Method Article

Division cellulaire chez les mammifères dans des Matrices 3D par microscopie Quantitative réflexion Confocal

DOI:

10.3791/56364

⸱

November 29th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University, 2Johns Hopkins Physical Sciences - Oncology Center, Johns Hopkins University, 3Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 4Departments of Oncology and Pathology and Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole a efficacement étudie la division cellulaire chez les mammifères dans les matrices de collagène 3D en intégrant la synchronisation de la division cellulaire, la surveillance des manifestations de la division dans des matrices 3D à l’aide de la technique d’imagerie de cellules vivantes, microscopie de réflexion confocal résolution temporelle et analyse d’imagerie quantitative.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude de la division cellulaire chez les mammifères comment est réglementée dans une 3D environnement demeure largement inexploré malgré sa pertinence physiologique et sa signification thérapeutique. Les raisons possibles de l’absence d’exploration sont les limitations expérimentales et les défis techniques qui rendent l’étude de la division cellulaire en culture 3D inefficace. Nous décrivons ici une méthode axée sur l’imagerie pour étudier efficacement la division cellulaire chez les mammifères et les interactions cellule-matrice dans des matrices 3D de collagène. Cellules marquées avec la H2B fluorescents sont synchronisées à l’aide de la combinaison du traitement de blocage et la nocodazole thymidine, suivie d’une technique mécanique de shake-off. Cellules synchrones sont ensuite incorporées dans une matrice de collagène 3D. La division cellulaire est contrôlée au moyen de la microscopie de cellules vivantes. La déformation des fibres de collagène pendant et après la division cellulaire, qui est un indicateur de l’interaction cellule-matrice, peut être surveillée et quantifiées à l’aide de la microscopie quantitative réflexion confocale. La méthode fournit une approche efficace et générale pour étudier la division cellulaire chez les mammifères et les interactions cellule-matrice dans un environnement 3D physiologiquement pertinent. Cette approche non seulement fournit de nouveaux aperçus de la base moléculaire du développement des tissus normaux et les maladies, mais permet également à la conception de nouvelles approches diagnostiques et thérapeutiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitose de la cellule est un événement critique dans la vie cellulaire, dont la réglementation joue un rôle crucial dans le développement de tissus et organes. Une mitose anormale est impliquée dans des variations génétiques naturelles, les processus de vieillissement humain et la progression du cancer1,2,3,4,5. L’augmentation du taux de prolifération des cellules tumorales par rapport aux cellules normales est une des caractéristiques du cancer, malgré le fait que les comportements cellulaires sont assez hé....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole fourni respecte les directives de la Homewood institutionnels Review Board (HIRB).

1. stable Expression de H2B-mCherry comme un marqueur de cellule mitose

  1. Génération de Particules Lentivirales rein embryonnaires humaines 293 t (HEK 293 t) cellules
    1. Les cellules HEK 293 t sur un plat de culture cellulaire de 10 cm à la densité de 5 x 106 cellules/plat au milieu de culture cellulaire (de Dulbecco Medium (DMEM) contenant hyperglycémie Modified Eagle (4,5 g/L), pyruvate de sodium, 10 % sérum bovin fœtal (SVF) et 1 % de la plaque pénicilline-streptomycine (Pen/Strep)). Incuber 24 h à 3....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif de cet article est de présenter une méthode axée sur l’imagerie pour étudier les processus de la division cellulaire chez les mammifères dans des matrices 3D et de quantifier les interactions entre la cellule et la matrice extracellulaire 3D pendant et après la division cellulaire. Afin de faciliter l’imagerie de la mitose de la cellule, nous avons incorporé H2B-mCherry dans les cellules MDA-MB-231 à l’aide de transduction des gènes. H2B conjugué avec protéines fluorescentes es.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’étude précédente de la division cellulaire en 3D n’était pas efficace en raison de limitations expérimentales et défis techniques18,19. Les étapes essentielles pour une étude efficace de la division cellulaire chez les mammifères dans les matrices de collagène 3D sont : (1) l’incorporation de marqueurs mitotiques marqués par fluorescence aux cellules ; (2) la synchronisation de la division cellulaire ; et (3) le suivi des événements de la division dans des matr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les NIH accorde R01CA174388 et U54CA143868. Les auteurs aimerait remercier le prix PURA de l’Université Johns Hopkins, pour le soutien de Chen Wei-tong. Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation recherche bourse d’études supérieures au titre de la subvention no 1232825.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rein embryonnaire humain 293TATCC
MDA-MB-231Centre d’oncologie des sciences physiques, NIH
DMEMCorning10-013-CV
DMEM poudreThermoFisher Scientific12100-046
Sérum fœtal bovinHycloneSH30910.03
Pénicilline-Streptomycine 100XSigma-AldrichP0781
Fugene HDPromegaE2311
Lipofectamine 2000Life technologies11668-07
Plasmide codant pour H2B-mCherry dans un vecteur lentiviralPlasmide Addgene21217
ThymidineSigma-AldrichT1895
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Opti-MEMLife Technologies31985-070
Bicarbonate de sodiumGibcoBRL11810-025
HEPESSigma-Aldrich113375-100
CollagèneCorning354236
NaOHJ.T. Bake3722-01
Millex-HV Unité de filtre à seringue, 0.45-&mu ; m, PVDF, 33 mmMilliporeSLHVM33RS
Microscope à épifluorescence Nikon TE2000E Caméra
Cascade 1KRoper Scientific
NIS-Elements Logiciel d’imagerie ARNikon
Nikon A1 Microscope confocalNikonA1
CCD TE2000E

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ly, D. H., Lockhart, D. J., Lerner, R. A., Schultz, P. G. Mitotic misregulation and human aging. Science. 287 (5462), 2486-2492 (2000).
  2. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  3. Brinkley, B. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mammalian Cell Division3D Collagen MatrixConfocal Reflection MicroscopyLive Cell ImagingCell SynchronizationThymidine BlockingNocodazole TreatmentH2B mCherry LabelingMitotic Cell IsolationQuantitative Imaging Analysis

Related Articles