Article de méthode

Traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage Hydrogel pour In Vitro et In Vivo des Applications

DOI :

10.3791/56419

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4 décembre 2017

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1Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), 4Deutsches Herzzentrum Berlin (DHZB), 5Department of Cardiovascular Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la DÉCELLULARISATION complete du myocarde humaine tout en préservant ses constituants de la matrice extracellulaire. Traitement ultérieur des résultats dans la production de microparticules et un hydrogel auto-assemblage cytoprotecteurs matrice extracellulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Préparations de la matrice extracellulaire acellulaire sont utiles pour étudier les interactions cellule-matrice et facilitent les demandes de thérapie régénératrice des cellules. Plusieurs produits commerciaux de la matrice extracellulaire sont disponibles comme les hydrogels ou membranes, mais ceux-ci ne possèdent pas d’activité biologique spécifique des tissus. Car DÉCELLULARISATION de perfusion n’est habituellement pas possible avec les tissus du coeur humain, nous avons développé un procédé de DÉCELLULARISATION d’immersion 3 étapes. Humaines tranches myocardiques achetés au cours de la chirurgie sont d’abord traitées avec tampon de lyse hyperosmolaire sans tensioactifs, suivie d’une incubation avec l’ionique détergent, dodécyl sulfate de sodium, et le processus s’achève en exploitant l’activité DNase intrinsèque des sérum de veau fœtal. Cette technique aboutit à feuilles acellulaire de matrice extracellulaire cardiaque avec en grande partie préservée composition d’architecture et des biopolymères de tissu fibreux, qui apparaissaient pour offrir des repères écologiques spécifiques aux populations de cellules cardiaques et souches pluripotentes cellules. Feuilles de matrice extracellulaire cardiaque peuvent ensuite être encore transformés en une poudre de microparticules sans modification supplémentaire chimique, ou, via la digestion pepsique à court terme, dans un hydrogel auto-assemblage de matrice extracellulaire cardiaque avec conservés bioactivité.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement structurelle soutenir mais est également importante pour la cellule biologique et tissu int1. Dans le coeur, l’ECM participe à la régulation des réponses physiopathologiques comme la fibrose, inflammation, angiogenèse, cardiomyocyte fonction contractile et viabilité et sort de cellules progénitrices résident. En plus de ses principaux composants - glycoprotéines fibreuses, glycosaminoglycanes et protéoglycanes - il contient une foule de facteurs de croissance sécrétés, cytokines et vésicules membraneux contenant des acides nucléiques et protéines2,3.

Récemment, il est devenu clair que les préparations d’ECM acellulaires ne sont pas seulement inestimables pour l’étude des interactions cellule-matrice, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles basés sur les cellules. L’importance d’offrir un environnement adapté aux produits thérapeutiques cellulaires ou tissus ingénieries est maintenant largement reconnu. Ont tenté de combiner des suspensions cellulaires ou des composés actifs avec des hydrogels biopolymères défini4,5,6 ou avec des cocktails de protéines sécrétées par les cellules de sarcome murin (c.-à-d., Matrigel, Geltrex) 7. Toutefois, les anciens ont limité bioactivité, ces derniers sont problématiques dans les processus de qualité GMP, et tous deux n’ont pas la bioactivité spécifique des tissus cardiaques ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

DÉCELLULARISATION du myocarde a précédemment été interprétée par perfusion du cœur tout via le système vasculaire coronaire14,15. Tout cela est possible dans le cœur animal, des cœurs humains intacts sont rarement disponibles. Par conséquent, un processus d’immersion qui permet pour la manipulation des échantillons de tissus obtenus dans la salle d’opération a été favorisé. Notre protocole de « 3-step » contient 3 separate incubation étapes à savoir lyse, solubilisation et l’enlèvement de l’ADN. Il donne humain ECM myocardique avec en grande partie préservé protéine et glycosaminoglycanes composition16,17. Ces tranches de cECM permettent des études in vitro des interactions cellule-matrice, mais sont mal adaptés pour des applications thérapeutiques potentielles de taille humaine. Le procédé de fabrication a été étendu ensuite pour produire des microparticules de cECM lyophilisée ou un hydrogel de cECM18.

Ce protocole permet la DÉCELLULARISATION du myocarde humain obtenu à partir des échantillons chirurgicales, préservant les principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) myocardique et leur activité biologique. Ce protocole est recommandé lorsque l’humain ECM cardiaque avec conserve bioactivité de tissu-spécifique est requis pour l’étude expérimentale des interactions cellule-matrice, ou lorsqu’un environnement adéquat est nécessaire pour des approches basées sur les cellules myocardiques régénération. En principe, il est également possible d’adapter ce protocole se rapportant à des conditions de qualité GMP, afin que l’utilisation de la cECM transformé devrait être faisables applications thérapeutiques à l’avenir.

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Protocole

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Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki et a été approuvé par le Comité de Conseil et de l’éthique d’étude institutionnelle de l’Université de médecine Charité. Tous les patients fournis écrit, un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu cardiaque dans les études expérimentales.

1. préparation du myocarde humain pour le sectionnement

  1. Obtenir le myocarde ventriculaire gauche (la taille varie selon le type de chirurgie) directement à partir de la salle d’opération et le transport en froid PBS dans un récipient stérile.
  2. Enlever tous les tissus adipeux avec un scalpel stérile avec une lame n° 10 dans des conditions stériles.
  3. Couper le myocarde en cubes d’environ 1 x 1 x 1 cm à l’aide d’un scalpel.
  4. Placez les cubes dans des tubes stériles 50 mL.
    Remarque : Pour mettre en pause, effectuez l’étape 1.5, sinon passez à l’étape 2.2. Éviter les cycles de gel-dégel répétés afin d’éviter la dégradation des protéines et une diminution de la qualité du tissu.
  5. Stocker les tubes contenant les cubes à-80 ° C. Le tissu peut être conservé pendant plusieurs mois.

2. séparer les cubes du myocarde en tranches

  1. Prendre les tubes contenant les glaçons préparés sortis du congélateur.
  2. Transport sur glace pour le cryostat.
  3. Régler la température de la salle et l’objet à-15 ° C.
    NOTE : La bonne température est cruciale pour garantir une coupe parfaite.
  4. Tubes de refroidissement vide 50 mL et timbres dans la chambre ou sur la glace sèche.
  5. Ajouter une couche (environ 0,5 - 1,0 mL) du milieu de la cryosection sur le timbre froid et laissez le congeler jusqu'à ce qu’il est blanc et solide.
  6. Ajouter une deuxième couche de médium cryosection et placez un cube de myocarde sur cette couche.
  7. Assurez-vous que le support de cryosection et le myocarde sont complètement gelée avant de continuer.
    Remarque : Lorsque le support de l’échantillon et cryosection ne sont pas gelés le sectionnement sera affectée. Cryosection complètement gelé moyen passe du fluide et transparente au solide, blanc et opaque. Les cubes myocardiques besoin d’au moins 30 min, jusqu'à 1 h pour geler complètement si continuer immédiatement à l’étape 1.4. Lorsque le tissu est gelé il ne devrait pas déformer quand touché/manipulés avec des pincettes.
  8. Insérez le timbre avec myocarde congelé dans le support et serrer toutes les vis.
  9. Couper la surface du tissu jusqu'à l’obtention d’une surface de même section.
  10. Définir l’épaisseur à 300 µm de sectionnement.
  11. Section le myocarde congelé avec sectionnement automatique. Cela garantit des sections coupées uniformes. Environ 30-40 sections peuvent être tranchées d’un cube.
  12. Placez chaque tranche après lamélisation lâchement dans un tube rafraîchies 50 mL.
    Remarque : N’appuyez pas sur les tranches ou les pack étroitement. Environ 40 tranches peuvent s’insérer dans un tube.
  13. Fermer les tubes remplis et la placer sur la glace.
    Remarque : Pour mettre en pause aller sur avec étape 2.14, sinon passez à l’étape 3.2.
  14. Tranches de myocarde magasin à-80 ° C. Les tranches peuvent être stockés pendant plusieurs mois.

3. DÉCELLULARISATION de tranches de myocarde humain

  1. Prenez le nombre nécessaire de tubes de 50 mL contenant des sections de myocarde hors du congélateur-80 ° C et le transport sur la glace.
  2. Transférer les coupes congelées de tous les tubes de 50 mL d’étape 3.1 dans un bécher stérile. Environ 40 tranches sont ajoutés dans le bécher par tube de 50 mL. Le bol doit être trois fois le volume des tubes 50 mL ; par exemple, pour DÉCELLULARISATION d’un tube de 50 mL, utilisez un bécher de 150 mL.
  3. Ajouter 50 mL de solution de lyse (10 mM Tris, 0,1 % p/v EDTA, pH 7,4 en H2O) par le tube de 50 mL avec des tranches de myocarde.
  4. Secouez les tranches du myocarde dans un bécher stérile à 100-150 tr/min en continu pendant 2 h à température ambiante.
  5. Filtrer le liquide avec les tranches de tissus à travers un tamis grossier. Transférer les tranches de tissus avec une pince émoussée dans un bécher stérile de nouveau. Ajouter 50 mL de la SDD de 0,5 % dans du PBS par tube initial de 50 mL de tranches de myocarde (p. ex., utilisation solution 100 mL SDS lorsque deux tubes de 50 mL de sections myocardiques sont étant DECELLULARISE).
  6. Agitez continuellement pendant 6 h à 100-150 tr/min à température ambiante.
  7. Filtrer le liquide avec les tranches de tissus à travers un tamis grossier. Transférer les tranches de tissus avec une pince émoussée dans un bécher stérile nouvel et laver 3 fois avec 50 mL de PBS pendant 10 min chaque et en agitant à 150 tr/min. Ensuite, lavez toute la nuit dans du PBS 1 % pénicilline/streptomycine et 1 % à 100-150 tr/min et 4 ° C en agitant la nystatine (PBS-P/S-N).
    NOTE : Lavage complet est crucial afin d’éliminer complètement toute SDS résiduel. Les traces restantes de la SDD sont toxiques lorsque l’ECM est utilisée en combinaison avec les cellules.
  8. Enlever la solution de lavage et ajouter 25 mL préchauffé FBS (37 ° C) avec 1 % pénicilline/streptomycine et 1 % Nystatin pour les tranches DECELLULARISE par tube initial de 50 mL de tranches de myocarde.
  9. Incuber pendant 3 h à 37 ° C. Dans cette étape, aucun ADN restant est supprimée de la matrice en raison de l’activité DNase intrinsèque de la FBS.
  10. Transférer les tranches dans un bécher stérile nouvel et laver 3 fois avec 50 mL de PBS de 10 min chacun et en agitant à 150 tr/min.
    Remarque : Les tranches de ECM peuvent être stockés dans le PBS-P/S-N à 4 ° C pendant plusieurs jours. Toutefois, il est recommandé de procéder immédiatement.

4. traitement de la cECM Decellularized en poudre

  1. Déposer les tranches de ECM vaguement dans une nouvelle plaque 6 puits stérile. Geler l’ECM à-80 ° C et lyophiliser pour 2 jours dans un lyophilisateur.
    Remarque : plus d’une tranche peut être placée par puits. Disposer les tranches pour recouvrir entièrement la surface du puits. Chevauchant les tranches n’affecte pas la réussite ultérieure de pulvérisation.
  2. Pour la pulvérisation de la tranche de l’ECM, le fraisage spécifiques d’utilisation tubes (voir Table des matières) contenant perles en céramique de 1,4 mm. Remplir les tubes souplement avec lyophilisée ECM à l’aide de pincettes émoussé stérile. Pour des résultats optimaux, un poids total de ECM entre 10-20 mg est recommandé.
    Remarque : Si l’ECM est trop étroitement emballée dans les tubes de fraisage le processus de pulvérisation sera négativement affecté.
  3. Clin d’oeil-gel les tubes dans l’azote liquide.
    Avertissement: l’azote liquide est très basse température, porter une protection personnelle appropriée.
  4. Insérer les tubes congelés dans la fraiseuse et pulvériser l’ECM.
    1. Définir une durée de 30 s et un maximum de vitesse et démarrer l’appareil.
    2. Après avoir terminé, retirez les tubes et nouveau clin d’oeil-congélation dans l’azote liquide.
    3. Répéter cinq fois.
  5. Laver les microparticules des tubes en ajoutant 1 mL FD2O par le tube et agiter ou vortex pour solubilisation complète. Filtrer la solution hétérogène au travers d’une maille de 200 µm dans un tube de 50 mL.
  6. Congeler le tube dans l’azote liquide ou de-80 ° C.
  7. Replacez le couvercle standard du tube avec un filtre de 0,22 µm. Ce couvercle de filtre empêche la poudre ne s’écoule hors du tube, mais permet une circulation d’air pour l’évaporation de l’eau.
  8. Insérer les tubes dans le lyophilisateur et lyophiliser à nouveau pour retirer l’eau de l’étape (étape 4.5)
    Remarque : La lyophilisation à cette étape peut prendre jusqu'à 3 jours.
  9. Stocker la poudre à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure ou continuez au point 5.1.

5. enzyme basé accolés de cECM micro-particules

  1. Dissoudre la pepsine porcine à 0,01 M HCl (pH 2,0) à une concentration de 1 mg/mL. Placer sur un agitateur rotatif à température ambiante jusqu'à ce qu’il soit complètement dissous.
  2. Dissoudre la poudre lyophilisée de l’ECM humaine (étape 4.8) dans la solution de pepsine à une concentration finale de 10 mg/mL. Mélanger soigneusement par le biais de pipetage. Le volume total dépend de la quantité de solution ECM nécessaire. Par exemple, dissoudre 10 mg de poudre de l’ECM dans 1 mL de solution de pepsine.
    NOTE : Dissoudre les particules peut être soutenu par agitation douce (1 000-1 500 tr/min). Restant des grumeaux de microparticules affectera négativement la digestion.
  3. Transvaser la solution dans les tubes de 2 mL avec un volume de 1 mL par tube.
  4. Placer les tubes dans un shaker de tube pendant 48 h à 27 ° C et 1 200 tr/min.
  5. Retirer les tubes de l’agitateur et placer sur glace ou un tube préalablement refroidi.
  6. Mélange 1/9 du volume de la solution ECM de froid 10 x PBS (pH 7,4) avec 1/10 du volume de la solution ECM de froid 0,1 M NaOH dans un tube rafraîchie et la place sur la glace. Ce mélange va neutraliser la solution ECM digérée et inactiver irréversiblement la pepsine.
  7. Ajouter la solution ECM au mélange de neutralisation et mélanger soigneusement grâce à la pipette ou l’agitation.
  8. L’ECM de la valeur de la concentration désirée avec 1 x PBS (pH 7,4). Le pH de la solution peut être vérifié avec papier pH.
    Remarque : Exemple de calcul pour 10 mL digéré solution ECM :
    Ajouter la pepsine porcine 10 mg pour 10 mL de HCl (pH 2,0).
    Ajouter 100 mg ECM poudre pour solution de pepsine.
    Remarque : Exemple de calcul pour la neutralisation des 10 mL digéré solution ECM et en réglant la concentration de 8 mg/mL :
    Le volFinal = ccommencer x VolDémarrer / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL
    Vol10xPBS = VolDémarrer / 9 = 1/9 de PBS 10 x 10 mL = 1,11 mL
    Vol deNaOH = VolDémarrer / 10 = 1/10 de 10 mL = 1 mL
    Vol1xPBS = Vol VolFinal - Volcommencer -10xPBS - VolNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 et 1 mL = 0,39 mL

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Résultats

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Le protocole 3 étapes pour DÉCELLULARISATION du myocarde humain présenté ici résultats dans l’élimination presque complète du matériel cellulaire, tout en préservant les principales composantes de l’ECM et la structure fibrillaire d’ECM. Après DÉCELLULARISATION, le brut prélèvement de cellules du tissu est évident par le changement de couleur (Figure 1 a). L’analyse histologique avec des taches de H & E et Trichrome de Masson a révélé l’absence totale de ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lors de la préparation humaine ECM myocardique, l’objectif est de réaliser ce qui suit : enlèvement du matériel cellulaire immunogène pertinent, préservation de l’intégrité de l’ECM et la bioactivité, stérilité, absence de toxicité du produit fini, compatibilité GMP-process, et qualités du produit pour une application donnée en termes de manipulation. En combinant notre protocole DÉCELLULARISATION 3 étapes avec un traitement ultérieur dans des microparticules ou hydrogel auto-assemblage, matériel d’ECM cardiaque humain q...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki. Les patients fourni un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu à des fins de recherche, et le processus de prélèvement tissulaire a été approuvé par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de la Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BalanceDR Precisa, Dietikon, SuissePrecisa XR 205SM
Lames Nr.10 Skalpell Nr.3InstrumenteNRW, Erftstadt, AllemagneSK-10-004
Plaques de culture cellulaire (6 puits)Greiner, Frickenhausen, Allemagne657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Allemagne3050S
EDTACarl Roth, Karlsruhe, Allemagne8043.3
Tubes à réaction Eppendorf (1,5 ou 2 ml)Greiner, Frickenhausen, Allemagne616201, 623201
Falcon 15ml, 50mlGreiner, Frickenhausen, Allemagne188271, 227270
Sérum de veau fœtal (FBS)Biochrome, Berlin, AllemagneS 0115
Système de lyophilisationLabconco, Kansas City, États-Unis7670520
Congélateur (-80° ; C)Thermo Scientific, Waltham, MA, États-UnisForma 900 Series
HClCarl Roth, Karlsruhe, Allemagne281.1
Lames de microtome Type 819Leica, Wetzlar, Allemagne14035838925
Homogénéisateur MinilysPEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Allemagne91-PCSM
NaOHCarl Roth, Karlsruhe, AllemagneK021.1
NystatinPAN Biotech, Aidenbach, AllemagneP06-07800
PBSThermo Scientific, Waltham, MA, USA14190-094
Pénicilline/streptomycineLife Technologies, Darmstadt, Allemagne15140122
PepsinSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneP6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1,4 mmPeqlab Biotechnolgie, Erlangen, Allemagne91-PCS-CK14
Rotamax 120 Agitateur de plaquesHeidolph, Schwabach, Allemagne544-41200-00
SDSCarl Roth, Karlsruhe, AllemagneCN30.3
StéréomicroscopeLeica, Wetzlar, AllemagneM125
Steriflip-GP, 0,22 µ ; mMerck Millipore, Darmstadt, AllemagneSCGP00525
Stuart mélangeurs analogiques à bascule et à rouleauxSigma-Aldrich, Taufkirchen, AllemagneZ675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compoundHartenstein, Würzburg, AllemagneKit
200µ ; épousaSarstedt, Nü ; mbrecht, Allemagne798.200.500
TRISCarl Roth, Karlsruhe, Allemagne5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mmPoints forts médicaux, Rohrdorf, AllemagneCV102-003
Vortex-Genie2Scientific Industry, New York, États-UnisSI-0256
de transfusion TTEK

Références

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Mots-clés

Cardiac Extracellular MatrixDecellularization ProcessHydrogel FormationTissue ProcessingMicroparticle PreparationPepsin DigestionLyophilization TechniqueCell free ECM SheetsIn Vitro ApplicationsIn Vivo Applications

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