physiologique et comportementaux enquête sur leurs capacités visuelles. En outre, alors que les méthodes détaillées ici ont mis l’accent sur les systèmes visuels de fourmi, ces...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Jochen Zeil, Paul Cooper et Birgit Greiner pour partager leurs connaissances en anatomie insecte et pour avoir fait preuve de plusieurs des techniques que nous avons décrit ici. Nous sommes reconnaissants envers le personnel talentueux et de soutien au Centre de microscopie de pointe à ANU et microscopie de l’appareil à MQU. Ce travail a été soutenu par une bourse d’études supérieures de FRE et aux dons de l’Australian Research Council (DE120100019, FT140100221, DP150101172).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FourmiMyrmecia midas
StéréomicroscopeLeica M205 FA
Revêtement par pulvérisation cathodiquePro Sci Tech
EthanolSigma Aldrich
Boîte de PétriProSciTech
Microscope de dissectionLeica MZ6
Insect PinProSciTech
Vernis à ongles incoloreSans marque : de n’importe quel magasin
LameProSciTech
Lame de rasoirProSciTech
ForecepsProSciTech
Cover slipProSciTech
Microscope composéLeica DM5000 B
GlutaraldéhydeSigma Aldrich
ParaformalydéhydeSigma Aldrich
Chlorure de potassium (KCl)Sigma Aldrich
(Na2HPO4)Sigma Aldrich
Di-Hydrogen Phosphate de potassium (KH2PO4)Sigma Aldrich
Sodium Chlorure (NaCl)Sigma Aldrich
Osmium tétroxydeSigma Aldrich
AcétoneSigma Aldrich
Araldite Résine époxySigma Aldrich
Toluidie BlueSigma Aldrich
HotplateRiechert HK120
de cosmétiques de verre Hydrogène di-sodique Pasteur pipette Sigma Aldrich

Références

  1. Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
  2. Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
  3. Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
  4. Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
  5. Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
  6. Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
  7. Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
  8. Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
  9. Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
  10. Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
  11. Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
  12. Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
  13. Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
  14. Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
  15. Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
  16. Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
  17. Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
  18. Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
  19. Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
  20. Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331(2016).
  21. Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
  22. Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
  23. Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
  24. Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
  25. Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
  26. Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
  27. Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
  28. Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702(2013).
  29. Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Microscopie optiqueMicroscopie lectroniqueTechniques histologiquesMicroscopie lectronique transmissionMicroscopie lectronique balayagePr paration d chantillonsSectionnementColorationTechniques d imagerieD pannageOptimisation
Techniques pour étudier l’anatomie du système visuel Ant
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.