Article de méthode

Deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (TXL) pour la myopie

DOI :

10.3791/56385

⸱

6 janvier 2018

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit les techniques d’évaluation de réticulation chimique de la sclérotique de lapin à l’aide de l’imagerie de la génération de seconde harmonique et calorimétrie différentielle à balayage.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Méthodes pour renforcer le tissu en introduisant des liaisons chimiques (réticulation non enzymatique) dans des protéines structurales (collagènes fibrillaires) pour la thérapie incluent la réticulation photochimique et tissus réticulation méthodes (TXL). Ces méthodes pour induire des changements de propriété tissu mécanique sont utilisées pour la cornée en amincissement cornéen (mécaniquement affaibli) troubles comme le kératocône, mais aussi la sclère dans la myopie progressive, où éclaircie et affaiblissement de la partie postérieure sclère se produit et contribue probablement à élongation axiale. Les protéines de la cible principale pour le renforcement de ces tissus sont des collagènes fibrillaires qui constituent la grande majorité des protéines de poids sec dans la cornée et la sclérotique. Fortuitement, collagènes fibrillaires constituent la principale source de deuxième génération harmonique de signaux dans l’espace extracellulaire du tissu. Donc, modifications des protéines de collagène, telles que celles induites par le biais de thérapies, la réticulation pourraient potentiellement être détectées et quantifiées par l’utilisation de la microscopie de génération d’harmoniques deuxième (SHGM). Surveillance SHGM signaux grâce à l’utilisation d’un laser à balayage système de microscopie couplée à une excitation infrarouge lumière source est une méthode d’imagerie moderne excitante qui jouit d’un usage répandu dans les sciences biomédicales. Par conséquent, la présente étude a été entreprise afin d’évaluer l’utilisation de la microscopie SHGM comme un moyen de mesurer a provoqué des effets réticulation dans ex vivo de sclère lapin, après une injection d’un produit chimique, agent de réticulation dans l’espace de la sub-Tenon (sT), un injection l’approche c’est une pratique courante pour causer d’anesthésie oculaire lors de procédures cliniques ophtalmologiques. Le produit chimique, agent de réticulation, hydroxyméthylglycinate de sodium (SMG), provient d’une classe de conservateurs cosmétiques appelée formaldéhyde libérant des agents (FAR). Sclérales changements après réaction avec SMG a entraîné une augmentation dans les signaux de la SHG et en corrélation avec des changements dans la température de dénaturation thermique, une méthode standard pour évaluer induite tissu effets de réticulation.

Introduction

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Myopie progressive est postulée pour être traitable par réticulation sclérale non enzymatique (photochimique et/ou chimiques), ce qui est logique étant donné que le blocage enzymatique réticulation de collagène peut augmenter la privation (FD) de forme expérimentale-induite 1de myopie. Elsheikh et Phillips2 a récemment examiné la faisabilité et le potentiel d’utilisation standard irradiation ultraviolets A (UVA)-riboflavine médiée par réticulation photochimique (également connu sous le nom du protocole de Dresde), en abrégé ici comme (riboflavine CXL) pour une stabilisation sclérale postérieure stopper une élongation axiale dans la myopie. Cette méthode photochimique a été utilisée avec succès pour traiter la déstabilisation de la surface antérieure de globe (c.-à-d., la cornée bombée) vue dans keratectasia kératocône et post-LASIK. Cependant, application du présent protocole CXL pour la sclère est entravée par questions liées aux difficultés d’accès à la sclère postérieure avec une source de lumière ultraviolette (UV), ainsi que la nécessité de modifier une beaucoup plus grande tissu surface. Qu’étant dit, l’approche CXL a été utilisé pour stopper l’élongation axiale sous forme visuellement privé lapins (par tarsorrhaphy), bien que plusieurs régions de la sclère postérieure tenu plusieurs zones distinctes de l’irradiation dans cette étude3. En revanche, l’injection d’un agent stabilisant chimique (p. ex., agent de réticulation) par l’intermédiaire de l’espace sT pourrait représenter un moyen plus simple de modifier la sclère postérieure, évitant la nécessité d’introduire une source de lumière UV. Cette technique d’injection est bien connue comme un moyen utile d’induire une anesthésie oculaire durant les interventions ophtalmologiques tels que cataracte chirurgie4,5,6. Wollensak7 a décrit précédemment l’utilisation d’une injection de sT à l’aide de glycéraldéhyde (un réticulation agent chimique semblable au concept de la formaldéhyde libérant des agents (FARs) décrites dans la présente étude) pour raidir le lapin sclérotique et la genipin a été montré pour limiter la longueur axiale en FD cobayes8,9. Ces chercheurs ont démontré un net avantage de l’utilisation d’un agent chimique soluble sur la technique CXL photochimique. Ainsi, sclérale réticulation à l’aide d’un agent chimique injectable d’un certain type, y compris le FARs (c.-à-d., TXL)10, pourrait fournir une méthode de traitement possible pour stopper la progression de l’élongation sclérale vue dans la myopie.

Dans les protocoles présentés ici, nous utilisons la solution réticulation chimique de sodium hydroxyméthylglycinate (SMG), administrée par injection de sT à la sclérotique des yeux de lapin provenant de cadavres. Nous avons mis en place des protocoles similaires précédemment pour la réticulation chimique topique dans la cornée. Notamment dans les études rapportées antérieurement, dépendante de réticulation des effets de la concentration pourrait être obtenue en utilisant des SMG, avec une gamme d’effet couvrant bien supérieure à celle possible avec des procédés photochimique CXL tel que déterminé par l’analyse de la dénaturation thermique11 .

Nous décrivons ici les protocoles visant à évaluer l’effet de réticulation de SMG envoyée via des injections de sT au tissu scléral, dénaturation thermique à l’aide de la calorimétrie à balayage différentielle (DSC) et deuxième de microscopie du génération harmonique (SHGM).

À l’aide d’analyse calorimétrique différentielle (DSC), également connu sous le nom de l’analyse thermique, une transition de dénaturation thermique est mesurée, qui pour tissu scléral est principalement guidé par les propriétés des collagènes fibrillaires, car ils constituent la majorité de vrac de la protéine. Cette méthode évalue la stabilité de la structure moléculaire de collagène et des liaisons réticulés qui stabilisent les fibrilles de collagène, la structure de la principale protéine tertiaire. Durant le chauffage dans le DSC, une température de transition critique est atteint qui entraîne la dénaturation de la molécule de collagène, entraînant dans le déroulement de la triple hélice, un processus qui se forme à ce qui est communément appelé gélatine. Cette dénaturation thermique perturbe les liaisons hydrogène le long de la molécule de collagène et peut être déplacée à des températures plus élevées par le biais de méthodes de réticulation induit12,13. Cette méthode a été utilisée pendant de nombreuses décennies, particulièrement dans l’industrie des biomatériaux et des processus qui incluent la fabrication de cuir. Toutefois, cette méthode nécessite l’extraction du tissu sclérotique et ne peut donc être utile comme technique d’ex vivo .

Microscopie (SHGM) de la génération de seconde harmonique est basée sur les propriétés optiques non linéaires des matériaux particuliers, avec des environnements moléculaires non-centrosymétriques. Dans ces matières, lumière intense, par exemple lumière produit par laser, génère des signaux SHG, dans laquelle la lumière incidente est doublée en fréquence. Matières biologiques qui sont connus pour créer des signaux SHG sont le collagène, microtubules et myosine du muscle. Par exemple, le collagène excités par une lumière infrarouge de longueur d’onde de 860 nm émet un signal SHG dans le domaine du visible avec la longueur d’onde de 430 nm. Génération de seconde harmonique (SHG) signal imagerie est une méthode prometteuse pour l’évaluation de réticulation du collagène thérapeutique. On sait depuis plus de 30 ans que les fibrilles de collagène dans les tissus émettent SHG signaux14. Cependant, seulement récemment des images haute résolution pu15 dans une variété de tissus, y compris le tendon16, peau, cartilage,17,18de vaisseaux sanguins et collagène gels19.

Basé sur cette connaissance, cette étude évalue les changements de signal SHG induits dans la sclérotique par SMG induite chimiquement la réticulation du collagène. Les résultats indiquent que la modification de SMG de la sclère augmente les signaux SHG produites à partir de faisceaux de fibres de collagène des tissus (la plus haut ordre structure quaternaire composée de fibrilles de collagène) et produit également un changement structurel morphologique dans le collagène réseau de fibres optiques, reflété dans la fibre bundle « redressement. »

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Protocole

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Toutes les procédures ont été effectuées à l’aide des yeux de lapin provenant de cadavres dans les têtes de lapin non consanguins intact. Tous les institutionnels et National des directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.

1. préparation des Solutions

  1. Préparation de SMG pour TXL :
    1. Préparer 1 mL de concentration de 0,2 M de solution (NaHCO3) de bicarbonate de sodium solution à l’aide de 0,0165 g de NaHCO3 poudre dissous dans 1 mL de l’eau distillée.
    2. Dissoudre 0,1016 mg de hydroxyméthylglycinate de sodium en poudre (SMG) dans 1 mL de l’eau distillée pour obtenir une concentration finale de 800 mM SMG. Ajuster la solution de bicarbonate de sodium à une concentration finale de 0,1 M NaHCO3 et 400 mM SMG. Concentration de SMG selon la réticulation effet désiré. Dans le protocole décrit ici, nous avons utilisé 40, 100 et 400 mM SMG.

2. Injection de subTenon pour TXL utilisant SMG

  1. Remplir deux seringues à insuline 1 mL (aiguilles 25G) de 400 µL contrôle et solution SMG, respectivement.
  2. Placez la tête du lapin dans un plan de profil à l’aide d’un coussin. Mousse de polystyrène ou une pile de papier peut servir à fixer la tête dans une position optimale.
  3. Rétraction des paupières avec un spéculum oeil pédiatrique.
  4. Mesurer la première pression intraoculaire (PIO) à l’aide d’un dispositif de tonométrie d’aplanation.
  5. Marquer l’endroit de l’injection prévue sur la partie médiane supérieure de la limbe avec un marqueur de tissus.
  6. Rétracter la conjonctive entourant le site d’injection avec une pince conjonctivale (ou n’importe quel pince bout rond dentelé) et insérer l’aiguille à travers la conjonctive, entrant dans la capsule de Tenon à peine au-delà du site limbique marqué (c'est-à-dire, 2-3 mm de la limbe). Une petite incision dans la conjonctive peut aussi faire avec des ciseaux iris afin de faciliter le passage de l’aiguille dans la capsule de Tenon.
  7. Une fois au sein de la capsule de Tenon, s’assurer que l’aiguille est librement mobile en le déplaçant à côté. Pendant ce temps, le monde ne doit pas bouger. Cela confirme le positionnement correct de l’aiguille au-dessus de la sclère en de sub-Tenon (sT) espace.
  8. Injecter la solution de la seringue et jeter l’aiguille. Immédiatement après l’injection, le liquide s’accumule dans l’espace de sT créant un renflement antérieur vu à travers la conjonctive (c.-à-d., chémosis).
  9. Recommencez la mesure de la PIO afin de confirmer qu’il n’a pas changé en raison d’une perforation accidentelle de la planète.
  10. Retirer le spéculum de couvercle et effectuer un massage digital à travers les paupières fermées pendant environ 2-3 min.
  11. Laissez la tête pendant une période d’incubation de 3,5 h (température ambiante = 18 ° C), avant de passer à l’étape suivante.

3. préparation du tissu

  1. Rétraction des paupières à l’aide du spéculum paupière afin d’optimiser l’accès au monde entier. Sélectionnez le spéculum de façon optimale de taille selon la taille de le œil.
  2. Séparer la conjonctive entourant le limbe. Si elle a déjà été l’objet d’une incision près du site d’injection, sur sa circonférence élargir les frontières alors il contiendrait une taille de l’inoculum de 1 x 1 cm environ.
  3. Couper les muscles extra oculaires à leurs sites d’insertion sclérale.
  4. Élever le globe oculaire avec une pince, en le poussant du côté postérieur. Cela permet d’accéder au globe postérieur et facilitera la découpe du nerf optique avec l’artère ophtalmique et veine située près du pôle postérieur du globe.
  5. Découper le corneoscleral complexe, avec la bordure extérieure, y compris la point marqué d’injection. La tache doit être toujours visible sur la partie restante de la sclère.
  6. Retirez le corpus vitreus et toutes les couches, attachés à la face interne de la sclère en appliquant la traction avec une pince de tissu.
    Remarque : D’autres mesures dépendent les procédures suivantes sont effectuées : 4. - analyse de la DSC, 5. - microscopie SHG.

4. pour l’analyse régionale de DSC

  1. Pour les yeux traité : découpée dans quatre secteurs de décentrer la coupe sclérale restante avec les ciseaux afin que le site de l’injection est situé dans le secteur supérieur et aligné au centre. Couper les 3 autres secteurs latéraux (c.-à-d., nasale et temporelle), et le fond.
    NOTE : la numérotation des secteurs (1-4) qui sont encore divisés en carrés (1-16) est illustrée dans la Figure 1 a.
  2. Couper les secteurs sclérales (1-4) en petits carrés (1-16) d’environ 4 x 4 mm. Secteur 1 devrait être divisé en 9 carrés (faire le point exact d’injection une individuelle place [2]). Diviser les secteurs 2 et 3 en 2 carrés de chaque (carrés 10-11 et 12-13) et 4 en 3 carrés (14-16 places).
  3. Attribuer un numéro à chaque carré, tel qu’illustré à la Figure 1 a, afin de localiser la distance du tissu analysé depuis l’emplacement de la zone injectée.
  4. Pour les yeux de contrôle : après divisant le tissu en quatre secteurs sclérales (semblables à du tissu traité) découpe morceaux carrés de tissus aux endroits suivants : 3 places depuis le haut de la page (secteur 1), 1 de chaque côté (secteurs 2 et 3) et 1 de la bas (secteur 4).
  5. Gratter les couches rétiniennes et choroïdienne restants et laver deux fois avec du PBS frais chaque fois, laissant les pièces immergées dans la solution pendant environ 10 s à la fois.

5. pour l’imagerie de la SHG

  1. Couper la partie supérieure de la sclérotique à l’aide de ciseaux pour créer une zone de 1 x 1 cm avec le point d’injection, alignée au centre.
  2. Gratter les couches restantes de la rétiniens et la choroïdes et laver deux fois avec du PBS frais chaque fois laisser les morceaux dans la solution pendant environ 10 s.
  3. Placez le tissu en tubes de 1 mL remplis de solution de PBS pour le transport jusqu'à l’établissement d’imagerie. Toutes les procédures, suivant le temps d’incubation et commençant par la dissection du globe oculaire doivent être effectuées moins d’une heure.

6. Protocole de microscopie

Remarque : Ce protocole d’imagerie éparpillés à l’arrière du signal du SHG du collagène du tissu sclérotique est adapté pour le laser, microscope à balayage.

  1. Mettre en place la microscopie
    1. Afin de maximiser le signal et la résolution lorsque effectuant la microscopie SHG utilisez une lentille d’objectif optimisent pour la transmission infrarouge lumière et avec une grande ouverture numérique (NA). Notre objectif est de Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 de l’eau d’immersion.
    2. Ajustez le collier de correction de l’objectif pour correspondre à la profondeur de l’échantillon, dans ce cas c’est l’épaisseur de la lamelle, 0,17 millimètres.
    3. Monter l’objectif 25 x et ajouter une quantité généreuse de gel à base d’eau pour couvrir la surface d’imagerie avant de monter l’échantillon lubrifiant. Le gel à base d’eau ne s’évapore pas pendant l’expérience et par conséquent maintiendra une qualité d’image.
    4. Placez le tissu scléral d’un tube de 1 mL avec du PBS sans sécher entre deux lamelles de rond de 25 mm (épiscléral vers le bas) fournissant maximale un contact entre l’episclera et la surface de la lamelle couvre-objet.
      NOTE : Le tissu peut également être placé découvert sur la lamelle couvre-objet. Une bonne quantité de PBS devrait garder le tissu hydraté pendant la formation image. Dans ce cas, ajouter le morceau de tissu et les PBS après avoir assemblé la cellchamber.
    5. Assembler la chambre de la cellule, en plaçant une lamelle ronde 25 mm, seule ou dans une technique de "sandwich", sur la partie inférieure de la chambre et vissez la partie supérieure afin de créer un scellé autour de chambre. Ne vissez pas vers le bas fermement quand une lamelle supérieure est utilisée, afin d’éviter l’aplatissement artificiellement et endommager les tissus.
    6. Monter la chambre de cellule avec l’échantillon de tissu sur la platine du microscope.
    7. Sur la valeur du microscope pour vue avec lumière transmise.
    8. Positionnez la platine et régler la hauteur de l’objectif tel que la surface inférieure de l’échantillon est au point, tel que déterminé par l’inspection sur pied lumineux à travers l’oculaire.
    9. Éteindre toutes les lumières sauf l’écran d’ordinateur et bloquer autant de lumière du moniteur que possible avec des feuilles de papier aluminium drapés sur la platine du microscope. Minimiser toute lumière parasite atteignant les détecteurs assurera acquisition faible bruit, comme les détecteurs GaAsP NDD ont une sensibilité élevée.
    10. Dans le panneau de garniture de Ti du logiciel, vérifiez que la définition de la lentille est correcte.
    11. Dans le panneau A1 GUI Compact, choisissez le laser IR pour l’imagerie, sélectionnez les détecteurs de NDD et choisissez le canal DAPI qui est équipé d’un filtre passe-bande de 400 à 450 nm.
    12. Dans le panneau de A1 MP GUI, définissez la longueur d’onde du laser infrarouge à 860 nm et ouvrir l’obturateur.
    13. Définir comme suit les conditions dans le panneau A1 GUI Compact à balayage laser. Sélectionnez : b Galvano scanner, numérisation (b) unidirectionnel, (c) Pixel dwell time 6.2 µs, d cadre taille 1 024 x 1 024 pixels, ligne e, avec une moyenne de 2 x
      NOTE : Galvano scanneur et un balayage unidirectionnel garantit un alignement précis point par point. Une taille de 1 024 x 1 024 pour la totalité du champ de vision se traduit par une taille de pixel de 0,5 μm /pixel. Ligne moyenne permettra de réduire le bruit de grenaille dans l’image.
    14. Conditions d’imagerie réglées dans panneau A1 GUI Compact en ajustant la puissance du laser et détecteur de gain. Ouvrez le panneau de Look Up Table (LUT) qui affiche un histogramme des valeurs d’intensité de pixel de l’image actuelle. Tourner sur l’imagerie live en mode « Rechercher » et maximiser la plage détectée des valeurs de pixel en ajustant gain de puissance et détecteur laser. Éviter la saturation. Valeurs typiques sont la puissance de laser de 2,5 %, passant de 2,35 W à 860 nm et 100 HV (gain de détecteur).
    15. Remarque : Pour cette configuration, la puissance de laser mesurée avec un wattmètre interne est 5,2 mW. Chaque fois qu’une expérience est menée, ré-ajuster le pourcentage de laser telle que la mesure de la puissance interne est constante à 5,2 mW entre séances d’imagerie. Être prudent lors du réglage de puissance du laser. Le laser Chameleon II est un laser de 3 W à 800 nm et un 10 % ou une puissance plus élevée pourrait potentiellement induire des lésions tissulaires.
  2. Acquisition d’images
    1. En mode aperçu, scannez la zone de tissu à l’aide de l’outil aperçu de XYZ.
    2. La valeur de l’imagerie à basse résolution (256 x 256 pixels et aucune ligne en moyenne) afin d’accélérer l’acquisition d’images dans ce mode.
    3. Capture de 5 x 5, 3 x 3 ou champs de vue unique pour couvrir toute la surface du tissu. À chaque endroit, avant la prise de vue d’ensemble, activer le mode « Scan » direct et mettre le tissu au point. Notez que les différentes régions du tissu aura des positions légèrement différentes dans le sens axial.
    4. Trouver un endroit plat où les fibres de collagène sont visibles dans le champ de vision complet et double-cliquez sur ce poste dans l’outil d’aperçu pour déplacer l’étape vers cet emplacement particulier.
    5. Activer mode « Scan » live, ajuster la position Z de l’objectif tel que le plan inférieur est mise au point et, dans le pavé de la Ti, utilisez le lecteur Z pour déplacer le plan optique 10 à 15 μm au-dessus de cette couche de fond.
    6. Acquérir une image à haute résolution de 1 024 x 1 024 pixels et 2 x ligne moyenne, en utilisant le bouton « Capture ».
    7. L’emplacement d’enregistrement dans la vue d’ensemble de XYZ en utilisant le bouton « + ». Cela garantit que la même zone du tissu n’est pas reprise.
    8. Pour chaque morceau de tissu capturer 10 images de non-cumul champs de vision.

7. Protocole de DSC

Remarque : Passez à cette étape, dès la préparation du tissu est terminée, pour l’analyse régionale de DSC, ou après tissue imaging lorsque SHGM est effectuée.

  1. Préparer les casseroles de DSC, pesé et étiqueté.
    Remarque : Cette étape devrait être faite avant la dissection des tissus afin de minimiser la dessiccation des tissus.
  2. Sécher chaque carré sclérale avec un tissu absorbant et posez-le à plat sur le fond d’un moule de DSC à l’aide de la pince crantée.
  3. Peser le moule avec le tissu à l’intérieur et le couvercle serti et couverts pour obtenir les tissus poids humide (masse des échantillons doit être de l’ordre de 5 à 11 mg).
    Remarque : Le joint chaque pan à l’aide de la pince avant de passer à l’échantillon de tissu suivant. Les casseroles sont hermétiquement fermés, empêchant toute perte d’eau avant l’analyse thermique.
  4. Une fois que l’échantillon est serti, placez-le sur l’emplacement désigné sur le plateau de DSC. Il devrait y avoir 6 échantillons pour le contrôle et 16 pour les yeux traité.
  5. Créez une méthode à l’aide d’instrument de gestion des logiciels, en précisant le poids du tissu, et exécutez l’analyse thermique en utilisant les paramètres suivants : température ambiante de 40 à 80 ° C, vitesse de chauffage : 1 ° C/min, le flux thermique : 17,37 mW, débit de gaz (N2) : 19,8 mL/min, Pression gaz : 2,2 bar.
  6. Une fois terminé, analyser les données pour chaque échantillon en extrayant le pic de température de transition à laquelle dénaturation thermique se produit à l’aide de l’instrument de gestion des logiciels.

8. image Analysis

  1. Signal SHG
    1. Sélectionnez au moins 5-10 des images plus représentatives de chaque traitement et son contrôle, tels que la zone de l’image occupe principalement des fibres de collagène.
    2. Télécharger chaque image dans le logiciel ImageJ et mesurer l’intensité moyenne de pixel en sélectionnant Analyze > mesure pour l’image active.
    3. Les valeurs extraites sont signalés comme l’intensité moyenne des pixels et peut également être indiquées en traçant l’histogramme des intensités en sélectionnant dans le menu Analyze > histogramme.
    4. À l’aide d’une feuille Excel, créer une table pour documenter toutes les données mesurées en conséquence à l’ID d’échantillon.
    5. Calculer la moyenne et l’écart d’intensité pixel pour chaque condition de traitement et de contrôle.
    6. T-test de l’utilisation de l’étudiant, comparer les différences pour toutes les comparaisons par paires des concentrations (c'est-à-dire40 mM SMG vs 0 et 400 mM SMG vs 0). [P ≤ 0,05].
  2. Ondulation
    1. Sélectionnez une image qui affiche des fibres de collagène. Il faudrait analyser au moins 10 images par échantillon (y compris un échantillon de contrôle pour chaque concentration - au moins 40 au total).
    2. Ouvert ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ nécessite l’installation préalable.
    3. Télécharger imagesby tous les faire glisser dans une fenêtre ouverte de la NeuronJ .
    4. Créer de tracer des lignes le long des fibres, suivant la courbure de la fibrille avec la souris (dessin comprimés pourrait servir), cliquez sur M pour mesurer la distance de la longueur des fibres totales.
    5. Sélectionnez « Option » pour dessiner une ligne droite tangentielle et connecter le début et la fin du contour fibre déjà dessinés. Maintenant cliquez sur M pour mesurer la longueur de bout en bout.
    6. Répétez la même procédure au moins 10 fibrilles par image.
    7. Recueillir ces deux mesures de chacun des 10 fibrilles et entrer les données dans un tableur excel, exprimant la longueur des fibres totales (contour) et longueur de bout à bout (ligne de raccordement tout droit) comme longueur [courbe] et [linéaire], respectivement.
    8. Calculer l’indice d’ondulation (W) selon la formule suivante : W = longueur [courbe] / [linéaire] de longueur.
    9. Calculer le % d’ondulation en comparant les données à partir des images de samples(SMG) traités avec les images provenant d’échantillons de contrôle à l’aide de la formule : (W [SMG] - 1) / (W [commande] - 1)
    10. Effectuer un test t par paires pour index ondulation (W) afin de déterminer les différences statistiques (p-valeurs) de la morphologie de fibre de collagène entre des conditions différentes de traitement et de contrôle.

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Résultats

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Température de dénaturation thermique (Tm) comme une méthode d’essai pour évaluer TXL réticulation effet : Un total de 16 paires d’yeux de lapin ont été utilisées dans ces expériences pour la procédure TXL. Dans une première partie de cette étude, la localisation de réticulation effet induit par une seule injection de l’agent de réticulation SMG via sT espace dans la tête de lapin provenant de cadavres a été évaluée. Ce type d’expérience depuis présentant un intérêt pour ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expériences ont montré des preuves à l’appui de l’utilisation de la microscopie de signal SHG comme une méthode d’évaluation de collagène réticulation des effets dans la sclérotique, évoquant la possibilité future d’utiliser cette technique comme un outil de suivi pour les traitements de réticulation qui cible les protéines de collagène. À noter, un instrument est déjà en usage clinique pouvant potentiellement capturer ce signal SHG. Bien que cet instrument a été conçu principalement pour l’imagerie derme de la peau, il ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Tongalp Tezel, MD, pour consultation publique concernant l’injection de sT ; Theresa Swayne, PhD, pour consultation au sujet de la SHG microscopie ; et Jimmy Duong de la conception et de ressources de biostatistique et de l’installation de base de biostatistiques de l’Institut d’Irving à Columbia University Medical Center.

Prise en charge en partie par la recherche pour prévenir la cécité et par les instituts nationaux de santé subventions RRRNC UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 et NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possède une propriété intellectuelle connexe : US délivré des brevets no : 8 466 203 et aucun : 9 125 856. En attente de brevet international : PCT/US2015/020276.

Des images ont été recueillies dans le Confocal et spécialisé de ressources partagées de microscopie de l’Herbert Irving Comprehensive Cancer Center à l’Université de Columbia, pris en charge par les NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). La microscopie confocale a été achetée avec les NIH accorder #S10 RR025686.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USAEau désionisée double distillée. - étape du protocole 1.1.1
Hydroxyméthylglycinate de sodium  ;Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, États-UnisRéactif de réticulation - étape de protocole 1.1.2
Aiguille d’injection avec seringue luer-lockBD Eclipse, NJ, USASeringue pour injection sous-tenon. - étape de protocole 2.1
Têtelapin Volaille La GranjaTête delapin surlignée Tête de lapin séparée et livrée dans l’heure post-mortem. - étape de protocole 2.2
Tono-pen  ;Reichter Technologies Depew, NYMesures IOP - étape de protocole 2.4
DSC 6000 Échantillonneur automatiquePerkin-Elmer Waltham, MA, USAAnalyseur de dénaturation thermique - étape de protocole 7.4
Logiciel Pyris  ;Perkin-Elmer, Waltham, MA, États-UnisVer 11.0  ; étape de protocole 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAUn objectif immergé dans l’eau avec une transmission IR élevée avec une distance de travail de 2,0 mm - étape de protocole 8.1.1.
GenTeal  ;Alcon, Fort Worth, TexasB000URVDQ8Gel à base d’eau utilisé comme milieu d’immersion objectif à la place de l’eau pour éviter l’évaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  ;Cohérent, Santa Clara, CA, USALaser pulsé Ti :Sapphire avec une largeur d’impulsion de 140 fs à 80 MHz et une plage accordable de 680 nm à 1080 nm. - étape de protocole 8.1.11
Chambre de cellule AttoFluorThermo Fisher Scientific IncA7816Fixation de la lamelle de protection - étape de protocole 8.1.3
Lamelles rondes de 25 mm, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, États-UnisGG-25-1.5étape de protocole 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, États-Unisétape de protocole 8.1.4.
Détecteur GaAsP non désannoté (NDD)Nikon Instruments, Melville, NY, USAÉquipé d’un filtre passe-bande 400-450 nm - étape de protocole 8.1.7
Système de balayage laser A1R-MPNikon Instruments, Melville, NY, USACompatible avec l’excitation multiphotonique infrarouge (IR). - étape de protocole 8.1.8
Logiciel NIS ElementsNikon Instruments, Melville, NY, USAVer 4.3désigné comme « logiciel » dans le texte - étape de protocole 8.1.9
Fidji/ImageJInstitut national de la santé  ; étape de protocole 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Centre médical de l’Université Erasmus, Rotterdam, Pays-Bashttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, pour l’étape de protocole 9.2.2
Microsoft Excel  ;Microsoft Corporation, Redmond, WA, États-UnisVer 14étape de protocole 9.2.8
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