Deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (TXL) pour la myopie

Résumé

Ce protocole décrit les techniques d’évaluation de réticulation chimique de la sclérotique de lapin à l’aide de l’imagerie de la génération de seconde harmonique et calorimétrie différentielle à balayage.

Résumé

Méthodes pour renforcer le tissu en introduisant des liaisons chimiques (réticulation non enzymatique) dans des protéines structurales (collagènes fibrillaires) pour la thérapie incluent la réticulation photochimique et tissus réticulation méthodes (TXL). Ces méthodes pour induire des changements de propriété tissu mécanique sont utilisées pour la cornée en amincissement cornéen (mécaniquement affaibli) troubles comme le kératocône, mais aussi la sclère dans la myopie progressive, où éclaircie et affaiblissement de la partie postérieure sclère se produit et contribue probablement à élongation axiale. Les protéines de la cible principale pour le renforcement de ces tissus sont des collagènes fibrillaires qui constituent la grande majorité des protéines de poids sec dans la cornée et la sclérotique. Fortuitement, collagènes fibrillaires constituent la principale source de deuxième génération harmonique de signaux dans l’espace extracellulaire du tissu. Donc, modifications des protéines de collagène, telles que celles induites par le biais de thérapies, la réticulation pourraient potentiellement être détectées et quantifiées par l’utilisation de la microscopie de génération d’harmoniques deuxième (SHGM). Surveillance SHGM signaux grâce à l’utilisation d’un laser à balayage système de microscopie couplée à une excitation infrarouge lumière source est une méthode d’imagerie moderne excitante qui jouit d’un usage répandu dans les sciences biomédicales. Par conséquent, la présente étude a été entreprise afin d’évaluer l’utilisation de la microscopie SHGM comme un moyen de mesurer a provoqué des effets réticulation dans ex vivo de sclère lapin, après une injection d’un produit chimique, agent de réticulation dans l’espace de la sub-Tenon (sT), un injection l’approche c’est une pratique courante pour causer d’anesthésie oculaire lors de procédures cliniques ophtalmologiques. Le produit chimique, agent de réticulation, hydroxyméthylglycinate de sodium (SMG), provient d’une classe de conservateurs cosmétiques appelée formaldéhyde libérant des agents (FAR). Sclérales changements après réaction avec SMG a entraîné une augmentation dans les signaux de la SHG et en corrélation avec des changements dans la température de dénaturation thermique, une méthode standard pour évaluer induite tissu effets de réticulation.

Introduction

Myopie progressive est postulée pour être traitable par réticulation sclérale non enzymatique (photochimique et/ou chimiques), ce qui est logique étant donné que le blocage enzymatique réticulation de collagène peut augmenter la privation (FD) de forme expérimentale-induite ¹de myopie. Elsheikh et Phillips² a récemment examiné la faisabilité et le potentiel d’utilisation standard irradiation ultraviolets A (UVA)-riboflavine médiée par réticulation photochimique (également connu sous le nom du protocole de Dresde), en abrégé ici comme (riboflavine CXL) pour une stabilisation sclérale postérieure stopper une élongation axi....

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées à l’aide des yeux de lapin provenant de cadavres dans les têtes de lapin non consanguins intact. Tous les institutionnels et National des directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.

1. préparation des Solutions

1. Préparation de SMG pour TXL :
   1. Préparer 1 mL de concentration de 0,2 M de solution (NaHCO₃) de bicarbonate de sodium solution à l’aide de 0,0165 g de NaHCO3 poudre dissous dans 1 mL de l’eau distillée.
   2. Dissoudre 0,1016 mg de hydroxyméthylglycinate de sodium en poudre (SMG) dans 1 mL de l’eau distillée pour obtenir ....

Résultats

Température de dénaturation thermique (Tm) comme une méthode d’essai pour évaluer TXL réticulation effet : Un total de 16 paires d’yeux de lapin ont été utilisées dans ces expériences pour la procédure TXL. Dans une première partie de cette étude, la localisation de réticulation effet induit par une seule injection de l’agent de réticulation SMG via sT espace dans la tête de lapin provenant de cadavres a été évaluée. Ce type d’expérience depuis présentant un intérêt pour .......

Discussion

Expériences ont montré des preuves à l’appui de l’utilisation de la microscopie de signal SHG comme une méthode d’évaluation de collagène réticulation des effets dans la sclérotique, évoquant la possibilité future d’utiliser cette technique comme un outil de suivi pour les traitements de réticulation qui cible les protéines de collagène. À noter, un instrument est déjà en usage clinique pouvant potentiellement capturer ce signal SHG. Bien que cet instrument a été conçu principalement pour l’imagerie derme de la peau, il .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V	EMD Millipore, Massachusetts, USA		Eau désionisée double distillée. - étape du protocole 1.1.1
Hydroxyméthylglycinate de sodium  ;	Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, États-Unis		Réactif de réticulation - étape de protocole 1.1.2
Aiguille d’injection avec seringue luer-lock	BD Eclipse, NJ, USA		Seringue pour injection sous-tenon. - étape de protocole 2.1
Tête	lapin Volaille La Granja	Tête de	lapin surlignée Tête de lapin séparée et livrée dans l’heure post-mortem. - étape de protocole 2.2
Tono-pen  ;	Reichter Technologies Depew, NY		Mesures IOP - étape de protocole 2.4
DSC 6000 Échantillonneur automatique	Perkin-Elmer Waltham, MA, USA		Analyseur de dénaturation thermique - étape de protocole 7.4
Logiciel Pyris  ;	Perkin-Elmer, Waltham, MA, États-Unis	Ver 11.0	; étape de protocole 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Un objectif immergé dans l’eau avec une transmission IR élevée avec une distance de travail de 2,0 mm - étape de protocole 8.1.1.
GenTeal  ;	Alcon, Fort Worth, Texas	B000URVDQ8	Gel à base d’eau utilisé comme milieu d’immersion objectif à la place de l’eau pour éviter l’évaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  ;	Cohérent, Santa Clara, CA, USA		Laser pulsé Ti :Sapphire avec une largeur d’impulsion de 140 fs à 80 MHz et une plage accordable de 680 nm à 1080 nm. - étape de protocole 8.1.11
Chambre de cellule AttoFluor	Thermo Fisher Scientific Inc	A7816	Fixation de la lamelle de protection - étape de protocole 8.1.3
Lamelles rondes de 25 mm, #1.5	Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, États-Unis	GG-25-1.5	étape de protocole 8.1.3
Eclipse Ti-E	Nikon Instruments, Melville, NY, États-Unis		étape de protocole 8.1.4.
Détecteur GaAsP non désannoté (NDD)	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Équipé d’un filtre passe-bande 400-450 nm - étape de protocole 8.1.7
Système de balayage laser A1R-MP	Nikon Instruments, Melville, NY, USA		Compatible avec l’excitation multiphotonique infrarouge (IR). - étape de protocole 8.1.8
Logiciel NIS Elements	Nikon Instruments, Melville, NY, USA	Ver 4.3	désigné comme « logiciel » dans le texte - étape de protocole 8.1.9
Fidji/ImageJ	Institut national de la santé		; étape de protocole 9.1.2
NeuronJ	Eric Meijering, Centre médical de l’Université Erasmus, Rotterdam, Pays-Bas		https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, pour l’étape de protocole 9.2.2
Microsoft Excel  ;	Microsoft Corporation, Redmond, WA, États-Unis	Ver 14	étape de protocole 9.2.8

de